一种用于蛋白质溶解活性的荧光肽裂解检测: 冠状病毒穗蛋白活化的应用
2019年1月9日
我们提出了一个氟原肽裂解检测, 允许快速筛选蛋白酶的蛋白溶解活性肽代表病毒融合肽的裂解部位。这种方法也可以用于蛋白质序列中的任何其他氨基酸母题, 以测试蛋白酶活性。
这种方法可以帮助回答生物化学领域的关键问题，如蛋白质的蛋白质解法修饰，以及抑制剂和蛋白酶和肽的表征。这项技术的主要优点是，它允许快速筛选肽上的蛋白酶蛋白酶活性，代表给定蛋白质的裂解侧。这里的用途是研究激活病毒融合的蛋白酶。
肽设计的第一步是从公共数据库（如NCBI或病毒病原体数据库）获取感兴趣的融合蛋白序列。选择蛋白酶识别站点进行聚变肽，包括该序列的上游和下游两到三个氨基酸。订购肽时，使用荧光共振能量转移或 FRET 对、末终点的 Mca 和 c 终点的 Dnp 修改它。
在测定过程中，Mca 非常兴奋，并发出光能，只要两者彼此靠近，就会被 Dnp 淬火。但是，如果发生裂解，Dnp 将无法淬火，荧光板读取器可以读取这些排放。根据厂家的建议，通过轻轻上下移液，重新暂停肽。
例如，在70%乙醇中重新被重新暂停，最终浓度为1毫摩尔。如果肽不通过移液很好地重新暂停，将含有肽和溶剂的管放在声波浴中，直到完全重新暂停。将肽的100微升等分分分配到光阻尼或耐药管中，以保护肽免受漂白。
将等分储存在零下 20 摄氏度。首先打开板读卡器并等待自检完成。接下来，打开所连接计算机上的操作软件，并确保它与板读卡器连接。
打开温度设置，将其设置为所需的温度，以获得最佳性能的蛋白酶，这是 30 摄氏度，在这种情况下。要设置实验，请单击控制仪器设置，选择动力学，然后选择荧光。输入 330 纳米的激发波长和 390 纳米的发射波长。
取消选择自动截止并选择中等/正常灵敏度。为检测选择一小时的运行时间，每 60 秒选择一次测量。在第一次测量前设置五秒钟的混合时间，在每次测量前设置 3 秒的混合时间。
最后，选择要读取的井。如文本协议所述，为蛋白酶准备适当的测定缓冲液，并在冰上冷却缓冲液。将一个纯黑色聚苯乙烯未处理的平底96孔板放在冰上，下面有一个薄金属板，以支持冷却和稳定性。
必须使用黑板作为检测板，以防止邻近油井的荧光泄漏。每肽，每个检测准备三个技术复制，每个样本的总体积为100微升。将适当数量的测定缓冲液放入检测板的每个井中。
在每个井中加入0.5微升蛋白酶。到六孔，添加0.5微升缓冲液，而不是各自的蛋白酶。其中三个将是盲目的对控制，另外三个将是肽对等控制。
除了盲控外，将五微升肽加入到每井50微摩尔的最终浓度中。在三个盲控井中，每口都加入五微升缓冲液，而不是肽。将板插入荧光板读卡器，然后单击"启动"。
在开始数据分析之前，请保存实验文件。单击导出，然后将文件导出为 txt。将 txt 文件导入电子表格。
首先创建一个图形，根据每个样本每个技术复制的 x 轴上的时间绘制 y 轴上的相对荧光单位。选择图形在线性范围内的数据范围，以及最接近荧光开始增加的数据范围。在第二个图形上绘制所选数据并添加线性趋势线。
在趋势线选项中，选择图表上的显示方程。方程将显示 V 最大值，对应于趋势线的斜率。从三个技术复制中计算每个样本的平均 V 最大值。
再重复两次实验后，为了获得三个生物复制，根据三个独立的生物复制的数据计算标准偏差。人类MERS冠状病毒、EMC/2012 S2原位，以及骆驼衍生的双突变菌株HKU205，以及EMC/2012的单突变变种，显示EMC/2012肽被有效切割，而HU205的S2原肽几乎没有分裂发生。EMC/2012 A-S 变异 S2 原肽的裂解被强烈减少，并且几乎没有 EMC/2012 S 到 I 变异 S2 原肽的裂解。
另一项毛茸茸裂解测定显示，与人类 MERS 冠状病毒 EMC/2012 S2 主要位点相比，骆驼衍生的摩洛哥 213 S2 主要基点仅出现最小的裂解。在原型S1/S2肽、FECV I和4 S1/S2中观察到富林裂解，但在变异的S1/S2肽FIPV I黑色S1/S2中未观察到。同样，毛皮能够切割原型S2原肽，FECV II 1683 S2素，但不是变异的S2原肽，FECV I和4S2素，FIPV I黑色S2素，和FIPV II 1146 S2素。
按照这个程序，西方的印迹分析或氨基荧光测定，使用感兴趣的全长蛋白质进行验证蛋白裂解，或者在这种情况下，如果裂解导致病毒融合蛋白的致生版本。
概览
本文介绍了一种荧光基肽切割检测法，用于快速筛选蛋白酶对病毒融合肽的蛋白水解活性。该方法也可应用于蛋白序列中的其他氨基酸基序，以评估蛋白酶活性。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质组学
- 病毒研究
背景
- 理解蛋白质的蛋白水解修饰在生物化学中至关重要。
- 蛋白酶和抑制剂的表征对于治疗开发至关重要。
- 病毒融合蛋白在病毒进入和感染中起着重要作用。
- 荧光基检测法提供了一种测量蛋白酶活性的敏感方法。
研究目的
- 开发一种快速筛选蛋白水解活性的方法。
- 研究激活病毒融合肽的蛋白酶。
- 提供肽设计和检测执行的协议。
使用的方法
- 基于病毒融合蛋白序列设计肽。
- 使用FRET对荧光探针在切割过程中进行检测。
- 设置荧光板读数仪进行动力学测量。
- 分析数据以确定生物重复的最大速度和标准差。
主要结果
- 观察到furin对EMC/2012肽的有效切割。
- 注意到HKU205 S2 prime肽的最小切割。
- 突变肽显示显著降低的切割活性。
- Western blot分析可以验证蛋白质切割结果。
结论
- 荧光基肽切割检测法可有效用于研究蛋白酶活性。
- 该方法可以帮助理解病毒进入机制。
- 进一步的研究可以利用此检测法开发针对病毒感染的治疗方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, quantitative assessment of proteolytic cleavage at viral fusion protein sites is critical for target validation and mechanistic de-risking in antiviral drug discovery. This fluorogenic peptide cleavage assay enables high-throughput screening of protease-substrate interactions, supporting predictive confidence in early-stage portfolio decisions. Its flexibility accelerates evaluation of viral adaptation and protease inhibitor strategies across diverse viral strains.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protease specificity and substrate recognition for viral fusion proteins.
