使用实时细胞外通量分析对Candida albicans进行生物能量学研究

该方案对于测定白色念珠菌的糖酵解功能和线粒体呼吸具有重要意义。该技术的主要优势在于，无需从白色念珠菌中纯化线粒体即可直接测量其线粒体功能。该方法可进一步优化，用于研究基因操作或化学调节剂对白色念珠菌或其他真菌病原体中线粒体和糖酵解通路的影响。

该技术相对简单。或者，根据所用生物体的不同，其使用可能有助于优化检测中的细胞数量和线粒体抑制剂的浓度。在超净工作台中，将聚-D-赖氨酸溶于组织培养用水中，配制成终浓度为 50 微克/毫升的溶液。

充分混匀溶液，并将其分装至1.5毫升微量离心管中，确保每管分装至少1.3毫升。取50微升该混合液加入检测板的每个孔中，盖上盖板，室温孵育1至2小时。然后吸除溶液。

用 500 微升无菌组织培养级水将检测板的孔清洗一次，打开盖子，让孔自然风干。如果制备当天不使用该板，可在 4 摄氏度下保存最多两到三天。实验前一天，打开额外的通量检测试剂盒并取出其中内容物。

将传感器盒倒置放在校准板旁边。向校准板的每个孔中加入一毫升校准液，然后将传感器盒放回。确保含有荧光染料的传感器完全浸没在校准液中。

将传感器盒置于37摄氏度的非二氧化碳培养箱中过夜孵育。在进行检测的前一天，将制备好的白色念珠菌接种至YPD液体培养基中，在30摄氏度、200 rpm的摇床中过夜培养。在检测当天，用检测培养基稀释适量的菌液，使最终浓度为每100微升含100,000个细胞。

除 A1、B4、C3 和 D6 孔外，向检测板的每个孔中加入 100 µL 稀释后的细胞。向这些孔（A1、B4、C3 和 D6）中仅加入 100 µL 检测培养基，用于背景校正。将板置于 37 °C 的无二氧化碳培养箱中孵育 60 分钟，使细胞贴附于板表面。根据文本方案所述，用相应的检测培养基将用于线粒体功能检测的化合物配制成 10 倍浓度。

向A孔中加入50 µL SHAM，向B孔中加入50 µL寡霉素（Oligomycin），向C孔中加入62 µL氰化钾，向D孔中加入68 µL抗霉素A（Antimycin A）。接下来，按照文本方案中的说明，用相应的检测培养基配制糖酵解压力检测所用的化合物，浓度为10倍。向A孔中加入50 µL葡萄糖，向B孔中加入55 µL寡霉素（Oligomycin），向C孔中加入62 µL 2-脱氧葡萄糖（2-DG），向D孔中加入68 µL抗霉素A（Antimycin A）。在检测开始前，打开XF分析仪，使用检测向导选项卡设置检测模板。按照逐步提示操作，并填写设置过程中弹出的所有信息。

生成分组布局，并按照文本方案中所述设置实验步骤。在进行检测前保存这些布局。在检测时，通过在检测向导选项卡的“打开文件”选项中打开相应的文件来恢复已保存的方案。

然后将10X化合物加入含有校准液的水合传感器 cartridge 的相应端口中。将传感器 cartridge 装入外接通量分析仪的载体托盘中。通过点击屏幕上的启动按钮开始校准。

接下来，沿培养板孔壁轻轻加入 350 微升检测培养基，以尽量减少对细胞的扰动，使最终体积达到 450 微升。将含有校准液的工具板替换为检测板，继续进行检测。检测完成后，取出传感器盒和培养板。

将文件保存到相应的目标文件夹中。本研究中，采用细胞外通量分析仪评估白色念珠菌的生物能量功能。同时，为研究线粒体蛋白缺失对氧气消耗速率和细胞外酸化速率的影响，还纳入了缺乏线粒体蛋白Mam33的突变株及其互补菌株。

白色念珠菌野生型的耗氧速率为每分钟145皮摩尔，处于任何细胞外通量测定的最佳范围内。野生型、mam33突变株及mam33回补株的基礎耗氧速率無顯著差異。同樣地，這些菌株之間的基礎細胞外酸化速率也未觀察到顯著差異。

然而，通过使用氰化钾抑制复合体IV，野生型、mam33突变株及mam33回补株均表现出向糖酵解途径的显著转变。然而，mam33突变株未能表现出代偿性的糖酵解转变，提示该菌株中复合体IV依赖性通路存在缺陷。在糖酵解应激试验中，细胞经一小时葡萄糖饥饿处理后，测定其基础耗氧速率和细胞外酸化速率。

在饥饿条件下，mam33 突变菌株的耗氧量和细胞外酸化率显著低于其他菌株。这表明当细胞被迫处于饥饿状态时，其对葡萄糖在呼吸作用和糖酵解中的利用能力受损。在注入葡萄糖后，所有菌株的耗氧率和细胞外酸化率均出现升高。

检测板的包被可使白色念珠菌细胞黏附于板上。白色念珠菌细胞黏附不当会影响检测结果。该技术建立后，已被广泛应用于多种细胞类型和疾病研究，用于探讨线粒体在生理和病理条件下的功能。

例如，在本实验中使用患者来源的细胞和对照细胞，可以解答线粒体功能如何发生改变的具体问题。在制备氰化钾和抗霉素A等线粒体抑制剂时应格外小心，因为这些化合物具有极强的毒性。