Name: 一种从人类死后小脑中的激光捕获微解剖 purkinje 细胞中分离高质量 rna 的不锈钢协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 了解从人类死后小脑中无染色激光捕获微解剖浦肯野细胞并分离高质量RNA的完整实验流程。该方法有效保护RNA完整性，适用于RNA测序等下游分子生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨向纽约脑库（The New York Brain Bank）、Jean Paul Vonsattel 博士和 Etty Cortés 博士致谢，感谢他们在切割和保存用于本实验的冷冻人脑组织样本方面提供的帮助。作者谨向慷慨捐献脑组织用于持续开展特发性震颤研究的个人致以诚挚谢意。Faust 博士和 Martuscello 博士谨向哥伦比亚大学病理学与细胞生物学系致谢，感谢其持续的支持和核心研究空间的提供。作者谨感谢美国国立卫生研究院（NIH）R01 NS088257（Louis/Faust）项目为本研究提供的经费支持。激光显微切割（LCM）图像在哥伦比亚大学赫伯特·欧文综合癌症中心共聚焦与特种显微镜共享资源平台完成，该平台由美国国立卫生研究院资助项目 #P30 CA013696（国家癌症研究所）支持。作者谨感谢 Theresa Swayne 和 Laura Munteanu 在特种显微镜技术方面持续提供的协助。

