Name: 基于丝绸的自行式微搅拌器的反应式喷墨打印及推进分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习利用反应式喷墨打印技术制备基于丝绸的自驱动微搅拌器，用于生物医学和环境监测中的微混合应用。该方法可精确控制微搅拌器的形状、尺寸和催化分布，实现生物相容性和可降解性。

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作者感谢英国工程与自然科学研究委员会（EPSRC）通过赵X的丝素材料反应性喷墨打印项目（EP/N007174/1 和 EP/N023579/1）、S. J. Ebbens 职业加速研究员项目以及医疗技术影响力研究员项目（EP/J002402/1 和 EP/N033736/1）提供的支持。作者还感谢中国西南大学家蚕基因组学国家重点实验室的夏庆友博士提供蚕茧材料。

注意：使用过氧化氢、碳酸钠、乙醇、氯化钙和甲醇前，请查阅相关的材料安全数据表。操作本方案中所用化学品时，务必穿戴所有适当的个人防护装备，并使用工程控制措施。
1. 丝素蛋白的提取
<ol>
	<li>用剪刀将5 g清洁的蚕茧剪成约1 cm2的小片。</li>
	<li>在磁力加热板上的2 L烧杯中，将2 L去离子水（DI水）在提取通风橱下煮沸。</li>
	<li>将4.24 g碳酸钠逐渐缓慢加入沸腾的水中，避免溶液溢出，并借助磁力搅拌子帮助其溶解。</li>
	<li>待溶液重新开始沸腾后，将剪好的蚕茧碎片加入溶液中。确保所有蚕丝均浸没于溶液中，并在持续搅拌条件下保持溶液沸腾90分钟。用铝箔轻轻覆盖烧杯，并定期补充预热的去离子水，以补偿因蒸发造成的水分损失。</li>
</ol>
2. 丝素蛋白的干燥
<ol>
	<li>用玻璃棒或刮刀将提取的丝素纤维从碳酸钠溶液中取出，并用1 L预热的去离子水洗涤3次，每次洗涤逐步降低温度（约60 °C、40 °C和室温25 °C）。</li>
	<li>将丝素纤维铺展在750 mL的硼硅酸盐玻璃结晶皿中，置于60 °C常压干燥箱内过夜干燥。干燥后，将丝素纤维储存在密闭容器中，于室温保存。</li>
</ol>
3. 丝素蛋白的溶解
<ol>
	<li>制备一种三元溶液（Ajisawa试剂），其中包含4.8 g去离子水、3.7 g乙醇和3.1 g氯化钙17。</li>
	<li>将一个双颈圆底烧瓶（100 mL）置于水浴中，水浴由一个750 mL的硼硅酸盐玻璃结晶皿盛装600 mL去离子水构成，并放置在磁力加热板上。将上述三元溶液加入烧瓶中。</li>
	<li>将一支温度计插入其中一个瓶颈，以准确监测溶液温度。用铝箔覆盖另一个瓶颈，防止溶液因蒸发而干燥（也可使用水冷回流冷凝器）。将溶液加热至80 °C。 
	注意：确保温度计的感温泡完全浸入溶液中。</li>
	<li>当溶液温度稳定在80 °C时，移去铝箔，向溶液中加入1 g干燥的丝素蛋白。加入一个小磁力搅拌子，以确保溶解过程中溶液充分混合。再次用铝箔覆盖第二个瓶颈以减少蒸发，但保持系统开放。静置溶解90分钟。</li>
</ol>
4. 蚕丝蛋白溶液的透析
<ol>
	<li>溶解 90 分钟后，将丝素蛋白溶液静置 10 分钟，使其冷却至室温。</li>
	<li>取一根 15 cm 长的透析管（截留分子量 12,000−14,000 kDa），将其中一端打结。用自来水流动冲洗数分钟。</li>
	<li>打开另一端，将丝素蛋白溶液倒入透析管中。使用金属夹将透析管另一端尽可能紧密地封闭。通过螺帽将透析管的一端连接至一个空的 30 mL 塑料离心管上，使透析管可在水中漂浮。</li>