- Supports functional validation of cleavage site mutations impacting viral entry mechanisms.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying proteolytic activation across viral variants.
- Provides rapid, reproducible data to inform target prioritization and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative readouts for protease activity on engineered peptide substrates.
- Enables scalable, high-throughput screening of protease inhibitors or substrate variants.
- Supports assay reproducibility and platform reuse for multiple protease-substrate combinations.
- Prepares validated systems for downstream compound evaluation and lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cleavage site analysis with disease-relevant viral strains and host adaptation studies.
- Provides continuity from molecular discovery to preclinical validation of antiviral strategies.
- Enables risk-adjusted advancement by linking biochemical cleavage data to functional viral entry outcomes.
- Supports translational biomarker development for protease activity in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
This assay bridges early discovery and lead identification by enabling rapid, quantitative screening of protease activity on viral fusion protein motifs, supporting both target validation and inhibitor profiling.
- Discovery Biology: Quantifies proteolytic activation and substrate specificity for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, kinetic fluorescence readouts for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Outputs Vmax and standard deviation metrics for robust comparison of protease activity across conditions.
- Translational Research: Links biochemical cleavage efficiency to viral adaptation and host range studies when supported by sequence data.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse protease and substrate investigations across viral families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in viral entry studies.
- Operational Value: Streamlines assay setup, standardization, and scalability for cross-project deployment.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient triage of antiviral targets and inhibitors.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated proteolytic activation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peptide design and protease biochemistry for optimal substrate selection.
- Needs access to fluorescence plate readers and compatible analytical software for kinetic measurements.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay conditions and controls for reproducibility.
- May require adaptation of peptide sequences for different viral strains or protease targets.
- Limited to in vitro cleavage analysis; functional validation in full-length proteins or cellular systems may be necessary.
