Name: 默克尔细胞多瘤病毒感染与检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 学习使用原代人真皮成纤维细胞建立默克尔细胞多瘤病毒感染模型，结合免疫荧光染色和荧光原位杂交技术。该方法为研究MCPyV病毒生命周期和宿主相互作用提供了可靠的细胞培养工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢 Wistar 研究所的 Meenhard Herlyn 博士和宾夕法尼亚大学的 M. Celeste Simon 博士提供试剂和技术支持。我们同时感谢实验室各位成员的有益讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目（R01CA187718、R01CA148768 和 R01CA142723）、美国国家癌症研究所癌症中心支持基金（NCI P30 CA016520）以及宾夕法尼亚大学 CFAR 奖项（P30 AI 045008）的资助。

人新生儿包皮组织取自宾夕法尼亚大学皮肤疾病研究中心。成人人类成纤维细胞取自手术后废弃的正常皮肤组织。所有实验方案均经宾夕法尼亚大学机构审查委员会批准。
1. 人皮肤成纤维细胞的分离
<ol>
	<li>使用剪刀剪除人类新生儿包皮上的脂肪和皮下组织，并将皮肤样本切成两半或四等份。</li>
	<li>将组织置于含有抗生素-抗真菌剂的 PBS 中，加入终浓度为 10 mg/mL 的分散酶 II（dispase II），在 4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>在无菌的 10 cm 培养皿中，使用显微解剖镊子小心地将表皮与真皮层分离。</li>
	<li>将分离得到的真皮组织转移至含有 5 mL 无胎牛血清培养基的 15 mL 锥形管中，培养基中添加 2 mg/mL IV 型胶原酶（collagenase type IV）及抗生素-抗真菌剂。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4–6 小时，期间定期振荡，直至仅剩少量肉眼可见的组织团块。</li>
	<li>用 10 mL 移液器剧烈吹打十次（反复移液），使真皮组织释放出单个细胞。</li>
	<li>以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将解离后的细胞接种于 DMEM 培养基中，培养基中添加 10% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸和 1% L-谷氨酰胺，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
</ol>
2. 重组MCPyV病毒颗粒的制备
<ol>
	<li>在200 µL体系中，使用250 U BamHI-HF酶切50 µg pR17b质粒（携带MCPyV基因组），37 °C孵育4小时，以将病毒基因组与载体骨架分离（图2）。</li>
	<li>向酶切后的DNA中加入1200 µL PB缓冲液（添加10 µL 3 M NaAc，pH 5.2），并通过两个质粒小提离心柱（每柱最大载量20 µg DNA）进行纯化。每个柱子用200 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）洗脱酶切后的pR17b质粒DNA。</li>
	<li>在50 mL离心管中配制连接反应体系：加入步骤2.2中获得的400 µL纯化质粒DNA、8.6 mL 1.05× T4 DNA连接酶缓冲液和6 µL高浓度T4 DNA连接酶。16 °C过夜孵育。</li>
	<li>向连接产物中加入45 mL PB缓冲液（添加10 µL 3 M NaAc，pH 5.2），使用真空抽滤装置将溶液通过两个质粒小提离心柱。每个柱子用50 µL TE缓冲液洗脱。预期可获得约30 µg DNA。</li>
	<li>在傍晚时分，将6 × 106个293TT28细胞接种至一个10 cm培养皿中，培养基为DMEM，添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1% L-谷氨酰胺，不含潮霉素B。</li>
	<li>次日早晨，确认细胞融合度约为50%。使用66 µL转染试剂（1.1 µL/cm2）、步骤2.4中重新连接的MCPyV R17b分离株DNA 12 µg、ST表达质粒pMtB 8.4 µg以及LT表达质粒pADL*29 9.6 µg进行转染。</li>
	<li>当转染后的细胞接近融合时，于次日用胰酶消化细胞，并将其转移至一个15 cm培养皿中继续扩增。</li>
	<li>可选：在细胞扩增后取少量293TT细胞，进行免疫荧光染色检测MCPyV LT（CM2B4抗体）和VP1（MCV VP1 rabbit30抗体），以评估转染效率。此阶段可能观察到细胞核内的LT信号，但VP1表达通常尚不可检测。</li>
	<li>当15 cm培养皿中的细胞接近融合（通常为初次转染后5–6天），将细胞传代至三个15 cm培养皿中。当这些培养皿中的细胞再次接近融合时，收集细胞并按以下病毒收获流程操作。 
	注意：可选按照步骤2.8所述进行质量控制性免疫荧光检测。此阶段大多数细胞应同时呈MCPyV LT和VP1阳性。</li>
	<li>收获病毒时，用胰酶消化细胞，室温下180 × g离心5分钟，弃去上清。加入相当于一个细胞沉淀体积的DPBS-Mg（含9.5 mM MgCl2和1×抗生素-抗真菌剂的DPBS）。随后加入25 mM硫酸铵（来自pH 9的1 M储备液），再加入0.5% Triton X-100（来自10%储备液）、0.1% Benzonase和0.1% ATP依赖性DNase。充分混匀后，37 °C过夜孵育。</li>
	<li>将混合物置于冰上孵育15分钟，然后加入0.17倍体积的5 M NaCl。混匀后继续在冰上孵育15分钟。在4 °C下，12,000 × g离心10分钟。若上清不澄清，轻柔颠倒离心管并重复离心步骤。将上清转移至新离心管中。</li>
	<li>用含0.8 M NaCl的DPBS重悬沉淀，体积为原沉淀体积的1倍，然后按照步骤2.11再次离心。</li>
	<li>合并步骤2.11和2.12所得的上清液，并按照步骤2.11所述再次离心一次。</li>
	<li>使用装有长针头的3 mL注射器或p1000移液器，在薄壁5 mL聚丙烯离心管中通过底层叠加法（underlaying）制备碘克沙醇梯度：依次加入约0.7 mL的27%、33%和39%碘克沙醇溶液。</li>
	<li>将3 mL澄清后的含病毒上清液加至已制备好的碘克沙醇梯度上层。</li>
	<li>在SW55ti转子中，234,000 × g、16 °C条件下离心3.5小时。加速度和减速度均设为慢速。</li>
	<li>超速离心后，用硅化处理的收集管分步收集12个组分（每管约400 µL）。</li>
