大肠杆菌基于细胞的无细胞蛋白质合成：一种稳健、灵活且易于获取的平台技术的操作方案

本方案简化并阐明了非专业人员实施自复制蛋白质合成的方法。改进后的方法可及性将有助于去中心化该平台及其所支持的广泛应用。该技术的主要优势在于与其它自复制蛋白质合成平台相比，反应体系搭建更快速、更具成本效益且操作简便。

我们的平台可支持多种应用，包括功能基因组学、植物药效测试、生物传感器、教学套件，以及经过少量修改后的代谢工程和遗传密码扩展。尽管该技术仅需基本的实验室培训，但新用户应计划熟悉超声处理等技术，以确保实验方案的顺利实施。开始此实验前，请按照文本方案中所述准备所有培养基和大肠杆菌（E.coli）培养物。

将一个一升的离心瓶放入冰水浴中。当菌液的 OD600 达到 3.0 时，将细胞培养物倒入预冷的离心瓶中。使用双盘天平，向第二个一升离心瓶中加入水，直至其重量与第一个离心瓶相同，以平衡离心机。

将离心机预冷至 4 摄氏度后，在 10 摄氏度下以 5,000 g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。随后，缓慢倾倒并弃去上清液。将细胞沉淀置于冰上。

用无菌刮勺将细胞沉淀从离心瓶中刮出，转移至预冷的 50 毫升锥形管中。加入 30 毫升含 2 毫摩尔 DTT 的预冷 S30 缓冲液，通过短暂涡旋振荡并间歇置于冰上，直至沉淀完全重悬且无团块。随后，使用另一装有水的 50 毫升锥形管作为配平，于 10 摄氏度下以 5,000 g 离心 10 分钟。

倒掉上清液并妥善处理。用 20 至 25 毫升预冷的 S30 缓冲液重悬沉淀。在 10 摄氏度下以 5,000 ×g 离心 10 分钟。

倒出上清液并妥善处理。然后加入 30 毫升 S30 缓冲液，使用涡旋振荡器重悬沉淀，操作方法同前。准备三个预先称重的、冰冷的 50 毫升锥形管。

使用血清学移液管助吸器和无菌移液管，将沉淀悬浮液每管10毫升分装至十个离心管中。将所有离心管置于适当的平衡条件下，在5,000 ×g、10 °C下离心10分钟。随后倾倒并弃去上清液。

用干净的纸巾小心擦拭每个离心管内壁和管盖，以去除多余的缓冲液，注意避免触碰沉淀。使用分析天平重新称量各离心管，并记录每个离心管的沉淀最终重量。开始操作时，每1克细胞质量向每个沉淀中加入1毫升含2毫摩尔DTT的预冷S30缓冲液。

使用涡旋振荡器重新悬浮沉淀物，操作方法如前所述。然后将每份重新悬浮的沉淀物各1.4毫升转移至不同的1.5毫升微量离心管中。将其中一管置于烧杯内的冰水浴中，并将超声破碎仪探头置于管内液面下，确保探头不接触管底或管壁。

将试管置于50%的振幅下超声处理45秒，随后静置59秒。在超声间歇期间，务必关闭并倒置试管。超声处理一结束，立即向裂解液中加入4.5微升1摩尔的DTT。

将离心管颠倒数次以混匀，然后置于冰上。重复此过程，对每管重悬的细胞进行超声处理并加入DTT。在4°C条件下以18,000 g离心10分钟。

此后，将每管上清液用移液器转移至新的1.5毫升微量离心管中，保留少量上清液以确保沉淀物不被扰动。将含有上清液的离心管置于摇床培养箱中，在37°C、250 RPM振荡条件下孵育60分钟。此步骤称为跑脱反应（run-off reaction）。

然后，在 4 °C 条件下以 10,000 g 离心样品 10 分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀，将其转移至新管中。将提取物分装成多份 100 µL 的等分试样用于储存。

首先，将溶液A、溶液B、DNA模板、BL21DE3提取物、T7 RNA聚合酶以及一份分子级水在冰上解冻。接着，标记进行无细胞蛋白表达系统（CFPS）反应所需数量的微量离心管。通过移液或涡旋混合各试剂，然后将溶液加入已标记的反应管中，注意不要涡旋细胞提取物，而应通过倒置试管进行混匀。

确保最终反应液充分混匀，并在每根离心管底部合并成一个15微升的液滴。将每个反应体系在37摄氏度下静置孵育4小时，或在30摄氏度下过夜孵育。开始实验时，取一块96孔板，向每个需要用于定量的孔中加入48微升pH 8的0.05摩尔HEPES溶液。

接下来，从培养箱中取出反应管。通过反复吹打混匀每个反应体系，并将每个反应体系中的 2 µL 转移至含有 HEPES 的孔中。通过反复吹打混匀各孔中的溶液。

在所有反应完成加样和混匀后，将酶标板放入荧光计中，使用485纳米的激发波长和510纳米的发射波长测定SFGFP终点荧光值。利用先前生成的标准曲线，根据测得的荧光读数确定折叠良好的超级GFP的浓度。本研究探讨了一种基于超声处理的大肠杆菌提取物制备方法。

细胞沉淀和细胞提取物在负80摄氏度下至少可稳定保存一年。此外，细胞提取物可经历至少五次冻融循环而不会显著降低活性。本方案中的某些步骤可根据需要进行调整，而不会影响系统的整体活性。

最重要的是，细胞可以在 600 纳米处光密度值为 2.7 至 4.0 的范围内收获，而对细胞提取物的生产效率无明显影响。然而，模板 DNA 的质量是导致批次间差异的一个因素，会影响 CFPS 反应的体积产量。这一问题可通过 Midi 或 Maxiprep 方法纯化 DNA，再辅以额外的 DNA 清洁步骤来解决。

反应容器也会影响无细胞蛋白表达（CFPS）反应的体积产率。表面积与体积之比增大时，体积产率更高。为了优化 CFPS 反应的体积产率并减少细胞提取物批次间的差异，应对每一批新制备的提取物进行镁离子滴定。

对于总蛋白浓度为每毫升30毫克的细胞提取物，为最大限度减少试剂消耗并提高体积产率，最佳镁离子浓度和提取物体积分别为10毫摩尔和5微升。通过调整反应规模，使用者可选择从高通量筛选到目标蛋白的大规模表达等多种方法。该技术具有两个关键优势：一是能够更快速地筛选蛋白质产物，二是能够合成难以表达的蛋白质。

例如，具有细胞毒性的蛋白质或需要氧化条件才能发挥功能的蛋白质。与任何实验室操作一样，所有试剂都应谨慎处理。此外，离心机必须始终保持平衡，超声处理时应使用耳部防护装备。