Merkel细胞多瘤病毒感染与检测

我们提出了首个用于 Merkel 细胞多瘤病毒感染的细胞培养模型。该方案包括真皮成纤维细胞的分离、MCPyV 病毒感染的制备、免疫荧光染色以及荧光原位杂交。本方案使得研究 MCPyV 的感染周期及其与宿主细胞的相互作用成为可能，同时避免了病毒基因过表达所导致的假象。

首先，使用剪刀将人类新生儿包皮上的脂肪和皮下组织剪除。将皮肤样本切成两半或四等份。将组织置于5毫升含抗生素-抗真菌剂的10毫克/毫升 dis-based II NPBS中。

在4摄氏度下孵育过夜。次日，使用显微解剖镊子在10厘米培养皿中小心地将表皮层与真皮层分离。将所得的真皮组织转移至含有5毫升胶原酶IV（2毫克/毫升）的15毫升锥形管中，该酶溶于不含胎牛血清并添加了抗生素-抗真菌剂的培养基中。

将样品置于含5%二氧化碳的37摄氏度环境中孵育，期间定期振荡，持续四至六小时，直至仅剩少量肉眼可见的组织团块。随后，使用10毫升移液器将样品溶液剧烈吹打10次，使表皮细胞从真皮中充分解离。在180 ×g条件下离心五分钟，弃去上清液。

将解离的细胞接种于添加了补剂的DMEM培养基中。在傍晚时分，将600万个293TT28细胞接种至一个10厘米培养皿中，培养皿内含有添加了补剂的DMEM培养基。于37°C、5% CO₂条件下孵育。

第二天早上，确保细胞融合度约为50%，然后用66微升转染试剂、12微克重新连接的MCPyV分离株R17B DNA、8.4微克ST表达质粒pMtB和9.6微克LT表达质粒pADL对细胞进行转染。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下孵育过夜。转染后的第二天，当细胞接近完全融合时，用胰蛋白酶消化细胞并将其转移至15厘米培养皿中继续扩增。

当该培养皿中的细胞接近汇合时，将细胞传代至三个新的15厘米培养皿中。当这些新培养皿中的细胞接近汇合时，按照文本方案中所述步骤收获细胞。在室温下以180 ×g离心5分钟。

然后去除上清液，加入一倍细胞体积的含镁 DPBS。依次加入 25 微摩尔的硫酸铵、0.5% Triton X-100、0.1% 苯甲酸酯酶和 0.1% ATP 依赖性 DNA 酶。充分混匀后，在 37°C 下孵育过夜。

第二天，将混合物置于冰上冷却15分钟。接着，加入0.17倍体积的氯化钠。混匀后，再于冰上孵育15分钟。

在 4 摄氏度下以 12 千 g 离心 10 分钟。如果上清液不澄清，轻轻倒置离心管并重复离心。此后，将上清液转移至新的离心管中。

将沉淀重悬于1体积的DPBS中，DPBS中添加0.8摩尔的氯化钠。在4°C下以12,000 ×g离心10分钟。如果上清液不澄清，轻轻倒置离心管并重复离心步骤。

将两种上清液合并，于4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。然后，按照文本方案所述，使用移液器将碘克沙醇梯度溶液加入薄壁的5 mL聚丙烯管中。将3 mL澄清的含病毒上清液加至已制备好的碘克沙醇梯度上方。

使用SW 55 Ti转子在234千倍重力、16摄氏度条件下离心3.5小时，注意将加速度和减速度设置为慢速。超速离心完成后，用硅化管收集12个组分。细胞维持并解离后，向培养皿中加入10毫升添加了补充物的DMEM/F12培养基。

将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在180 g条件下离心2分钟。弃去上清液，用添加了补剂的DMEM/F12培养基重悬细胞，细胞密度为每毫升2万至4万个细胞。

然后，将含有1毫克/毫升IV型胶原酶的细胞悬液分别接种至24孔板或96孔板中，每孔接种量为200或400微升。从-80摄氏度冰箱中取出MCPyV病毒原液，置于冰上解冻。每感染2500至5000个细胞，需加入相当于10亿病毒基因组拷贝的MCPyV病毒颗粒，每微升碘克沙醇中加入10亿病毒基因组当量。