	<li>通过双链DNA检测试剂和/或VP1蛋白的Western blot（MCV VP1 rabbit30抗体）分析各组分中病毒的存在情况。合并双链DNA含量和/或VP1信号最强的组分，并通过定量PCR对病毒储备液进行表征，计算病毒基因组当量31。将MCPyV病毒颗粒储备液保存于-80 °C。</li>
</ol>
3. 感染
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1% L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养原代人皮肤成纤维细胞。当细胞达到汇合时，以1:4比例传代，无需离心。 
	注意：为获得最高的MCPyV感染效率，应使用传代5至12代之间、在接种时处于活跃分裂状态的原代成纤维细胞。</li>
	<li>为了感染人皮肤成纤维细胞，吸除培养基并用DPBS洗涤细胞。</li>
	<li>向培养皿中加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5–10分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察，确保细胞已从培养皿上脱落。</li>
	<li>加入10 mL DMEM/F12培养基，其中含有20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF和3 µM CHIR99021，以上成分均可促进MCPyV感染24，加入培养皿中，并将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>以 180 x g 离心细胞 g 2分钟，弃去上清液。将细胞重悬于含有20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF和3 µM CHIR99021的DMEM/F12培养基中，细胞密度为2-4 × 104 每毫升细胞数</li>
	<li>将含有1 mg/mL IV型胶原酶的细胞悬液200 µL接种至96孔板的每个孔中。将MCPyV病毒原液置于冰上解冻。加入109 每感染 2,500 至 5,000 个细胞，使用碘克沙醇每 1 µL 中含有的 MCPyV 病毒颗粒的病毒基因组当量（按步骤 2.18 计算）。&#160;&#160;轻轻敲击培养板侧壁，然后将培养板放入培养箱中。</li>
	<li>37 °C、5% CO₂培养后2 孵育48–72小时后，向每孔加入20%胎牛血清（FBS）。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下继续进行感染2 72–96 小时。</li>
</ol>
4. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>用含3%多聚甲醛的PBS溶液固定第3.9步获得的细胞，孵育20分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>将细胞置于封闭/通透缓冲液（含0.5% Triton X-100和3% BSA的PBS溶液，经0.22 µm滤膜过滤）中，室温孵育1小时。</li>
	<li>加入以下一抗：小鼠单克隆抗MCPyV LT抗体（CM2B4）（1:1000）和兔多克隆抗MCPyV VP1抗体（1:2000），室温孵育3小时。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞三次。</li>
	<li>加入以下二抗：Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG（1:1000）和Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（1:500），室温避光孵育1小时。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞三次。</li>
	<li>用0.5 µg/mL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）对细胞进行复染。</li>
	<li>将盖玻片封片于载玻片上，使用倒置荧光显微镜进行观察分析。</li>
</ol>
5. 原位 DNA-HCR
注意：该技术要求将细胞接种在盖玻片上。为此，可将上述（步骤3）所述的感染条件按比例放大至24孔板规格。
<ol>
	<li>用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定盖玻片上的细胞，固定10分钟。用PBS洗涤盖玻片两次，然后在4 °C条件下用70%乙醇处理过夜，以通透细胞。 
	注意：固定后的样品可在此状态下保存数天。</li>
	<li>用探针杂交缓冲液替换乙醇，室温下预杂交60分钟。</li>
	<li>在预杂交步骤结束前30分钟，将探针（1 µM）（表1）按1:500比例稀释于探针杂交缓冲液中，并在45 °C孵育。</li>
	<li>孵育结束后，将约10 μL稀释后的探针混合液滴加至载玻片上（每张盖玻片对应一滴）。将盖玻片细胞面向下放置于各自的探针杂交液滴上。用足量橡胶胶水将盖玻片边缘及背面密封固定于载玻片上。</li>
	<li>将加有探针的载玻片置于平放的加热块上，在94 °C加热3分钟。随后将载玻片转移至湿化室中，在45 °C条件下过夜孵育。简易湿化室的制备方法：将无菌纸巾用dH2O轻微润湿后置于带有橡胶密封圈的塑料容器底部。 
	注意：加热过程中橡胶胶水可能会短暂起泡，但需确保密封未被破坏。</li>
	<li>用镊子小心剥离橡胶胶水，将盖玻片细胞面向上重新放回24孔板的孔中。在室温下用探针洗涤缓冲液洗涤盖玻片三次。</li>
	<li>将盖玻片在扩增缓冲液（24孔板中每孔200 µL）中室温孵育30–60分钟。</li>
	<li>同时，在避光条件下，分别将两种识别探针的标记寡核苷酸发夹结构（表1）在独立的PCR管中进行退火处理：94 °C加热90秒，随后缓慢冷却至室温，持续30分钟。将两种发夹结构按各1:50的比例混合于扩增缓冲液中。</li>
	<li>将24孔板盖的开口面覆盖一层石蜡膜，作为扩增反应的支撑表面。在石蜡膜上为每张盖玻片滴加50–100 µL发夹结构/扩增缓冲液混合液。用镊子小心从预扩增溶液中取出盖玻片，用多孔一次性擦拭纸轻触边缘以去除多余液体，然后细胞面向下放置于扩增液滴上。</li>
	<li>将承载盖玻片的板盖放入湿化室中，于室温避光条件下过夜孵育。</li>
	<li>再次将盖玻片放回24孔板的孔中。加入含0.5 µg/mL DAPI的5x SSCT溶液[5倍浓度的氯化钠-柠檬酸钠（SSC）缓冲液含0.1% Tween 20，经0.22 µm滤膜过滤]，室温孵育1小时。随后在室温下用5x SSCT溶液洗涤两次。</li>
	<li>将盖玻片封片于载玻片上。使用倒置荧光显微镜观察细胞并采集图像。</li>
</ol>

