Name: 白念珠菌实时细胞外通量实时分析的生物能量学研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解如何使用细胞外通量分析仪实时测定白念珠菌的线粒体呼吸和糖酵解功能，无需纯化线粒体。该方法可优化用于研究遗传操作或化学调节剂对代谢通路的影响。

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NC实验室的研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01AI24499和新泽西健康基金会（NJHF）资助项目#PC40-18支持。

注意：以下详细描述了该检测的逐步操作流程，示意图见图1。
1. C. albicans 菌株及培养条件
<ol>
	<li>在30 °C条件下，于培养摇床中将C. albicans菌株&#160;在液体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中过夜培养。 
	注意：将念珠菌属（Candida）菌株以冷冻保藏形式保存，并在YPD琼脂培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和2%琼脂）上进行培养。</li>
</ol>
2. 试剂的制备
<ol>
	<li>按如下步骤配制检测培养基：
	<ol>
		<li>进行线粒体功能检测时，将1.04 g罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640粉末和2 g葡萄糖（2%）溶解于90 mL无菌水中，并将培养基预热至37 °C。用5 M NaOH调节pH至7.4，再用无菌水定容至100 mL。</li>
		<li>进行糖酵解应激检测时，仅将1.04 g RPMI 1640粉末溶解于90 mL无菌水中，将培养基预热至37 °C，并调节pH至7.4，再用无菌水定容至100 mL。RPMI 1640粉末不含碳酸氢盐，这对于在检测过程中通过pH变化监测糖酵解水平至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射用化合物配制：
	<ol>
		<li>用无菌水配制1 M葡萄糖储备液，于-20 °C保存。</li>
		<li>用二甲基亚砜（DMSO）配制100 mM寡霉素储备液，分装成小份，于-20 °C保存。</li>
		<li>用DMSO配制100 mM抗霉素A储备液，分装成小份，于-20 °C保存。</li>
		<li>在检测当天用乙醇配制100 mM SHAM（水杨羟肟酸）储备液。</li>
		<li>在检测当天用无菌水配制1 M氰化钾（KCN）溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用聚-D-赖氨酸（PDL）包被检测板
注意：所有以下步骤均须在层流罩内进行。
<ol>
	<li>将多聚-L-赖氨酸溶于组织培养级水中，配制成终浓度为 50 µg/mL 的溶液。充分混匀后，分装至 1.5 mL 微量离心管中，长期保存请置于 -20 °C 保存。 
	注意：每孔需要 50 µL，24 孔共需 1.2 mL。因此，建议每管分装至少 1.3 mL。</li>
	<li>每孔加入 50 µL，盖上盖子，在室温下孵育 1–2 小时。</li>
	<li>吸除溶液，并用 500 µL 无菌组织培养级水清洗一次。</li>
	<li>打开盖子，让各孔自然晾干。建议当天使用，或于 4 °C 最多保存 2–3 天。</li>
</ol>
4. 传感器盒的水合
注意：在实验前一天执行此步骤。
<ol>
	<li>打开额外的通量测定试剂盒并取出其中内容物。将传感器 cartridge 倒置放置在工具板旁边（图 2）。</li>
	<li>向工具板的每个孔中加入 1 mL 校准液，并将传感器 cartridge 放回。确保含有荧光染料的传感器（用于检测氧气和 pH）完全浸没在校准液中。</li>
	<li>将传感器 cartridge 在 37 °C、无 CO2 的培养箱中孵育过夜。</li>
</ol>
5. 在PDL包被的培养板中培养和接种细胞
<ol>
	<li>将白色念珠菌（C. albicans）接种于YPD液体培养基中，于30 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。 
	注意：根据实验设计和研究需求，白色念珠菌（C. albicans）也可在YPG或最低培养基中培养。</li>
	<li>在实验当天，用实验培养基将适量的菌液稀释，使最终浓度为每100 µL含100,000个细胞。</li>