本方案中使用的所有人类样本均在获得知情同意后获取，并已通过哥伦比亚大学和耶鲁大学的机构审查委员会（IRB）批准。
注意：本实验方案的全部操作均应遵循严格的RNA操作规范，即始终佩戴手套，所有工作表面均需使用RNase去污染剂清洁，所有实验器材和试剂均须无RNA、DNA及核酸酶。
1. 在开始激光显微切割前检测组织 RNA 的完整性
注意： RNA质量检测可通过多种方法进行。应确保检测整个切片来源的RNA，以获得能够代表样本的RNA完整性数值（RIN）。
<ol>
	<li>根据实验设计的参数仔细选择适合的组织样本。若需在冷冻切片机中进行切片，则进入步骤 1.2；若不需要，则相应地处理组织并进入步骤 1.11。</li>
	<li>准备两个干冰容器，容器大小取决于样本数量。
	<ol>
		<li>在第一个干冰容器中，放置一个空的、已标记组织编号的 2 mL 离心管。 
		注意：离心管需冷冻约 10 分钟才能完全冻结。必须在将组织放入前确保离心管已充分冷冻；否则，组织会因管壁温度过高而融化。</li>
		<li>在第二个干冰容器中，放置需进行 RNA 检测的、来自 -80 °C 冰箱的组织样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁冷冻切片机。详细清洁步骤参见步骤 4.7。</li>
	<li>从干冰中取出组织，使用经 RNase 去污染处理的剃须刀片切割一小块组织，组织大小约为 1 cm × 1 cm。</li>
	<li>在冷冻切片机的“持样块”（chuck）上放置一个约 3 mm 高的包埋剂（OCT）小堆，并使其部分冻结。随后将组织置于 OCT 表面，不要压入 OCT 中，仅让其自然贴附在表面即可。</li>
	<li>待 OCT 完全凝固后，将带有组织的持样块安装至冷冻切片机的切片臂上，并将其定位至切片刀前方。</li>
	<li>以 30 μm 的厚度修片，直至组织表面平整。</li>
	<li>切下 300 μm 厚的组织切片，放入已预冷的 2 mL 离心管中，并立即将离心管放回干冰中。</li>
	<li>将组织从持样块上取下，放回干冰中暂存，待后续保存。</li>
	<li>对所有组织重复执行步骤 1.4 至 1.9。</li>
	<li>完成所有样本处理后，使用提供的 RNA 提取试剂盒（材料表 #15）提取 RNA。试剂盒附有详细操作流程，请严格按照说明书操作，包括可选的收集管膜干燥步骤以及可选的 DNase 消化步骤（材料表 #16）。</li>
	<li>通过质量评估生物分析仪检测所提取 RNA 的完整性14。</li>
</ol>
2. 准备激光捕获显微切割切片前的步骤
<ol>
	<li>在进行显微切割（LCM）组织切片前，清洁载玻片架。应在使用前一天进行清洁，以确保过夜完全干燥。 
	注意：载玻片架用于组织切片在乙醇中的固定以及二甲苯中的透明处理。
	<ol>
		<li>载玻片架清洁程序：先用RNase去污染剂冲洗，再用焦碳酸二乙酯处理水（DEPC水）冲洗。倒置放置于无RNA/DNA/核酸酶的洁净表面，避免灰尘或其他空气传播污染物，过夜彻底干燥。 
		注意： DEPC具有高毒性，必须按照环境健康与安全（EH&amp;S）标准对危险化学品的规范进行操作和处置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用RNase去污染剂清洁切片用刷子，并过夜晾干。避免灰尘及其他污染物。</li>
	<li>将膜载玻片置于室温下紫外光照射30分钟。切勿在使用前超过1–2天暴露于紫外光下。此步骤可增强组织与膜载玻片之间的结合力。 
	注意： 步骤2.3可与步骤4合并，使载玻片的紫外处理与组织切片在同一天进行（见步骤4.4）。</li>
</ol>
3. 使用无RNase水和高质量乙醇配制固定液
注意：所有溶液均需在每次实验前新鲜配制。确保已完成步骤 1.1 中的载玻片架清洗程序。所有溶液均在载玻片架中配制。
<ol>
	<li>在一个切片架中加入 30 mL 的 100% 乙醇。</li>
	<li>用无 RNase/DNase/核酸酶的水稀释乙醇。在一个切片架中加入 30 mL 的 95% 乙醇，并置于冰上。</li>
	<li>用无 RNase/DNase/核酸酶的水稀释乙醇。在一个切片架中加入 30 mL 的 70% 乙醇，并置于冰上。</li>
	<li>在两个独立的切片架中各加入 30 mL 的 100% 二甲苯，并标记为 #1 和 #2。</li>
</ol>
4. 准备冷冻切片机以进行组织切片
<ol>
	<li>准备一桶冰用于乙醇溶液，并准备一个装有干冰的容器用于组织。 
	注意：干冰温度极低，操作时需佩戴防护手套。切勿将冰和干冰放置在同一容器中。冰与干冰温度不同，会导致两者在不确定的温度下凝结在一起。</li>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出组织，并置于干冰上，运送至冷冻切片机。</li>
	<li>冷冻切片机设置：
	<ol>
		<li>将切片厚度设为 14 μm。</li>
		<li>修片厚度设为 30 μm，以保留足够的组织量。</li>
		<li>对于具有双温控（腔体与样品持载温度）的冷冻切片机，将腔体温度（CT）设为 -18 °C；对于仅有一个温度设置的冷冻切片机，将温度设为 -17 °C。</li>
		<li>对于具有双温控的冷冻切片机，将样品温度（OT）设为 -16 °C。 
		注意：OT 必须高于 CT，以确保切片均匀。若组织仍出现撕裂，可将 OT 升至 -15 °C，同时将 CT 升至 -18 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织放入冷冻切片机中至少 20 分钟，使其达到最佳切片温度。 
	注意：若组织未达到最佳温度，切片时会撕裂。切勿在前一晚将组织置于 -20 °C 环境中，以免影响 RNA 完整性并防止冰晶形成。应给予组织足够时间平衡至最佳温度，以实现顺畅切片。可在此步骤选择性实施载玻片的紫外照射处理（见步骤 1.3）。</li>
	<li>将“持样头”（chuck）放入冷冻切片机中至少 20 分钟，使其温度降至与冷冻切片机一致。</li>
	<li>将清洁的刷子放入冷冻切片机中至少 20 分钟，使其温度降至与冷冻切片机一致。</li>
	<li>清洁冷冻切片机
	<ol>
		<li>使用 RNase 去污染剂与 70% 乙醇按 1:1 比例混合，并用 RNA/DNA/核酸酶-free 水稀释，清洁切片机载物台，以防止液体在台面结冰。</li>
		<li>用 RNase 去污染剂清洁新的一次性冷冻切片刀片，并将其安装至载物台的刀片夹持器中。至少静置 20 分钟，使刀片温度与冷冻切片机一致。</li>
		<li>用 RNase 去污染剂清洁防卷板，并将其安装至载物台。至少静置 20 分钟，使防卷板温度与冷冻切片机一致。 
		注意：防卷板并非切片必需，但强烈推荐使用。若无防卷板，清洁的刷子可作为替代。若防卷板未达到适当温度，组织在切片时会融化或粘连。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 组织切片
<ol>
	<li>取一小块组织（约 1 cm × 1 cm）用于切片。将剩余组织放回干冰或 -80 °C 冰箱中保存。 
	注意：确保组织切片中约 95% 为小脑皮层，即浦肯野细胞所在区域。</li>
	<li>在“持样头”（chuck）上放置约 3 mm 高的 OCT 包埋剂小堆。以缓慢的环形运动逐层叠加，直至形成一个小隆起。</li>
	<li>当 OCT 部分冻结但仍中心尚存液体时，将组织置于 OCT 表面。切勿将组织深压入 OCT 中。让组织停留在 OCT 表面直至完全冻结，此过程需 1–2 分钟。</li>
	<li>将带有冻结 OCT 和组织的“持样头”安装至冷冻切片机的切片臂上。调整组织位置，使其与切片刀刃齐平。</li>
	<li>让组织在切片臂中静置 15–20&#160;分钟，以适应新温度。 
	注意：根据组织厚度不同，需一定时间进行温度适应。应让组织充分静置，直至可干净利落地切片。可调节 OT 和 CT 以辅助组织温度适应。</li>
	<li>缓慢将组织移近刀刃。当组织接触刀刃后，开始修片。修片厚度应设为 30 μm。</li>
	<li>修片 2–3 次，直至可见皮层各层结构。</li>
	<li>将防卷板置于冷冻切片机刀片正上方，并进行对齐。 
	注意：冷冻切片机内的光线会在刀片与防卷板交界处形成一条银线，表明防卷板已准确位于刀刃正上方。</li>
	<li>开始以 14 μm 厚度进行切片。切片成功时，组织片将在防卷板下方保持平整。 
	注意：若组织粘连，需确保防卷板足够低温。必要时，可在防卷板外侧（不接触载物台的一侧）放置一块干冰，以快速冷却防卷板。</li>
	<li>连续切取 4–6 张切片，并在冷冻切片机载物台上水平排列。</li>
	<li>倾斜载玻片，一次性拾取所有组织片。 
	注意：使用毛刷轻轻抬起组织末端，使其更易于被载玻片拾取。切勿逐张拾取组织，因暴露于室温空气中会降低 RNA 的完整性。 
	警告：切勿让膜接触冷冻切片机的载物台。若膜接触载物台，将开始从玻片上脱落，导致显微切割（LCM）操作时出现错误。</li>
	<li>立即进入第 6 步，切勿延迟固定。</li>
</ol>
6. 组织固定/无染色可视化
<ol>
	<li>立即进入乙醇固定步骤</li>
	<li>将载玻片放入盛有70%乙醇的载玻片架中，冰上孵育2分钟。</li>
	<li>将载玻片放入盛有95%乙醇的载玻片架中，冰上孵育45秒。</li>
	<li>将载玻片放入盛有100%乙醇的载玻片架中，室温孵育2分钟。</li>
	<li>将载玻片在盛有二甲苯1的载玻片架中浸没3次，室温操作。</li>
	<li>将载玻片放入盛有二甲苯2的载玻片架中，室温孵育5分钟。</li>
	<li>在洁净环境中干燥至少30分钟。更长的干燥时间更佳，最长可达60分钟。 
	注意：将载玻片竖立放置于通风橱内干燥。二甲苯具有挥发性。若将载玻片平放，会导致二甲苯在组织切片上积聚，使组织过深染色。</li>
</ol>
7. 可选步骤——玻片保存
<ol>
	<li>将干燥的载玻片分别放入50 mL离心管中（每管一张载玻片），置于-80 °C超低温冰箱中保存，最长可保存7天。 
	注意：载玻片在放入-80 °C超低温冰箱前必须完全干燥。切勿在管内使用干燥剂，因为干燥剂颗粒可能嵌入组织和膜中。确保管盖拧紧；否则在解冻使用时，载玻片表面会产生冷凝水。 
	警告：RNA完整性在7天后会下降，组织可视化质量也会随之降低。</li>
</ol>
8. 解冻保存的载玻片以供使用
<ol>
	<li>使用前1小时，从-80 °C冰箱中取出装有单张切片的管子。</li>
	<li>不要立即打开管子，让管子恢复至室温。仅在管子外部出现冷凝水。</li>
	<li>待管子恢复至室温且所有冷凝水消失后（约30–40分钟），打开管盖，使切片暴露于室温空气中。</li>
	<li>让切片在室温下平衡15–20分钟。将切片留在打开管盖的管子内。 
	注意：切片现已准备好进行激光显微切割（LCM）。</li>
</ol>
9. 浦肯野细胞的激光捕获显微切割：
注意：本实验方案部分仅讨论与捕获浦肯野细胞以进行后续RNA测序相关的具体操作。本部分假设使用者已熟悉紫外激光显微切割仪及其配套软件的操作。
<ol>
	<li>使用RNase去污染剂清洁显微镜载物台和帽收集臂。</li>
	<li>戴手套后，将载玻片放置在显微镜上，并将500 μL不透明帽放入收集臂中。 
	注意：操作过程中始终遵循正确的RNA操作规范，使用RNase去污染剂清洁工作区域，并在接触载玻片或不透明帽时佩戴手套。一旦载玻片和帽放置到位并开始激光捕获，即可脱去手套。</li>
	<li>在低倍镜下，将不透明帽对准小脑组织，确保帽覆盖目镜中可见的整个区域。 
	注意：仅通过显微镜目镜可判断不透明帽是否居中。摄像头画面无法显示帽是否准确对准组织。根据激光捕获显微镜的设计不同，通过不透明帽的观察视野可能仅出现在目镜中，或同时在目镜和摄像头中可见。</li>
	<li>使用5x–10x物镜观察小脑各层结构，并将光标置于分子层与颗粒细胞层交界处（即浦肯野细胞层）。</li>
	<li>切换至40X物镜，观察浦肯野细胞。 
	注意：示例图像参见 图1 和 图2。</li>
	<li>开始捕获浦肯野细胞。 
	注意：进行RNA测序时，至少需要5 ng的RNA。大约1600–2000个浦肯野细胞可提供足够的RNA材料用于测序。RNA在显微镜下可保持稳定长达8小时。收集前应测试紫外能量和紫外聚焦，以确保参数设置正确。随着时间推移，组织会逐渐干燥，可能需要调整紫外能量和聚焦参数。</li>
</ol>
10. 激光显微切割后RNA的收集
<ol>
	<li>配制细胞裂解缓冲液（每次使用前新鲜配制）
	<ol>
		<li>将2-巯基乙醇按1:100的比例（分别为10 μL:1 mL）加入裂解缓冲液中。裂解缓冲液（RLT缓冲液）见于材料表（#14 和 #15）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取50 μL细胞裂解缓冲液加入不透明盖帽中，盖帽朝上放置。小心将管体盖在盖帽上。</li>
	<li>将管子倒置放置1分钟。</li>
	<li>涡旋振荡管子30秒，并迅速离心使裂解缓冲液沉至管底。</li>
	<li>打开管子，重复步骤10.2–10.4。</li>
	<li>将含有100 μL裂解缓冲液的管子以及来自-80 °C冰箱的RNA样品放置于冰上，待所有样本处理完毕后立即进行RNA提取（材料表 #14）。</li>
</ol>