<ol><li>Gjoerup, O., Chang, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGjoerup%2C+O+%22Advances+in+Cancer+Research%22">Advances in Cancer Research</a>. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).</li>
<li>Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+integration+of+a+polyomavirus+in+human+Merkel+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma.</a> Science. 319, 1096-1100 (2008).</li>
<li>Lemos, B., Nghiem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+carcinoma%3A+more+deaths+but+still+no+pathway+to+blame%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).</li>
<li>Agelli, M., Clegg, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+primary+Merkel+cell+carcinoma+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).</li>
<li>Liu, W., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+polyomavirus+infection+and+Merkel+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma.</a> Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).</li>
<li>Harrison, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Assembly+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Large+T-Antigen+Origin+Binding+Domains+at+the+Viral+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).</li>
<li>Kwun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Minimum+Replication+Origin+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Has+a+Unique+Large+T-Antigen+Loading+Architecture+and+Requires+Small+T-Antigen+Expression+for+Optimal+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication.</a> Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).</li>
<li>Carter, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+overprinting+gene+in+Merkel+cell+polyomavirus+provides+evolutionary+insight+into+the+birth+of+viral+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).</li>
<li>Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+polyomavirus+encodes+a+microRNA+with+the+ability+to+autoregulate+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression.</a> Virology. 383 (2), 183-187 (2009).</li>
<li>Theiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Analysis+of+Replicating+Merkel+Cell+Polyomavirus+Genomes+Delineates+the+Viral+Transcription+Program+and+Suggests+a+Role+for+mcv-miR-M1+in+Episomal+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence.</a> PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974(2015).</li>
<li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycans+and+sialylated+glycans+sequentially+facilitate+Merkel+cell+polyomavirus+infectious+entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry.</a> PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161(2011).</li>
<li>Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+Tropism+of+BK+and+Merkel+Cell+Polyomaviruses+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture.</a> PLoS One. 7 (7), 42181(2012).</li>
<li>Schowalter, R. M., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Merkel+cell+polyomavirus+minor+capsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein.</a> PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558(2013).</li>
<li>Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+Merkel+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma.</a> Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).</li>
<li>Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+carcinoma%3A+a+virus-induced+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer.</a> Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).</li>
<li>Hodgson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+carcinoma%3A+Changing+incidence+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends.</a> Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).</li>
<li>Tolstov, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Merkel+cell+polyomavirus+infection+II.+MCV+is+a+common+human+infection+that+can+be+detected+by+conformational+capsid+epitope+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays.</a> International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).</li>
<li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cell+polyomavirus+and+two+previously+unknown+polyomaviruses+are+chronically+shed+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin.</a> Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).</li>
<li>Foulongne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Skin+Microbiota%3A+High+Diversity+of+DNA+Viruses+Identified+on+the+Human+Skin+by+High+Throughput+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing.</a> PLoS One. 7 (6), 38499(2012).</li>
<li>Hopcraft, S. E., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+viruses+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumour viruses and innate immunity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).</li>
<li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+viral+factors+regulating+Merkel+cell+polyomavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication.</a> PLoS One. 6 (7), 22468(2011).</li>
<li>Neumann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+and+Particle+Production+by+a+Consensus+Merkel+Cell+Polyomavirus+%28MCPyV%29+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome.</a> PLoS One. 6 (12), 29112(2011).</li>
<li>Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+DNA+damage+response+factors+localize+to+merkel+cell+polyomavirus+DNA+replication+sites+to+support+efficient+viral+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication.</a> Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+Target+Cells+and+Mechanisms+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection.</a> Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).</li>
<li>Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li>
<li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+higher+gain%2C+lower+cost%2C+greater+durability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li>
<li>Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li>
<li>ccr.cancer.gov. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm</a> (2018).</li>
<li>ccr.cancer.gov. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018).</li>
<li>ccr.cancer.gov. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述方法包括从人皮肤组织中分离真皮成纤维细胞、制备重组MCPyV病毒颗粒、感染培养细胞、免疫荧光染色，以及一种基于HCR技术改良的高灵敏度FISH方法，这些应能使研究人员分析MCPyV感染27。在体外实现MCPyV感染最关键的步骤之一是制备高滴度的病毒颗粒。采用本文所述的重组MCPyV病毒颗粒制备方案，我们获得了每毫升碘克沙醇溶剂中含1012个基因组拷贝的病毒滴度11,12。这些高滴度的MCPyV制备物使我们能够鉴定出人真皮成纤维细胞（HDFs）是迄今为止唯一被发现能够支持完整MCPyV感染周期的原代皮肤细胞类型24。
采用本文所述方案分离新鲜的人类真皮成纤维细胞，使我们能够控制MCPyV感染实验中所用细胞的质量，并确保从不同患者样本分离的细胞之间实验结果的一致性。所有从新生儿皮肤分离的人类真皮成纤维细胞在使用重组MCPyV病毒颗粒处理前，均应通过q...

