利用自动高通量微流控系统对铜绿假单胞菌剪切应力的活细胞分析

此方法可以帮助回答有关生物膜开发的关键问题，例如如何识别影响生物膜生长和开发过程中行为特征的关键环境条件。该技术的主要优点是多通道、微流体板，能够快速获得具有统计显著性的结果。该方法虽然能对生物膜结构提供深入的见解，但也可以应用于抗生素治疗和生物修复的研究。

一般来说，对这种方法的新鲜人会很不自在，因为需要仔细注意协议的细节和细致的技能。为了避免仪器与软件的连接出错，请先打开 PC 工作站，然后打开荧光模块。确保荧光快门已打开，然后打开硬件控制器。

接下来，打开成像系统控制器和 CCD 摄像机。然后打开成像站。当所有设备准备就绪时，启动控制应用，并输入位于板一侧标签上的车牌号。

对于注油，首先从包装中取出 48 井微流体板，而不接触板底部的玻璃表面，然后用透镜组织清洁板底部的玻璃幻灯片。为了给微流体通道提供上水，移液器200微升的37摄氏度最小介质进入输出井，注意避免气泡。然后将板放在板舞台上。

用乙醇擦拭界面，一旦乙醇干燥，就密封在板子上。在控制模块上的手动模式下，将液体设置为 Luria-Bertani 肉汤，温度为 37 摄氏度，最大纯度设置为每平方厘米 5 迪姆。单击输出井以激活从输出到输入井的流量，以给通道上设置。

五分钟后，暂停流动准备播种，并小心地将盘子从舞台上取下。然后，从输出井中吸出任何残余介质，而不从内圈中去除任何通向微流体通道的介质。为实验通道播种，在输入井中加入300微升最小介质，然后加入300微升细菌培养，加入输出井。

将板返回到成像阶段，确保在将组件置于板上之前用乙醇擦拭接口，并使用实时摄像机馈送聚焦在单个通道上。在目视监测实时馈送时，以每平方厘米 1 至 2 迪姆的速度恢复流量约 2 至 4 秒，让细胞进入实验通道而不是蛇形通道，将板留在温度控制级一小时，让细胞连接。在附件期结束时，小心地将板从舞台上拆下，并从输出井中吸出细菌，而不会干扰通道。

然后，使用新的移液器尖端从输入孔中去除介质。在软件中，打开多维采集来控制显微镜图像采集，并选择时间推移、多级位置和多波长。在"保存"选项卡中，创建一个简单的基名，确保如果文件存在，则检查 incroments 基名。

在描述中包括实验的任何基本细节。单击选择目录，选择在时间推移选项卡下保存所有文件的文件夹，将实验时间的持续时间调整为 24 小时，并在整个实验中每五分钟设置一次获取图像的时间间隔。使用实时摄像机馈送和 10 倍目标设置舞台位置，聚焦通道的中心，位于板上刻有通道编号的上方或下方。

切换到 20 倍目标，并在通道内找到最佳观察区域和焦点平面。然后，使用新设置将舞台位置添加到列表中。在波长菜单下，将波长数设置为 3，将第一波长设置为 FITC 100% 相机，曝光时间为 10 毫秒，第二波长设置为亮场 50%摄像机 50% 可见，最小曝光时间为 3 毫秒，第三波长为全部关闭，因此采集时间之间的最后一个通道上没有光。

在编辑 AutoRun 菜单中，打开协议设置选项卡并设置 24 小时持续时间的新协议，以适当的实验剪切速率将流量设置为向前方向。单击"添加并保存"以保存协议并打开序列设置选项卡。要设置新序列，请选择 37 度的 Luria-Bertani 肉汤作为所有通道的默认流体。

在通道 1 到 12 的步骤迭代 1 下，选择具有第一个实验剪切速率的协议，并启用所有通道。对于通道 13 到 24，选择具有第二个实验剪切速率的协议并启用所有通道。然后选择"应用"和"另存为"，以保存序列并打开"自动运行"菜单以选择要用于"自动运行"的已保存序列。

为了建立定时生长生物膜实验，将1300微升无菌最小介质加入微流体板的输入井中，并将板返回成像阶段。然后，用乙醇擦拭界面，然后密封板。确认协议和序列设置正确。

选择"开始"，以启动自动运行，然后立即单击"获取"以启动显微镜图像收集。在第一次图像采集结束时，单击"暂停"并选择亮场波长的实时图像模式。选择"转到以查看每个阶段位置"，然后选择设置为"当前"以设置新设置。

然后，单击"继续"，然后开始下一次计划收购。在这个具有代表性的时分生物膜生长实验中，生物膜覆盖率（即百分比阈值表面积）在所有三种剪切环境中都不同，表明剪切对生物膜表面覆盖有直接影响。生物膜积累的总相对测量，随着时间函数的增加，增长率从最高的剪切应力下降到最低的剪切应力。

在每种情况下，还有一个明确的指数增长期，从中可以计算数量增长率。总体而言，在所有剪切条件下，粗糙度系数会随着时间的推移而降低，表明所有生物膜表面都变得更光滑。但是，与最低的剪切相比，较高的剪切设置可随着时间的推移使表面更平滑，这表明更快的剪切流有助于使表面更平滑、更均匀。

此外，纹理熵，或形态的随机性，随着时间的推移，所有剪切条件增加。执行此过程时，必须记住遵循指定的顺序，并花时间精确执行每个步骤。所需的技能可能需要几次运行才能掌握。

按照此过程，可以执行其他方法，如 HBLC 或 GCMS，以回答有关所消耗的亚直的浓度（如葡萄糖）的其他问题。该技术开发后，为生物膜领域的研究人员通过受控的实验条件和水疗法采样实时探索一般流动环境铺平了道路。不要忘记，使用 BSL2 细菌菌株可能非常危险，在执行此程序时，应始终采取预防措施，例如佩戴适当的防护设备和使用适当的废物处理方案。