	<li>除A1、B4、C3和D6孔外，向实验板的每个孔中加入100 µL稀释后的菌液；上述四个孔仅加入100 µL实验培养基，用于背景校正（图3）。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、无CO2的培养箱中孵育60分钟，以使细胞贴附于培养板表面。</li>
</ol>
6. 检测方案
注意：此处所述方案适用于仪器的24孔板格式。若使用其他规格，需调整体积。
<ol>
	<li>线粒体功能检测
	<ol>
		<li>化合物的配制
		<ol>
			<li>配制线粒体功能检测用10倍浓度的化合物：在相应的检测培养基中配制20 mM SHAM、100 µM 寡霉素（Oligomycin）、100 mM 氰化钾（KCN）和20 µM 抗霉素A（Antimycin A）。</li>
			<li>将50 µL SHAM加入A孔，55 µL 寡霉素加入B孔，62 µL 氰化钾加入C孔，68 µL 抗霉素A加入D孔（图4）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>糖酵解应激检测
	<ol>
		<li>化合物的配制
		<ol>
			<li>配制糖酵解应激检测用10倍浓度的化合物：在相应的检测培养基中配制100 mM 葡萄糖、100 µM 寡霉素、500 mM 2-脱氧葡萄糖（2DG）和20 µM 抗霉素A。</li>
			<li>将50 µL 葡萄糖加入A孔，55 µL 寡霉素加入B孔，62 µL 2-DG加入C孔，68 µL 抗霉素A加入D孔。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Seahorse 细胞能量代谢分析仪（extra flux analyzer），该仪器可在24孔板体系中实时检测活细胞的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。提前设置好检测方案。</li>
	<li>打开 Seahorse 细胞能量代谢分析仪，通过检测向导选项卡（assay wizard tab）设置检测模板，并按照逐步提示填写设置过程中弹出的所有信息。生成的分组布局应与图5所示类似。按照表1设置检测程序。应在检测前充分提前设置好这些布局，并保存至计算机中。检测时，通过检测向导选项卡中的“打开文件”（open file）选项打开相应文件，恢复已保存的检测方案（图5）。</li>
	<li>将10倍浓度的化合物加入已水化并含有校准液的传感器微孔板的相应加样孔中，然后将微孔板放入 Seahorse 细胞能量代谢分析仪的承载托盘中。点击屏幕上的开始按钮启动校准程序。</li>
	<li>沿孔板孔壁轻轻加入350 µL 检测培养基，以尽量减少对细胞的扰动，使最终体积达到450 µL。</li>
	<li>将含有校准液的工具板替换为检测板，继续进行检测。</li>
	<li>检测完成后，取出传感器微孔板和细胞板。将数据文件保存至指定的目标文件夹中。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>在软件中使用曲线下面积-方差分析（AUC-ANOVA）分析标签页，通过选择相应参数（OCR 或 ECAR）来计算各组之间的显著性差异，如图6所示。</li>
	<li>选择需要比较的组别。</li>
	<li>将所选组别添加至方差分析（ANOVA）的分析组中，然后点击确定。 
	注意：该 AUC ANOVA 分析将在文件中添加一个新的工作表，用于计算每组的 AUC 并通过 ANOVA 进行组间比较，结果将生成一个 p 值表格以显示显著性水平。</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li>
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<li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li>
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<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans%3A+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness%2C+cell+wall+integrity%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li>
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<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li>
<li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