默克尔细胞多瘤病毒（MCPyV）是一种小型双链DNA病毒，与一种罕见但侵袭性强的皮肤癌——默克尔细胞癌（MCC）相关1,2。MCC的死亡率约为33%，高于黑色素瘤3,4。MCPyV具有一个约5 kb的环状基因组1,5，被一个非编码调控区（NCRR）分为早期和晚期编码区1。NCRR包含病毒复制起点（Ori）以及驱动病毒转录的双向启动子6,7。早期区编码称为大T抗原（LT）、小T抗原（sT）、57kT、替代性LT开放阅读框（ALTO）以及一种自调控miRNA的肿瘤抗原蛋白1,8,9,10。晚期区编码衣壳蛋白VP1和VP211,12,13。LT和sT是研究最为深入的MCPyV蛋白，已被证实可支持病毒DNA复制及MCPyV诱导的肿瘤发生5。在高达80%的MCC病例中观察到MCPyV DNA以克隆形式整合至宿主基因组，这可能是病毒阳性肿瘤发展的致病因素14,15。
在过去二十年中，MCC 的发病率已增至原来的三倍16。无症状的 MCPyV 感染在普通人群中也十分普遍17,18,19。随着 MCC 诊断病例数量的不断增加以及 MCPyV 感染的高流行率，迫切需要加深对这种病毒及其致癌潜能的理解。然而，MCPyV 的生物学特性及其致癌机制的许多方面仍远未被充分阐明20。这在很大程度上是因为 MCPyV 在已建立的细胞系中复制能力较差11,12,21,22,23，且直到最近，能够支持 MCPyV 感染的皮肤细胞尚未被发现22。由于缺乏可用于扩增该病毒的细胞培养系统，对 MCPyV 及其与宿主细胞相互作用的机制性研究一直受到严重阻碍5。
我们发现，从新生儿包皮组织中分离得到的原代人皮肤成纤维细胞（HDFs）能够有效支持MCPyV的感染 体外 和 离体24本研究中，我们建立了首个MCPyV细胞培养感染模型24基于该模型系统，我们发现WNT/β-catenin信号通路及其他生长因子对基质金属蛋白酶（MMP）基因的诱导可促进MCPyV感染。此外，我们发现美国食品药品监督管理局（FDA）批准的MEK拮抗剂曲美替尼可有效抑制MCPyV感染。5,25从这些研究中，我们还建立了一套分离人皮肤成纤维细胞的实验方案24,25，制备MCPyV病毒颗粒11,12，在人皮肤成纤维细胞上进行MCPyV感染24,25 通过免疫荧光染色检测MCPyV蛋白26此外，我们采用了原位DNA杂交链式反应（HCR）技术27 开发一种高灵敏度的FISH技术（HCR-DNA FISH），用于检测感染的人皮肤细胞中的MCPyV DNA。这些新方法将有助于研究MCPyV的感染周期以及宿主细胞对MCPyV感染的反应。目前，维持MCPyV感染的天然宿主储存细胞以及导致MCC肿瘤发生的细胞来源仍不明确。本文所描述的技术可用于检测多种类型的人体细胞，以鉴定MCC肿瘤的储存细胞及其起源。我们建立的方法（如HCR-DNA FISH）也可应用于其他DNA肿瘤病毒的检测及宿主细胞相互作用的表征。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液，100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GLUTAMAX I，100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>不含钙、镁的 DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF 蛋白，CF</td><td>R&amp;D systems</td><td>236-EG-200</td><td>于 -80 摄氏度保存</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td>于 -80 摄氏度保存</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>SML1046</td><td>于 -80 摄氏度保存</td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240-062</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11032</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>OptiPrep 密度梯度介质</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>抗 MCPyV LT 抗体 (CM2B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-136172</td><td>批号 # B2717</td></tr><tr><td>MCV VP1 兔抗血清</td><td></td><td>兔多克隆血清 #10965</td><td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)，人重组</td><td>Corning</td><td>354060</td><td>于 -80 摄氏度保存</td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td></td></tr><tr><td>质粒安全型 ATP 依赖性 DNase</td><td>EPICENTRE</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>探针杂交缓冲液</td><td>Molecular technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>探针洗涤缓冲液</td><td>Molecular technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>扩增缓冲液</td><td>Molecular technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594 标记的发夹探针</td><td>Molecular technologies</td><td>B4</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td></td></tr><tr><td>Buffer PB</td><td>Qiagen</td><td>19066</td><td></td></tr><tr><td>蓝色质粒小提离心柱</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>T4 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5602</td><td></td></tr></tbody></table>