<ol><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+Big+data+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li>
<li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li>
<li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection%3A+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li>
<li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97(2006).</li>
<li>Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahalingam%2C+M+%22Laser+Capture+Microdissection%3A+Methods+and+Protocols%22">Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols</a>. Murray, G. I. , Springer. (2018).</li>
<li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li>
<li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGraeme%2C+MI+%22Laser+Capture+Microdissection.+Third+edn%22">Laser Capture Microdissection. Third edn</a>. , Humana Press. (2018).</li>
<li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor%3A+From+models+to+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+%26+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li>
<li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor%3A+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li>
<li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+changes+in+essential+tremor%3A+33+cases+compared+with+21+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , Pt 12 3297-3307 (2007).</li>
<li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathologic+findings+in+essential+tremor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).</li>
<li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li>
<li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li>
<li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li>
<li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536(2009).</li>
<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li>
<li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442(2017).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues%3A+results+from+a+rapid+human+autopsy+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li>
<li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li>
<li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Carl+Zeiss+Microscopy%22">Carl Zeiss Microscopy</a>. , Carl Zeiss. Germany. (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案经过专门优化，旨在为紫外激光显微切割（UV-LCM）提供一种无需染色即可清晰显示形态学差异组织的方法。该方法在增强组织可视化的前提下，最大限度地保持RNA完整性，以适用于后续的直接RNA测序。能够准确区分不同细胞类型并进行捕获，从而获得尽可能均一的细胞群体，这对于解析人体组织中不同的分子特征至关重要15。在本方案中，组织选择尤为关键，因为未使用任何抗原或染料特异性试剂，因此不适用于需要此类特异性识别的研究。尽管这是本方案的局限性，但其所获得的组织可视化效果和RNA完整性在其他实验设计中仍具有显著优势。目前已有多种其他方案采用不同的染色方法，专门用于紫外或红外激光显微切割（UV-和IR-LCM），以期在染色的同时保护RNA完整性。然而，大多数现有方法至少包含一种染色剂或抗原特异性试剂6,16,17，或仅针对特定细胞类型或器官类型设计（且非人源尸检组织）18</...

