一种从人死后小脑激光捕获显微切割浦肯野细胞中提取高质量RNA的可靠方案

本方案具有重要意义，因为它采用无染料的可视化方法，而非基于染料的可视化方法，用于尸检后的人脑组织，有助于保持RNA的完整性。RNA的保存在此方案中具有显著优势，不仅适用于尸检后的人脑组织，也适用于其他RNase活性较高的组织类型。开始时，将组织从冷冻箱中取出，并置于干冰上，运送到冷冻切片机。

将干净的刷子、卡盘和组织放入冷冻切片机中至少20分钟，使其达到最佳温度。对于具有双腔室和标本持温功能的冷冻切片机，将样品温度设为-16摄氏度，腔室温度设为-18摄氏度。将冷冻切片机的切片厚度设为14 µm，修片厚度设为30 µm。

接下来，使用 RNase 去污染剂与 70% 乙醇按 1:1 比例配制的混合液清洁载台，以防止结冰。取一把新的一次性冷冻切片机刀片，并用 RNase 去污染剂清洁。将清洁后的刀片放入载台上的刀片架中。

然后，使用RNase去污染剂清洁防卷板。将清洁后的防卷板固定到载物台上，并等待至少20分钟，使刀片和防卷板温度降至与恒冷箱一致。首先，切取一小块组织用于切片，确保切片中约95%为小脑皮层。

将剩余组织放回干冰或置于零下80摄氏度的冰箱中。接着，以缓慢的环形动作，开始将OCT试剂逐滴加至样品头表面。逐渐叠加OCT，直至形成覆盖样品头、高度约为三毫米的包埋基质。

当OCT部分冻结但仍中心留有少量液体时，将组织置于包埋剂上。让组织在OCT上静置一到两分钟，直至完全冻结。随后，将带有冻结OCT和组织的持样器转移至冷冻切片机的切片臂中。

调整组织，使其与切片刀刃齐平，并将组织在切片臂中静置 20 分钟，以适应新的温度。最关键的步骤是让组织在冷冻切片机的切片臂中充分适应，所需时间应足够长。如果组织发生撕裂，浦肯野细胞的观察将变得非常困难。

建议使用更小、更薄的组织块，以便组织更快地适应环境。此后，缓慢地将组织移近刀片。当组织到达刀片位置后，开始修块过程。

修剪组织两到三次，直至可见皮质层。接着，将防卷板置于冷冻切片机刀片上方并进行对齐。切下4至6个厚度为14 µm的切片，注意切好的切片在防卷板下应保持平整。

将切下的组织片段水平排列在冷冻切片机载物台上。倾斜载玻片，同时拾取所有组织片。组织切片完成后，立即将载玻片放入盛有预冷70%乙醇的染色缸中，置于冰上固定2分钟。

将载玻片转移至含有冰上预冷的95%乙醇的染色架中，孵育45秒。接着，将载玻片放入含有室温100%乙醇的染色架中，孵育2分钟。将载玻片在室温的二甲苯一中浸洗3次。

然后，将切片置于含有二甲苯二的载片架中，在室温下放置5分钟。将切片直立放置于洁净的通风橱中，使其空气干燥至少30分钟。若需保存切片，应将每张切片分别放入单独的50毫升离心管中，并将离心管置于-80°C冰箱中，最多可保存七天。

首先，使用RNase去污染剂清洁显微镜载物台和帽收集臂。戴手套的手将载玻片放置在显微镜上，并将一个500 µL不透明帽放入收集臂中。在低倍镜下，调整不透明帽的位置，使其覆盖小脑组织，确保该帽完全覆盖目镜中可见的整个区域。

使用5至10倍物镜观察小脑各层结构。将光标置于分子层与颗粒细胞层交界处。切换至40倍放大倍数，观察浦肯野细胞。

然后开始采集样本。显微切割后，立即进行RNA收集，将50 µL细胞裂解缓冲液加入不透明的管盖中，管盖朝上放置。小心地将管体盖在管盖上，随后按照文本方案中所述步骤进行后续收集操作。

在此方案中，新鲜、冷冻的死后人脑组织被制备用于紫外激光显微切割。在规定绘图时间内使用恒冷切片机进行切片后，利用5倍和10倍物镜可清晰观察到小脑的细胞层。如图所示，经过适当的二甲苯孵育后，组织颜色变深，细胞层的界限比仅使用乙醇处理时更为清晰。

在使用激光显微切割仪进行切割时，必须使用40倍物镜，以确保仅捕获浦肯野细胞，而不包含周围组织。如图所示，与仅使用乙醇固定的样本相比，经二甲苯适当孵育的样本可获得形态完整、高质量的图像。随后需测试不透明帽盖的盖玻片功能；而其他方案采用液体填充的帽盖，此类帽盖可能降低组织可视性，并导致显微镜下图像呈现颗粒状和虹彩状。

然而，通过不透明帽进行观察会导致组织外观变得平滑，形态更柔和且更清晰。低倍和高倍下的浦肯野细胞切除代表性图像显示，仅浦肯野细胞胞体被精确去除。此后，可获得高质量的RNase，用于后续RNA测序。

六个代表性样本进行了RNA提取，并用14微升无RNase的水重悬，所有六个样本均获得了高质量的RNA，其RNA完整性数值等于或大于8。最重要的是要记住，组织质量至关重要。即使是切片和载片放置的细微操作，也会决定本实验方案的成败。

采用此方法后，可开展任何针对RNA或DNA的研究。具体而言，我们利用该方法检测RNA的差异基因表达，但也可用于探究其他与基因调控相关的问题。该方法可应用于具有明确形态学特征的任何组织类型，且无需依赖抗原或染料特异性试剂来鉴定目标细胞。我们希望该技术将有助于揭示特发性震颤及其他具有震颤表型疾病的遗传学机制。

本方案中使用的最具危害性的化学物质是二甲苯。应在通风橱中正确操作，妥善处理，并确保载玻片充分干燥后，方可于开放空间中使用。此外，处理人类样本时，应遵循生物危害性废物管理和安全操作规范。