merkel细胞多瘤病毒感染与检测

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

默克尔细胞多瘤病毒感染可导致默克尔细胞癌（MCC），这是一种高度侵袭性的皮肤癌。由于缺乏合适的细胞培养模型，目前对默克尔细胞多瘤病毒分子生物学特性及致癌机制的深入研究受到限制。本文介绍了一套用于实现并检测原代人皮肤细胞中默克尔细胞多瘤病毒感染的实验方案。该方案包括人真皮成纤维细胞的分离、重组默克尔细胞多瘤病毒颗粒的制备，以及通过免疫荧光（IF）染色和原位DNA杂交链式反应（HCR）检测病毒感染的方法；其中HCR是一种高灵敏度的荧光原位杂交（FISH）技术。本方案可由相关研究人员加以改进，用于鉴定其他支持默克尔细胞多瘤病毒感染的细胞类型或细胞系。所述FISH方法亦可适用于检测感染人皮肤组织中低水平存在的病毒DNA。

本论文所述方案可分离出近乎均一的人类真皮成纤维细胞（HDFs）群体（图1）。如免疫荧光染色所示，采用本方案所述条件分离得到的人类真皮细胞中，几乎100%的细胞对真皮成纤维细胞标志物波形蛋白（vimentin）和I型胶原蛋白（collagen I）24呈阳性染色，而对人类包皮角质形成细胞标志物K14呈阴性（图1）。图2展示了利用重组MCPyV基因组产生MCPyV病毒颗粒的过程，以及超速离心浓缩后的病毒颗粒样本。在观察到梯度介质核心处浓缩的MCPyV病毒颗粒条带后（见图2B中标记箭头处），收集500 µL的组分，并进行MCPyV定量PCR（qPCR）以确定峰值组分。qPCR分析结果示例见图2<stro...

本文介绍了一种用于感染原代人皮肤成纤维细胞的默克尔多瘤病毒（MCPyV）实验方案。该方案包括皮肤成纤维细胞的分离、MCPyV病毒颗粒的制备、病毒感染、免疫荧光染色以及荧光原位杂交。本方案可进一步拓展用于研究MCPyV与宿主之间的相互作用，并探索其他可被MCPyV感染的细胞类型。