激光捕获显微切割（LCM）是一种有价值的研究工具，可分离具有病理学意义的细胞，用于后续以分子为导向的分析评估。在这些异质性组织样本中进行分子分析，并将其与病理学和临床数据相关联，是评估生物学研究转化意义的必要步骤1。在分析来自RNA的基因表达数据时，强烈推荐使用冷冻组织切片，因其可获得高质量且最大量的RNA2。已有充分证据表明，高质量和高产量的RNA对于获得有意义的RNA测序数据至关重要3。然而，在使用新鲜冷冻的死后组织RNA进行LCM时，RNA降解是一个主要挑战，因为降解在死亡后立即发生，其程度受组织采集方法相关多种因素的影响4,5。此外，当需要染色技术以识别组织学细节和细胞鉴定时，RNA降解会进一步加剧。特殊的染色技术，如苏木精与伊红（hematoxylin &amp;#38; eosin）、尼氏染色（Nissl stain）、免疫荧光和免疫组织化学，有助于将细胞与周围间质区分开来，但已被证明会降解RNA并改变转录表达谱6。因此，本实验室建立了一套严格的方案，专门用于在LCM分离浦肯野神经元后，对死后人小脑组织中的RNA进行保存，以用于RNA测序。
在对新鲜冷冻组织进行激光显微切割（LCM）处理时，固定方法对RNA和组织完整性均可能产生不同程度的影响。福尔马林固定是形态学保存的标准方法，但会引起交联反应，可能导致RNA断裂并干扰后续的RNA扩增7。乙醇固定则是RNA提取更理想的替代方案，因其属于凝固性固定剂，不会诱导交联反应1。为了增强组织形态的可视化效果，二甲苯是最佳选择，因为它能够去除组织中的脂质成分。然而，在LCM中使用二甲苯存在已知局限性：组织容易脱水变脆，导致激光捕获时发生组织碎片化7。此外，二甲苯具有挥发性和毒性，必须在通风橱中规范操作。尽管如此，已有研究表明二甲苯在增强组织可视性的同时，仍可较好地维持RNA的完整性8。因此，本实验方案的核心在于采用70%乙醇进行固定和乙醇脱水，随后经二甲苯孵育以获得清晰的组织形态。
需要注意的是，基于激光的显微切割系统有多种不同类型，它们在速度、精度和RNA质量方面已显示出差异。红外（IR）激光捕获显微切割和紫外（UV）激光束显微切割系统是两种几乎同时出现的新型LCM平台8。IR-LCM系统采用一种&#34;接触式系统&#34;，通过将透明热塑性膜直接放置在组织切片上，利用红外激光的聚焦脉冲使目标细胞选择性地黏附到膜上。相比之下，UV-LCM系统是一种&#34;非接触式系统&#34;，其聚焦激光束可切割组织中特定的细胞或区域；根据目前两种商用平台的配置（分别采用倒置或正置显微镜设计），组织可通过激光诱导的压力波克服重力弹射进入收集装置，或依靠重力自然落入收集装置。UV-LCM系统的主要优势包括细胞获取速度更快、非接触方式避免污染，以及由于激光束直径更小而实现更精确的切割9。本实验方案专为UV-LCM系统设计，尚未在IR-LCM系统中进行测试。在任一种UV-LCM系统中，当将细胞累积至收集帽时，不宜使用可增强显微镜下细胞清晰度的盖玻片，因为细胞将无法进入收集帽。因此，为了增强组织可视化效果，我们比较了不透明收集帽与液体填充收集帽的使用效果，其中不透明收集帽专为在UV-LCM系统中实现显微观察时充当盖玻片而设计。而液体填充收集帽可能存在操作困难，因其内部液体容易蒸发，需在显微镜操作过程中频繁补充。时间成为影响RNA稳定性的关键因素，因为捕获的组织会立即溶解7。
本实验室研究伴有原发性震颤（ET）及相关小脑神经退行性疾病患者死后小脑的神经病理学改变。我们已证实，与对照组相比，ET病例中存在以浦肯野细胞为中心的形态学改变，包括浦肯野细胞数量减少、树突退化增加以及多种轴突改变，由此我们提出，浦肯野细胞变性是ET发病机制中的核心生物学特征10,11,12,13。转录谱分析已被广泛应用于多种神经系统疾病，以探索变性细胞改变的潜在分子基础。然而，来自异质性样本（如脑组织区域）的转录谱可能有效掩盖低丰度转录本的表达，和/或削弱仅在少数受影响细胞（如小脑皮层中的浦肯野细胞）中发生的分子变化的检出能力。例如，小脑皮层中浦肯野细胞的数量远远少于丰富的颗粒细胞，比例约为1:3000；因此，要有效靶向其转录组，必须对这些神经元进行特异性分离。小脑皮层具有不同细胞密度和细胞大小的明确分层结构。这种细胞架构非常适合在新鲜冷冻组织样本中进行可视化观察，无需使用含染料的染色试剂。理论上，本方案也可适用于其他具有类似显著组织结构的组织类型。
本方案专为人类死后小脑中浦肯野细胞的可视化而设计。针对多种组织的固定、染色可视化以及RNA保存，已有大量适用于红外激光捕获显微切割（IR-LCM）和紫外激光捕获显微切割（UV-LCM）的实验方案。在设计UV-LCM实验时，研究人员应根据起始材料和终末材料的需求和要求，对方案进行个性化优化。本文结合了多种LCM方案的优点，提出一种改进方法，可在无需使用含染料的染色试剂的情况下，实现死后人脑小脑中浦肯野细胞的有效可视化，并制备高质量RNA用于转录组测序。