生物能量学额外通量检测是一种优秀的工具，可通过实时测量依赖氧化磷酸化（OXPHOS）的耗氧量来评估线粒体功能。此外，在实时分析中还可同时检测以细胞外酸化率（细胞外pH值变化）衡量的糖酵解功能。
在检测板中成功接种C. albicans是该实验的关键步骤之一，因为在经PDL包被的板中孵育细胞可使细胞黏附于检测板上。黏附的C. albicans细胞可通过光学显微镜进行观察。若细胞黏附不当，可能导致细胞漂浮于孔中，从而造成重复样本间读数不一致，影响实验结果。同样，进行细胞数量的滴定作为本实验的第一步也至关重要，以获得100–300 pmol/min范围内的耗氧率（OCR），此为最佳范围。此外，对化合物进行浓度滴定以确定其最佳浓度，对于获得最佳反应同样关键。每当基础培养基成分发生变化时，均应重新进行该步骤。
在哺乳动物细胞的胞外通量分析中，DMEM 是最常用的基礎培養基。然而，根據我們的實驗結果，RPMI 1640 培養基在與白色念珠菌（C. albicans）的實驗中表現出最佳效...

侵袭性真菌感染每年在全球造成超过150万人死亡。由于免疫力低下人群数量增加（包括老年人、早产儿、器官移植受者和癌症患者），这一数字正不断上升1。C. albicans 是一种机会性人类致病真菌，属于人体正常微生物群的一部分，同时作为共生生物定植于黏膜表面和胃肠道。C. albicans 可在免疫缺陷、接受过手术或长期使用抗生素治疗的人群中引发严重的全身性疾病。Candida 属真菌是人类医院获得性感染（NID）最主要的三到四种病原体之一2,3,4,5,6,7。全球每年估计发生约40万例Candida 血流感染，相关病死率高达46–75%1。仅在美国，每年因念珠菌病导致的死亡人数约为1万人。真菌引起的医院感染还导致患者医疗费用急剧上升5。在美国，每年用于治疗侵袭性真菌感染的费用超过20亿美元，给本已超负荷的医疗系统带来巨大压力。目前，标准抗真菌治疗手段因药物毒性、日益普遍的耐药性以及药物间相互作用而受到限制。因此，迫切需要发现新的抗真菌药物靶点，以改善高危患者的治疗选择。然而，由于真菌属于真核生物，针对真菌靶点的新药研发面临挑战，这极大地限制了真菌特异性药物靶点的数量。
近期研究表明，线粒体在真菌致病性及对抗真菌药物的耐受性中发挥关键作用，因为线粒体对细胞呼吸、氧化代谢、信号转导和细胞凋亡至关重要8,9,10,11。糖酵解和非糖酵解代谢对于C. albicans在哺乳动物宿主中的存活均至关重要12,13,14,15,16。此外，已发现多个缺乏线粒体蛋白（如Goa1、Srr1、Gem1、Sam37等）的C. albicans突变株在菌丝形成方面存在缺陷，而菌丝形成是C. albicans的重要毒力因子17,18,19,20,21,22。同时，这些突变株在播散性念珠菌病小鼠模型中也表现出毒力减弱17,18,19,20,21,22。因此，真菌线粒体是药物研发的一个理想靶点。然而，对C. albicans中线粒体功能的研究具有挑战性，因为C. albicans为“petite negative”23，即其无法在缺失线粒体基因组的情况下存活。
本文介绍了一种无需纯化线粒体即可研究白色念珠菌（C. albicans）线粒体和糖酵解功能的实验方案。该方法还可进一步优化，用于研究基因操作或化学调节剂对白色念珠菌（C. albicans）线粒体和糖酵解途径的影响。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>线粒体应激检测试剂盒</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Calbiochem</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Accumet</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Santa cruz</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>SHAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Amresco&amp;nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>J.T Baker</td><td>3722</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>XF检测校准液</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基</td><td>Fisher scientific,</td><td>BP2469</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物蛋白胨甘油培养基</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

使用实时细胞外通量分析对candida albicans进行生物能量学研究

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

线粒体是细胞代谢和存活所必需的细胞器。多种关键生命活动发生在线粒体内，例如细胞呼吸、氧化代谢、信号转导以及细胞凋亡。因此，已有研究报道线粒体功能障碍在致病性真菌对抗真菌药物的耐受性及毒力中发挥重要作用。近期的研究数据也进一步认识到线粒体在真菌致病过程中具有重要贡献。尽管线粒体在真菌生物学中具有重要意义，但目前仍缺乏系统化、标准化的研究其功能的方法。本文介绍一种用于检测白色念珠菌（C. albicans）菌株基础氧消耗率（OCR，反映线粒体呼吸功能）和细胞外酸化率（ECAR，反映糖酵解功能）的实验方法。本方法适用于所有念珠菌属（Candidaspp.）菌株，无需从完整真菌细胞中分离纯化线粒体。此外，该实验方案还可根据需要进行调整，用于筛选针对白色念珠菌（C. albicans）菌株线粒体功能的抑制剂。

本实验方案的重点是测定生物能量学功能 C. albicans 通过外源性通量分析仪检测。A C. albicans 缺失线粒体蛋白Mam33的突变株及其互补菌株也被包括在内， mam33Δ/Δ::MAM33 研究线粒体蛋白缺失对氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）的影响。 MAM33 编码一种推测的线粒体酸性基质蛋白及其在 假丝酵母 尚不明确。
胞外流量测定所需的细胞数量 
在胞外流量测定中，我们每孔使用了 1×105 个 C. albicans 野生型细胞，测得氧耗率（OCR）为 145 pmol/min（图 7），处于任何胞外流量测定最佳范围（100–300 pmol/min）之内。在测定前或不同实验间培养基成分发...