Merkel细胞多瘤病毒感染与检测

默克尔细胞多瘤病毒感染可导致默克尔细胞癌（MCC），这是一种高度侵袭性的皮肤癌。为全面开展机制研究……

我们提出了首个用于 Merkel 细胞多瘤病毒感染的细胞培养模型。该方案包括真皮成纤维细胞的分离、MCPyV 病毒感染的制备、免疫荧光染色以及荧光原位杂交。本方案使得研究 MCPyV 的感染周期及其与宿主细胞的相互作用成为可能，同时避免了病毒基因过表达所导致的假象。首先，使用剪刀将人类新生儿包皮上的脂肪和皮下组织剪除。将皮肤样本切成两半或四等份。将组织置于5毫升含抗生素-抗真菌剂的10毫克/毫升 dis-based II NPBS中。在4摄氏度下孵育过夜。次日，使用显微解剖镊子在10厘米培养皿中小心地将表皮层与真皮层分离。将所得的真皮组织转移至含有5毫升胶原酶IV（2毫克/毫升）的15毫升锥形管中，该酶溶于不含胎牛血清并添加了抗生素-抗真菌剂的培养基中。将样品置于含5%二氧化碳的37摄氏度环境中孵育，期间定期振荡，持续四至六小时，直至仅剩少量肉眼可见的组织团块。随后，使用10毫升移液器将样品溶液剧烈吹打10次，使表皮细胞从真皮中充分解离。在180 ×g条件下离心五分钟，弃去上清液。将解离的细胞接种于添加了补剂的DMEM培养基中。在傍晚时分，将600万个293TT28细胞接种至一个10厘米培养皿中，培养皿内含有添加了补剂的DMEM培养基。于37°C、5% CO₂条件下孵育。第二天早上，确保细胞融合度约为50%，然后用66微升转染试剂、12微克重新连接的MCPyV分离株R17B DNA、8.4微克ST表达质粒pMtB和9.6微克LT表达质粒pADL对细胞进行转染。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下孵育过夜。转染后的第二天，当细胞接近完全融合时，用胰蛋白酶消化细胞并将其转移至15厘米培养皿中继续扩增。当该培养皿中的细胞接近汇合时，将细胞传代至三个新的15厘米培养皿中。当这些新培养皿中的细胞接近汇合时，按照文本方案中所述步骤收获细胞。在室温下以180 ×g离心5分钟。然后去除上清液，加入一倍细胞体积的含镁 DPBS。依次加入 25 微摩尔的硫酸铵、0.5% Triton X-100、0.1% 苯甲酸酯酶和 0.1% ATP 依赖性 DNA 酶。充分混匀后，在 37°C 下孵育过夜。第二天，将混合物置于冰上冷却15分钟。接着，加入0.17倍体积的氯化钠。混匀后，再于冰上孵育15分钟。在 4 摄氏度下以 12 千 g 离心 10 分钟。如果上清液不澄清，轻轻倒置离心管并重复离心。此后，将上清液转移至新的离心管中。将沉淀重悬于1体积的DPBS中，DPBS中添加0.8摩尔的氯化钠。在4°C下以12,000 ×g离心10分钟。如果上清液不澄清，轻轻倒置离心管并重复离心步骤。将两种上清液合并，于4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。然后，按照文本方案所述，使用移液器将碘克沙醇梯度溶液加入薄壁的5 mL聚丙烯管中。将3 mL澄清的含病毒上清液加至已制备好的碘克沙醇梯度上方。使用SW 55 Ti转子在234千倍重力、16摄氏度条件下离心3.5小时，注意将加速度和减速度设置为慢速。超速离心完成后，用硅化管收集12个组分。细胞维持并解离后，向培养皿中加入10毫升添加了补充物的DMEM/F12培养基。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在180 g条件下离心2分钟。弃去上清液，用添加了补剂的DMEM/F12培养基重悬细胞，细胞密度为每毫升2万至4万个细胞。然后，将含有1毫克/毫升IV型胶原酶的细胞悬液分别接种至24孔板或96孔板中，每孔接种量为200或400微升。从-80摄氏度冰箱中取出MCPyV病毒原液，置于冰上解冻。