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide NF 1.0 PEN</td><td>Zeiss</td><td>415190-9081-000</td><td>适用于组织的膜片。我们不推荐使用玻璃载玻片。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AdhesiveCap 500 Opaque</td><td>Zeiss</td><td>415190-9201-000</td><td>不透明盖帽仅用于增强倒置显微镜下的可视化效果</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td>其他RNase去污染产品也可使用。工作前用于清洁所有表面。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>若使用其他乙醇，需确保其高纯度。对组织固定至关重要。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylenes (Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td>若使用其他二甲苯，需确保其高纯度。对组织可视化至关重要。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>其他无RNA/DNA/核酸酶的水也可使用。仅用于乙醇稀释。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Slide-Fix Slide Jars</td><td>Evergreen</td><td>240-5440-G8K</td><td>任何载玻片架或玻片罐均可使用。使用前必须清洁。用于切片后固定。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 &amp;mu;m</td><td>Leica Biosystems</td><td>14041933980</td><td>防卷板类型取决于冷冻切片机的型号及其在载物台上的安装位置。不同冷冻切片机要求各异。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758-50mL</td><td>任何供应商的DEPC均可使用。请按照说明进行水处理。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Kimwipes可从任何供应商订购，尺寸不限。用于清洁显微镜和冷冻切片机。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>任何品牌的OCT均可接受。组织不会包埋于OCT中，仅用于将组织固定在“样品头”上。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades</td><td>Thermo Scientific</td><td>4280L</td><td>刀片类型取决于冷冻切片机型号。不同冷冻切片机要求各异。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica Microsystems 3P&amp;nbsp;25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0558768</td><td>样品头类型取决于冷冻切片机型号。不同冷冻切片机要求各异。任一尺寸均可使用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>激光显微切割（LCM）后RNA提取所必需。RLT裂解缓冲液对从不透明盖帽中收集捕获细胞至关重要。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>用于LCM前组织切片样本的RNA提取，以检测起始组织的RNA完整性。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase可去除所有DNA，从而获得纯化的RNA群体。确保DNase现配现用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>购买体积由用户自行决定。必须加入RLT缓冲液以实现细胞裂解。可抑制RNase活性。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Globe Scientific&amp;nbsp;Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-010-092</td><td>任何2 mL、无RNase、无DNase、无人类DNA且无热原的离心管均可使用。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种从人死后小脑激光捕获显微切割浦肯野细胞中提取高质量rna的可靠方案

