一种从人类死后小脑中的激光捕获微解剖 purkinje 细胞中分离高质量 rna 的不锈钢协议

该协议采用无污渍的方法, 通过激光捕获微解剖, 将新鲜冷冻组织中的 purkinje 细胞从人类死后的小脑中观察和分离。该协议的目的是为 rna 测序生成足够数量的高质量 rna。

该协议意义重大，因为它使用无污渍可视化方法，而不是在死后人类脑组织上基于染料的可视化，这有助于保持RNA的完整性。保存RNA是这个协议的一大优势，因为它是有用的，不仅在死后的人类脑组织，而且在其他组织类型，具有高RNase活性。首先，从冰柜中取出纸巾，放在干冰上，然后运到低温恒温器。

将干净的刷子、夹头和组织放入低温恒温器中至少 20 分钟，以便达到最佳温度。对于具有双腔室和试样保持温度的低温器，将物体温度设置为零下 16 摄氏度，将室温度设置为零下 18 摄氏度。将低温恒温器的截面厚度设置为 14 微米，将厚度设置为 30 微米。

接下来，用一对一的RNase除污染剂和70%乙醇的混合物清洁舞台，以防止冻结。获得新的一次性低温热器刀片，使用 RNase 除污染器进行清洁。将清洁的刀片放在舞台上的刀片支架中。

然后，使用 RNase 除污染器清洁防卷板。将清洁的板连接到舞台，等待至少 20 分钟，使刀片板和防卷板降低至低温恒温器的温度。首先，切割一小块组织进行切块，确保该部分约为95%的小脑皮层。

将剩余的组织放在干冰中，或在零下80摄氏度的冰柜中。接下来，开始缓慢地在夹头顶部添加 OCT，并缓慢地循环运动。建立 OTC 层，直到有一个安装约三毫米高覆盖夹头。

当 OCT 部分冻结，但中心仍有一些液体时，请将组织放在支架顶部。让组织在 OCT 顶部坐一到两分钟，直到它完全冻结。然后，将夹头与冷冻的 OCT 和组织一起转移到低温恒温切割臂中。

调整组织，使其与切割刀片齐平，让组织在切割臂中坐 20 分钟，以适应新温度。最关键的一步是允许组织适应低温计电切割臂，只要有必要。如果组织粉碎，紫金耶细胞可视化将非常困难。

我建议使用更小、更薄的组织，让组织更快地适应。在此之后，慢慢移动组织靠近刀片。组织到达刀片后，开始修剪过程。

修剪组织两到三次，直到皮层可见。接下来，将防卷板放在低温片的上方并对齐。切割四到六个14微米厚的截面，注意适当切割部分将平放在防卷板下。

在低温恒温级上水平对齐切割部分。角度幻灯片，以同时拾取所有组织件。在剖下组织后，立即将幻灯片放在滑梯架上，将 70%乙醇放在冰上两分钟。

将幻灯片转移到冰上有 95% 乙醇的滑轨架上 45 秒。接下来，将幻灯片放在幻灯片架中，在室温下用 100% 乙醇放置两分钟。在室温下将幻灯片浸入包含二甲苯 1 的滑架中三次。

然后，将幻灯片与二甲苯 2 放在幻灯片架中，在室温下放置五分钟。将滑梯放在干净的烟罩中，让它们风干至少 30 分钟。如果将滑梯存放，请将每个滑梯放入单独的 50 毫升管中，并在零下 80 摄氏度的温度下将管子放入冰柜中长达 7 天。

首先，使用 RNase 除污染器清洁显微镜阶段和盖收集臂。用戴手套的手，将幻灯片放在显微镜上，并在收集臂中放置一个 500 微升不透明盖。在低放大倍率下，将不透明的盖子对焦在小脑组织上对齐，确保盖覆盖眼睛片中可视化的整个区域。

使用 5 倍到 10 倍的目标来可视化小脑图层。将光标放在分子层和颗粒细胞层相交的截面上。移动到 40 倍的放大率，并可视化 purkinje 细胞。

然后，开始捕捉它们。要在微解后开始RNA采集，在不透明盖上加入50微升细胞解液缓冲液，盖朝上。小心地将管子合上盖子，然后按照文本协议中概述的继续收集。

在此协议中，新鲜、冷冻、死后、人脑组织为紫外线激光捕获微切除做好准备。在分配的绘制时间中进行低温统计的剖切后，小脑的细胞层很容易看到，有五倍和十倍的物镜。如这里所见，适当的二甲苯孵化会导致组织变得更暗，比单独使用乙醇更好地描绘细胞层。

在激光采集显微镜下切割时，需要 40 倍的客观透镜，以确保只捕获纯金耶细胞，而不是周围组织。如这里所示，与乙醇固定相比，在二甲苯中适当的孵育会产生高质量的形态完好无损的图像。然后测试不透明盖的盖板滑动能力，而其他协议则使用充满液体的盖，这些盖可以减少组织可视化，使生成的图像在显微镜下颗粒状和彩虹化。

然而，通过不透明盖的可视化会导致组织外观平滑，在形式上更柔软、更锐利。低功率和高功率下切除的紫金细胞的代表性图像显示精确去除纯金耶细胞体。在此之后，获得高质量的Rnase，用于后续RNA测序。

6个代表性样品进行了RNA提取，并在14微升无酶水中重新释放，所有6个样品产生的高质量RNA，其RNA完整性数等于或大于8。最重要的是要记住的是，组织质量就是一切。甚至切割和滑动放置也会使此协议制作或中断。

按照这个程序，任何研究RNA或DNA的方法可以执行，特别是我们探测我们的RNA差异基因表达，但有关基因调控的其他问题也可以研究。此方法可应用于任何具有特定描述形态的组织类型，这些组织不需要使用抗原或染料特异性试剂来鉴定感兴趣的细胞。我们希望，这项技术将帮助我们了解基本震颤和其他疾病的遗传学，有震颤表型。

本协议中使用的最危险化学品是二甲苯。应在烟罩中正确处理，处理得当，并允许幻灯片充分干燥，直到在开放空间使用。此外，在处理人体样品时，应利用生物危害废物管理和安全性。