轻轻敲击培养板侧面，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。首先，用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞10分钟，然后用PBS洗涤盖玻片两次，并在4摄氏度下用70%乙醇处理过夜，以通透细胞。次日，将乙醇替换为探针杂交缓冲液，在室温下孵育60分钟，对样本进行预杂交。

在预杂交孵育结束前30分钟，将探针按1:500的比例稀释于探针杂交液中，并在45摄氏度下孵育。当孵育完成后，为每张盖玻片吸取约10微升稀释后的探针混合液滴加至载玻片上。将每张盖玻片的细胞面朝下放置于对应的杂交混合液滴上。

使用足量的橡胶胶水，将每张盖玻片的边缘及其背面与载玻片密封。将载玻片放置于加热块的平整面上，加热至 94 摄氏度，持续 3 分钟。随后，将载玻片转移至湿化室中，在 45 摄氏度下过夜孵育。

第二天，使用镊子小心剥离橡胶胶水。将盖玻片有细胞的一面朝上放入24孔板的孔中，并用探针洗涤缓冲液在室温下洗涤三次。向每个含有盖玻片的孔中加入200 µL扩增缓冲液，在室温下孵育30至60分钟。

同时，在两个独立的PCR管中分别退火两条标记的寡核苷酸发夹结构，使其识别探针：先加热至94摄氏度持续90秒，随后冷却至室温持续30分钟。将退火后的发夹结构按1:50的稀释比例混合于扩增缓冲液中。接下来，将石蜡膜拉伸覆盖在12孔板盖的开口面上，以形成扩增反应的表面。

用移液器将50-100微升发夹混合物液滴加到每片盖玻片的石蜡膜上。使用镊子小心地将每片盖玻片从预扩增溶液中取出，并用其边缘接触多孔性一次性擦拭纸以吸干液体。将每片干燥后的盖玻片细胞面朝下放置于扩增液滴上。

将培养板盖转移至湿化室中，在室温避光条件下孵育过夜。次日，将盖玻片放回24孔板的各孔中，每孔加入含有DAPI（终浓度为0.5微克/毫升）的5X SSCT溶液，在室温下孵育1小时。

此后，在室温下用 5X SSCT 洗涤样品两次。将洗涤后的盖玻片封片于显微镜载玻片上，使用倒置荧光显微镜观察细胞并成像。本研究中分离得到近乎均一的人类皮肤成纤维细胞群体。

免疫荧光染色显示，分离得到的人类真皮细胞中几乎100%表达真皮成纤维细胞标志物波形蛋白（vimentin）和胶原蛋白，而不表达人包皮角质形成细胞标志物K14。随后生成MCPyV病毒颗粒，在观察到MCPyV病毒颗粒在梯度离心核心区域形成条带后，收集每管500微升的组分，并进行MCPyV定量PCR（qPCR）以确定峰值组分。此处展示了感染MCPyV的人真皮成纤维细胞（HDFs）的免疫荧光染色图像，其中LT阳性、VP1阳性或同时为LT和VP1阳性的细胞均被视为MCPyV感染阳性细胞。

超过30%的细胞LT呈阳性，超过10%的细胞VP1呈阳性。通过HCR-DNA FISH和免疫荧光-HCR-DNA FISH方法均可检测到感染细胞中复制的MCPyV基因组。HCR-DNA FISH可显示存在于复制工厂中的MCPyV DNA的定位，而免疫荧光-HCR-DNA FISH方法则能够同时检测MCPyV DNA与LT蛋白在复制中心的共定位。

为了获得最佳的病毒感染效率，将MCPyV浓缩至每微升至少2 × 10⁸个病毒基因组至关重要，因为碘克沙醇对细胞具有毒性。在MCPyV感染真皮成纤维细胞后，可进行多种分子生物学分析，包括免疫荧光、免疫阻断、免疫阳性化以及基于qPCR的检测。我们所描述的感染系统使研究人员能够研究MCPyV感染的各个阶段，例如病毒核转运和病毒组装包装。

MCPyV 是一种生物安全等级为 BSL-2 的病毒，但在实验室环境中达到的病毒量是否具有致病潜力尚不明确。因此，研究人员应采取预防措施，避免接触该病毒。