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

激光捕获显微切割（LCM）是一种有利的工具，可从异质组织中收集细胞学和/或表型相关的细胞或区域。所捕获的产物可用于多种分子生物学方法，以分离蛋白质、DNA或RNA。然而，从死后人脑组织中保存RNA尤其具有挑战性。LCM常用的可视化技术需要组织学或免疫组织化学染色步骤，而这些步骤可能进一步降解RNA。因此，我们设计了一种无染色的LCM可视化方案，旨在保持死后人脑组织中RNA的完整性。由于浦肯野细胞体积较大且具有特征性位置，是实现无染色可视化的理想候选细胞。小脑皮层具有明显的分层结构，各层在细胞密度上存在差异，因此在高倍显微镜下易于识别，是理想的形态学模型。浦肯野细胞是位于颗粒细胞层与分子层之间的大型神经元：颗粒细胞层由大量小型神经元密集排列而成，而分子层的细胞体则较为稀疏。由于这种独特的结构，无染色可视化方法在此具有可行性。其他具有类似表型特征的器官或细胞系统也同样适用该方法。本无染色方案采用乙醇固定新鲜冷冻组织，并使用二甲苯去除脂质，以提高高倍光学显微镜下的形态学可视性。该方案不适用于其他固定方法，专为使用紫外（UV）-LCM系统捕获的新鲜冷冻组织样本设计。本文中，我们提供了一套完整的操作流程，包括新鲜冷冻的死后人脑小脑组织切片与固定，以及通过UV-LCM分离浦肯野细胞后进行RNA纯化，同时保持RNA质量以满足后续RNA测序的要求。在我们的实验条件下，该方案可在无需染色试剂的情况下实现优异的细胞可视化效果，并获得高质量的RNA（RNA完整性数值≥8），完全满足转录组分析实验的需求。

本方案详细说明了为紫外激光显微切割（UV-LCM）制备新鲜冷冻的死后人脑组织的步骤。由于精确切割新鲜冷冻脑组织较为困难，本文对冷冻切片机切片过程提供了详尽的说明和注释。最关键的注意事项是，新鲜冷冻组织温度极低，需要较长时间才能适应冷冻切片机内较高的温度。此步骤不可仓促进行，其在本方案成败中的核心作用再怎么强调也不为过。若组织在冷冻切片机中未得到妥善处理，则后续识别特定细胞或感兴趣区域的尝试将极为困难，甚至无法实现。
经过冷冻切片和规定的干燥时间后，组织即可用于激光显微切割（LCM）。在显微镜下观察时，使用5倍和10倍物镜可清晰看到小脑的细胞层。图1展示了仅用乙醇固定的组织（图1A）以及乙醇固定后经二甲苯孵育的组织（图1B</s...