每感染2500至5000个细胞，需加入相当于10亿病毒基因组拷贝的MCPyV病毒颗粒，每微升碘克沙醇中加入10亿病毒基因组当量。轻轻敲击培养板侧面，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。首先，用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞10分钟，然后用PBS洗涤盖玻片两次，并在4摄氏度下用70%乙醇处理过夜，以通透细胞。次日，将乙醇替换为探针杂交缓冲液，在室温下孵育60分钟，对样本进行预杂交。在预杂交孵育结束前30分钟，将探针按1:500的比例稀释于探针杂交液中，并在45摄氏度下孵育。当孵育完成后，为每张盖玻片吸取约10微升稀释后的探针混合液滴加至载玻片上。将每张盖玻片的细胞面朝下放置于对应的杂交混合液滴上。使用足量的橡胶胶水，将每张盖玻片的边缘及其背面与载玻片密封。将载玻片放置于加热块的平整面上，加热至 94 摄氏度，持续 3 分钟。随后，将载玻片转移至湿化室中，在 45 摄氏度下过夜孵育。第二天，使用镊子小心剥离橡胶胶水。将盖玻片有细胞的一面朝上放入24孔板的孔中，并用探针洗涤缓冲液在室温下洗涤三次。向每个含有盖玻片的孔中加入200 µL扩增缓冲液，在室温下孵育30至60分钟。同时，在两个独立的PCR管中分别退火两条标记的寡核苷酸发夹结构，使其识别探针：先加热至94摄氏度持续90秒，随后冷却至室温持续30分钟。将退火后的发夹结构按1:50的稀释比例混合于扩增缓冲液中。接下来，将石蜡膜拉伸覆盖在12孔板盖的开口面上，以形成扩增反应的表面。用移液器将50-100微升发夹混合物液滴加到每片盖玻片的石蜡膜上。使用镊子小心地将每片盖玻片从预扩增溶液中取出，并用其边缘接触多孔性一次性擦拭纸以吸干液体。将每片干燥后的盖玻片细胞面朝下放置于扩增液滴上。将培养板盖转移至湿化室中，在室温避光条件下孵育过夜。次日，将盖玻片放回24孔板的各孔中，每孔加入含有DAPI（终浓度为0.5微克/毫升）的5X SSCT溶液，在室温下孵育1小时。此后，在室温下用 5X SSCT 洗涤样品两次。将洗涤后的盖玻片封片于显微镜载玻片上，使用倒置荧光显微镜观察细胞并成像。本研究中分离得到近乎均一的人类皮肤成纤维细胞群体。免疫荧光染色显示，分离得到的人类真皮细胞中几乎100%表达真皮成纤维细胞标志物波形蛋白（vimentin）和胶原蛋白，而不表达人包皮角质形成细胞标志物K14。随后生成MCPyV病毒颗粒，在观察到MCPyV病毒颗粒在梯度离心核心区域形成条带后，收集每管500微升的组分，并进行MCPyV定量PCR（qPCR）以确定峰值组分。此处展示了感染MCPyV的人真皮成纤维细胞（HDFs）的免疫荧光染色图像，其中LT阳性、VP1阳性或同时为LT和VP1阳性的细胞均被视为MCPyV感染阳性细胞。超过30%的细胞LT呈阳性，超过10%的细胞VP1呈阳性。通过HCR-DNA FISH和免疫荧光-HCR-DNA FISH方法均可检测到感染细胞中复制的MCPyV基因组。HCR-DNA FISH可显示存在于复制工厂中的MCPyV DNA的定位，而免疫荧光-HCR-DNA FISH方法则能够同时检测MCPyV DNA与LT蛋白在复制中心的共定位。为了获得最佳的病毒感染效率，将MCPyV浓缩至每微升至少2 × 10⁸个病毒基因组至关重要，因为碘克沙醇对细胞具有毒性。在MCPyV感染真皮成纤维细胞后，可进行多种分子生物学分析，包括免疫荧光、免疫阻断、免疫阳性化以及基于qPCR的检测。我们所描述的感染系统使研究人员能够研究MCPyV感染的各个阶段，例如病毒核转运和病毒组装包装。MCPyV 是一种生物安全等级为 BSL-2 的病毒，但在实验室环境中达到的病毒量是否具有致病潜力尚不明确。因此，研究人员应采取预防措施，避免接触该病毒。