在此，我们提供了一种逐步操作方案，用于研究线粒体呼吸和糖酵解功能 白色念珠菌 使用额外的通量分析仪。

使用实时细胞外通量分析对Candida albicans进行生物能量学研究

线粒体是细胞代谢和存活所必需的细胞器。多种关键事件发生于线粒体中，例如细胞……

该方案对于测定白色念珠菌的糖酵解功能和线粒体呼吸具有重要意义。该技术的主要优势在于，无需从白色念珠菌中纯化线粒体即可直接测量其线粒体功能。该方法可进一步优化，用于研究基因操作或化学调节剂对白色念珠菌或其他真菌病原体中线粒体和糖酵解通路的影响。该技术相对简单。或者，根据所用生物体的不同，其使用可能有助于优化检测中的细胞数量和线粒体抑制剂的浓度。在超净工作台中，将聚-D-赖氨酸溶于组织培养用水中，配制成终浓度为 50 微克/毫升的溶液。充分混匀溶液，并将其分装至1.5毫升微量离心管中，确保每管分装至少1.3毫升。取50微升该混合液加入检测板的每个孔中，盖上盖板，室温孵育1至2小时。然后吸除溶液。用 500 微升无菌组织培养级水将检测板的孔清洗一次，打开盖子，让孔自然风干。如果制备当天不使用该板，可在 4 摄氏度下保存最多两到三天。实验前一天，打开额外的通量检测试剂盒并取出其中内容物。将传感器盒倒置放在校准板旁边。向校准板的每个孔中加入一毫升校准液，然后将传感器盒放回。确保含有荧光染料的传感器完全浸没在校准液中。将传感器盒置于37摄氏度的非二氧化碳培养箱中过夜孵育。在进行检测的前一天，将制备好的白色念珠菌接种至YPD液体培养基中，在30摄氏度、200 rpm的摇床中过夜培养。在检测当天，用检测培养基稀释适量的菌液，使最终浓度为每100微升含100,000个细胞。除 A1、B4、C3 和 D6 孔外，向检测板的每个孔中加入 100 µL 稀释后的细胞。向这些孔（A1、B4、C3 和 D6）中仅加入 100 µL 检测培养基，用于背景校正。将板置于 37 °C 的无二氧化碳培养箱中孵育 60 分钟，使细胞贴附于板表面。根据文本方案所述，用相应的检测培养基将用于线粒体功能检测的化合物配制成 10 倍浓度。向A孔中加入50 µL SHAM，向B孔中加入50 µL寡霉素（Oligomycin），向C孔中加入62 µL氰化钾，向D孔中加入68 µL抗霉素A（Antimycin A）。接下来，按照文本方案中的说明，用相应的检测培养基配制糖酵解压力检测所用的化合物，浓度为10倍。向A孔中加入50 µL葡萄糖，向B孔中加入55 µL寡霉素（Oligomycin），向C孔中加入62 µL 2-脱氧葡萄糖（2-DG），向D孔中加入68 µL抗霉素A（Antimycin A）。在检测开始前，打开XF分析仪，使用检测向导选项卡设置检测模板。按照逐步提示操作，并填写设置过程中弹出的所有信息。生成分组布局，并按照文本方案中所述设置实验步骤。在进行检测前保存这些布局。在检测时，通过在检测向导选项卡的“打开文件”选项中打开相应的文件来恢复已保存的方案。然后将10X化合物加入含有校准液的水合传感器 cartridge 的相应端口中。将传感器 cartridge 装入外接通量分析仪的载体托盘中。通过点击屏幕上的启动按钮开始校准。接下来，沿培养板孔壁轻轻加入 350 微升检测培养基，以尽量减少对细胞的扰动，使最终体积达到 450 微升。将含有校准液的工具板替换为检测板，继续进行检测。检测完成后，取出传感器盒和培养板。将文件保存到相应的目标文件夹中。本研究中，采用细胞外通量分析仪评估白色念珠菌的生物能量功能。同时，为研究线粒体蛋白缺失对氧气消耗速率和细胞外酸化速率的影响，还纳入了缺乏线粒体蛋白Mam33的突变株及其互补菌株。白色念珠菌野生型的耗氧速率为每分钟145皮摩尔，处于任何细胞外通量测定的最佳范围内。野生型、mam33突变株及mam33回补株的基礎耗氧速率無顯著差異。同樣地，這些菌株之間的基礎細胞外酸化速率也未觀察到顯著差異。然而，通过使用氰化钾抑制复合体IV，野生型、mam33突变株及mam33回补株均表现出向糖酵解途径的显著转变。然而，mam33突变株未能表现出代偿性的糖酵解转变，提示该菌株中复合体IV依赖性通路存在缺陷。在糖酵解应激试验中，细胞经一小时葡萄糖饥饿处理后，测定其基础耗氧速率和细胞外酸化速率。在饥饿条件下，mam33 突变菌株的耗氧量和细胞外酸化率显著低于其他菌株。这表明当细胞被迫处于饥饿状态时，其对葡萄糖在呼吸作用和糖酵解中的利用能力受损。在注入葡萄糖后，所有菌株的耗氧率和细胞外酸化率均出现升高。检测板的包被可使白色念珠菌细胞黏附于板上。白色念珠菌细胞黏附不当会影响检测结果。该技术建立后，已被广泛应用于多种细胞类型和疾病研究，用于探讨线粒体在生理和病理条件下的功能。例如，在本实验中使用患者来源的细胞和对照细胞，可以解答线粒体功能如何发生改变的具体问题。在制备氰化钾和抗霉素A等线粒体抑制剂时应格外小心，因为这些化合物具有极强的毒性。

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