本方案采用免染色方法，通过激光显微切割技术在人死后小脑的新鲜冷冻组织中可视化并分离浦肯野细胞。本方案的目的是获得足量的高质量RNA，用于RNA测序。

一种从人死后小脑激光捕获显微切割浦肯野细胞中提取高质量RNA的可靠方案

激光捕获显微切割（LCM）是一种有利的工具，可实现细胞学和/或表型相关细胞或组织区域的精确分离与收集。

本方案具有重要意义，因为它采用无染料的可视化方法，而非基于染料的可视化方法，用于尸检后的人脑组织，有助于保持RNA的完整性。RNA的保存在此方案中具有显著优势，不仅适用于尸检后的人脑组织，也适用于其他RNase活性较高的组织类型。开始时，将组织从冷冻箱中取出，并置于干冰上，运送到冷冻切片机。将干净的刷子、卡盘和组织放入冷冻切片机中至少20分钟，使其达到最佳温度。对于具有双腔室和标本持温功能的冷冻切片机，将样品温度设为-16摄氏度，腔室温度设为-18摄氏度。将冷冻切片机的切片厚度设为14 µm，修片厚度设为30 µm。接下来，使用 RNase 去污染剂与 70% 乙醇按 1:1 比例配制的混合液清洁载台，以防止结冰。取一把新的一次性冷冻切片机刀片，并用 RNase 去污染剂清洁。将清洁后的刀片放入载台上的刀片架中。然后，使用RNase去污染剂清洁防卷板。将清洁后的防卷板固定到载物台上，并等待至少20分钟，使刀片和防卷板温度降至与恒冷箱一致。首先，切取一小块组织用于切片，确保切片中约95%为小脑皮层。将剩余组织放回干冰或置于零下80摄氏度的冰箱中。接着，以缓慢的环形动作，开始将OCT试剂逐滴加至样品头表面。逐渐叠加OCT，直至形成覆盖样品头、高度约为三毫米的包埋基质。当OCT部分冻结但仍中心留有少量液体时，将组织置于包埋剂上。让组织在OCT上静置一到两分钟，直至完全冻结。随后，将带有冻结OCT和组织的持样器转移至冷冻切片机的切片臂中。调整组织，使其与切片刀刃齐平，并将组织在切片臂中静置 20 分钟，以适应新的温度。最关键的步骤是让组织在冷冻切片机的切片臂中充分适应，所需时间应足够长。如果组织发生撕裂，浦肯野细胞的观察将变得非常困难。建议使用更小、更薄的组织块，以便组织更快地适应环境。此后，缓慢地将组织移近刀片。当组织到达刀片位置后，开始修块过程。修剪组织两到三次，直至可见皮质层。接着，将防卷板置于冷冻切片机刀片上方并进行对齐。切下4至6个厚度为14 µm的切片，注意切好的切片在防卷板下应保持平整。将切下的组织片段水平排列在冷冻切片机载物台上。倾斜载玻片，同时拾取所有组织片。组织切片完成后，立即将载玻片放入盛有预冷70%乙醇的染色缸中，置于冰上固定2分钟。将载玻片转移至含有冰上预冷的95%乙醇的染色架中，孵育45秒。接着，将载玻片放入含有室温100%乙醇的染色架中，孵育2分钟。将载玻片在室温的二甲苯一中浸洗3次。然后，将切片置于含有二甲苯二的载片架中，在室温下放置5分钟。将切片直立放置于洁净的通风橱中，使其空气干燥至少30分钟。若需保存切片，应将每张切片分别放入单独的50毫升离心管中，并将离心管置于-80°C冰箱中，最多可保存七天。首先，使用RNase去污染剂清洁显微镜载物台和帽收集臂。戴手套的手将载玻片放置在显微镜上，并将一个500 µL不透明帽放入收集臂中。在低倍镜下，调整不透明帽的位置，使其覆盖小脑组织，确保该帽完全覆盖目镜中可见的整个区域。使用5至10倍物镜观察小脑各层结构。将光标置于分子层与颗粒细胞层交界处。切换至40倍放大倍数，观察浦肯野细胞。然后开始采集样本。显微切割后，立即进行RNA收集，将50 µL细胞裂解缓冲液加入不透明的管盖中，管盖朝上放置。小心地将管体盖在管盖上，随后按照文本方案中所述步骤进行后续收集操作。在此方案中，新鲜、冷冻的死后人脑组织被制备用于紫外激光显微切割。在规定绘图时间内使用恒冷切片机进行切片后，利用5倍和10倍物镜可清晰观察到小脑的细胞层。如图所示，经过适当的二甲苯孵育后，组织颜色变深，细胞层的界限比仅使用乙醇处理时更为清晰。在使用激光显微切割仪进行切割时，必须使用40倍物镜，以确保仅捕获浦肯野细胞，而不包含周围组织。如图所示，与仅使用乙醇固定的样本相比，经二甲苯适当孵育的样本可获得形态完整、高质量的图像。随后需测试不透明帽盖的盖玻片功能；而其他方案采用液体填充的帽盖，此类帽盖可能降低组织可视性，并导致显微镜下图像呈现颗粒状和虹彩状。 然而，通过不透明帽进行观察会导致组织外观变得平滑，形态更柔和且更清晰。低倍和高倍下的浦肯野细胞切除代表性图像显示，仅浦肯野细胞胞体被精确去除。此后，可获得高质量的RNase，用于后续RNA测序。六个代表性样本进行了RNA提取，并用14微升无RNase的水重悬，所有六个样本均获得了高质量的RNA，其RNA完整性数值等于或大于8。最重要的是要记住，组织质量至关重要。即使是切片和载片放置的细微操作，也会决定本实验方案的成败。采用此方法后，可开展任何针对RNA或DNA的研究。具体而言，我们利用该方法检测RNA的差异基因表达，但也可用于探究其他与基因调控相关的问题。该方法可应用于具有明确形态学特征的任何组织类型，且无需依赖抗原或染料特异性试剂来鉴定目标细胞。我们希望该技术将有助于揭示特发性震颤及其他具有震颤表型疾病的遗传学机制。本方案中使用的最具危害性的化学物质是二甲苯。应在通风橱中正确操作，妥善处理，并确保载玻片充分干燥后，方可于开放空间中使用。此外，处理人类样本时，应遵循生物危害性废物管理和安全操作规范。