merkel-cell-polyomavirus-infection-and-detection

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

默克尔细胞多瘤病毒感染与检测

宿主细胞因子在卡波西肉瘤（KS）的发生和维持过程中起着关键作用。我们概述了鉴定在KSHV感染的DMVEC细胞及KS肿瘤组织中发生改变的宿主细胞因子的方法。病毒所改变的细胞基因可作为新型治疗手段的潜在靶点。...

鉴定卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）诱导的失调基因

在本视频中，感染了MCPyV病毒颗粒的细胞接受了处理 在 原位 杂交链式反应检测MCPyV特异性基因组。此外，将DNA-HCR技术与FISH相结合，以可视化感染的人皮肤细胞中的MCPyV...

HCR-DNA FISH：一种用于检测感染细胞中病毒DNA的荧光原位杂交技术

在本视频中，我们展示了使用273TT细胞制备默克尔细胞多瘤病毒（Merkel cell...

重组 Merkel 细胞多瘤病毒 (MCPyV) 病毒颗粒制备：一种高效制备高滴度重组 MCPyV 病毒颗粒的技术

本视频展示了一种用于监测单纯疱疹病毒-1型感染过程中感染细胞蛋白0（ICP0）转运的方法。ICP0在新合成后会转位至细胞核，随着感染进程的发展，随后转移至细胞质。通过免疫荧光显微镜可揭示并分析该蛋白的亚细胞定位，从而深入了解其在感染各阶段中的转运动态。...

一种用于感染细胞中病毒蛋白定位的免疫荧光技术

来源：Matthew J Murray1, Gary R McLean2,3, Matthew B...

一种用于检测人巨细胞病毒中和作用的免疫荧光方法

本方案描述了在福尔马林固定、石蜡包埋的活检组织中进行巨细胞病毒qPCR检测的方法，该方法快速、灵敏、特异，有助于解读难以确定的苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色结果。...

qPCR 是一种用于检测福尔马林固定、石蜡包埋活检组织中巨细胞病毒 DNA 的灵敏且快速的方法

皮肤是人类病原体单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的靶组织之一。为探究HSV-1侵入组织的途径，我们建立了一种 离体...

Ex Vivo 小鼠表皮感染单纯疱疹病毒1型

本方案详细描述了用于表达免疫调节剂的溶瘤病毒的生成及其体外表征的工作流程，以编码双特异性T细胞衔接器的麻疹病毒为例。该方法可应用于其他载体平台和转基因，从而加速新型免疫病毒治疗药物的临床转化开发。...

用于肿瘤靶向免疫调节的副粘病毒：体外设计与评估

本文提供了一种利用转染了双向报告质粒（表达tdTomato和eGFP）的HEK293T细胞，通过流式细胞术（FACS）检测BK多瘤病毒转录活性的实验方案。该方法还可用于定量评估新化合物对病毒转录的影响。...

通过流式细胞术测量BK多瘤病毒非编码调控区驱动的转录活性

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

本方案通过佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯诱导人P3HR1细胞系的病毒裂解周期，从而分离出EB病毒颗粒。随后从病毒制备物中提取DNA，并进行实时PCR以定量病毒颗粒浓度。...

从P3HR1细胞系中分离与定量EB病毒

学习使用原代人真皮成纤维细胞建立默克尔细胞多瘤病毒感染模型，结合免疫荧光染色和荧光原位杂交技术。该方法为研究MCPyV病毒生命周期和宿主相互作用提供了可靠的细胞培养工具。

Merkel细胞多瘤病毒感染与检测

探索更多视频