a-stainless-protocol-for-high-quality-rna-isolation-from-laser

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

一种从人类死后小脑中的激光捕获微解剖 purkinje 细胞中分离高质量 rna 的不锈钢协议

我们描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从死后人脑颞上回第三层的同质细胞群体——锥体神经元中分离并提取RNA的方法。随后，我们对mRNA进行线性扩增（基于T7系统），并将样本杂交至Affymetrix人类X3P微阵列。...

从人死后脑组织的单细胞群体中获取高质量RNA

对小鼠脑部特定区域进行RNA表达谱分析，需要精确且可重复的组织采集策略。本文描述了一种结合冠状面脑切片与组织打孔器辅助显微解剖的技术方案。从所获样本中提取的总RNA产量与质量验证了该方法的实用性。...

一种无需激光捕获显微切割的小鼠脑区精细分离方法，用于总RNA提取及后续的高通量测序与基因表达谱分析

本视频演示了如何使用激光显微切割技术从人死后小脑组织中分离浦肯野细胞。...

激光捕获显微切割法从人死后小脑组织中分离浦肯野细胞

通过在70%乙醇中用Azure B染色小鼠脊髓切片后，利用激光显微切割技术从小鼠脊髓运动神经元胞体中提取了高质量的总RNA。 从3,000至4,000个运动神经元中可回收足量RNA（约40-60...

利用激光显微切割技术从小鼠脊髓运动神经元胞体中制备转录组分析用RNA

对特定组织中部分细胞的基因表达进行分析是一项重大挑战。本文介绍了如何通过将快速免疫标记方法与激光显微切割技术相结合，从特定细胞群体中分离高质量的总RNA。...

使用激光捕获显微切割结合快速免疫标记法从特定细胞亚群中分离RNA

本实验方案的目的是利用激光显微切割技术（LCM），从未经固定、新鲜切除的人类肠道组织中分离肠神经节，并获得高完整性的RNA样本。该方案包括制备速冻的人类肠道组织样本、冷冻切片、乙醇染色与脱水、激光显微切割以及RNA提取等步骤。...

优化激光显微切割技术以分离新鲜冷冻人组织中的肠神经节

本文介绍一种从新鲜或冷冻组织中快速分离高质量细胞核的方案，适用于后续的大规模平行RNA测序。方案中包括去污剂-机械法和低渗-机械法两种组织破碎与细胞裂解方法，均可用于细胞核的分离。...

用于大规模并行单核RNA测序的成年脊髓核的分离

已建立一种激光捕获显微切割（LCM）方案，用于从骨细胞中获取足量且高质量的RNA，以进行基因表达分析。本研究主要针对小鼠股骨切片。然而，此处报道的LCM方案也可用于研究任何硬组织细胞中的基因表达。...

一种可从新鲜冷冻小鼠骨组织中获得高质量RNA的激光捕获显微切割方案

不同的小脑区域被认为在特定行为输出中发挥重要作用，但其潜在的分子机制仍不清楚。本研究描述了一种可重复且快速分离小脑半球皮层、蚓部前部和后部区域以及小脑深部核团的方法，以便通过分离RNA并检测基因表达差异，探究这些区域间的分子差异。...

小脑区域解剖用于分子分析

本研究介绍了一种简单、快速且部分自动化的方案，用于从冷冻的哺乳动物组织中分离高质量的细胞核，以用于后续的单细胞核RNA测序。...

一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核用于单核测序的方案

本方案描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从经多聚甲醛固定、OCT包埋的小鼠肝组织中分离特定组织学区域RNA的方法，可用于靶向性的下游基因表达分析。...

激光捕获显微切割用于RNA分析的多聚甲醛固定小鼠肝组织

了解从人类死后小脑中无染色激光捕获微解剖浦肯野细胞并分离高质量RNA的完整实验流程。该方法有效保护RNA完整性，适用于RNA测序等下游分子生物学研究。

一种从人死后小脑激光捕获显微切割浦肯野细胞中提取高质量RNA的可靠方案

探索更多视频