	<li>用 2 L 去离子水（DI 水）装满一个 2 L 烧杯，并将透析管放入其中。定期更换水，并在每次换水时检测水的电导率，以监测透析进程。当水的电导率降至 10 µS/cm 以下时，透析步骤即完成。 
	注意：此过程通常需要约 24−36 小时，换水 5 次。</li>
	<li>透析完成后，用剪刀剪开透析管的一端，将溶液转移至一系列 1.5 mL 离心管中。随后在 16,000 × g 条件下离心 5 分钟，以去除丝素蛋白溶液中的任何颗粒物。收集上清液至一个 30 mL 塑料离心管中，并在 4 °C 下保存。</li>
</ol>
5. RSF 溶液浓度的测定
<ol>
	<li>称量一块洁净的玻璃载片（W1），加入 200 µL 丝素溶液（V1）。</li>
	<li>将玻璃载片置于 60 °C 的烘箱中加热 2 小时。</li>
	<li>再次称量玻璃载片（W2）。</li>
	<li>使用以下公式计算丝素溶液的质量体积浓度（w/v）： 
	<img alt="丝素质量体积浓度计算公式，方程：Silk(w/v)=(W2-W1)/V1，用于教学。" src="/files/ftp_upload/59030/59030eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1"></li>
</ol>
6. 打印用油墨的制备
<ol>
	<li>通过混合丝素蛋白溶液（40 mg/mL）、聚乙二醇 400（PEG400；14 mg/mL）和去离子水，制备用于打印 SPMS 主体部分的油墨 A（终体积 1.5 mL）。</li>
	<li>为打印 SPMS 的催化引擎部分，将丝素蛋白（40 mg/mL）、PEG400（12 mg/mL）、过氧化氢酶（6 mg/mL，催化活性 >20,000 单位/mg）和去离子水混合，配制 1.5 mL 的油墨 B。</li>
	<li>将考马斯亮蓝（0.05 mg/mL）溶解于甲醇中，制备 1.5 mL 的油墨 C。 
	注：甲醇用于在油墨 A 或油墨 B 上方打印油墨 C 后，促使丝素蛋白的无规卷曲结构转化为刚性 β-折叠结构。考马斯亮蓝可为 SPMS 提供对比色，便于在推进过程中实现自动追踪。</li>
</ol>
7. 反应性喷墨3D打印
注意：本实验中使用的喷墨打印机基于压电驱动的喷射装置，并配有玻璃喷嘴。目前市面上有多种可供研究使用的商用喷墨打印机，均可实现类似功能。
<ol>
	<li>使用喷射装置，其喷嘴直径为 80 μm，将油墨打印到放置于载物台上的硅基底上，喷嘴与硅片基底之间的工作距离约为 5 mm。SPMS 的几何形状在电子表格文件中以一系列 X-Y 坐标点的形式进行数字化定义。 
	注意：打印机按顺序读取坐标，并相应运行打印程序。每个坐标点使打印机通过喷射装置喷射一次。为油墨 A 和 B 分别创建独立的电子表格文件（参见 补充文件 [SPMS Main Body.xlsx 和 SPMS Engine.xlsx]）。</li>
	<li>将三种油墨（A、B 和 C）分别装入三个储液器中（每个 1.5 mL），然后通过背压阀调节每个独立通道的背压，确保油墨不会从喷射装置滴落。 
	注意：需要三个独立通道的喷射装置。</li>
	<li>调节每个通道的喷射参数（上升时间 1、停留时间、下降时间、回声时间、上升时间 2、空闲电压、停留电压、回声电压），以确保每种油墨均能形成稳定且良好的液滴（图 2）。 
	注意：这些参数依赖于喷射装置和油墨类型，需相应调整。</li>
	<li>在洁净抛光的硅片基底上逐层交替打印丝素蛋白油墨与甲醇：第一阶段，打印油墨 A（主体部分）；第二阶段：打印油墨 C（固化油墨）；第三阶段：打印油墨 B（用于发动机位点的催化油墨）；第四阶段：打印油墨 C（固化油墨）；第五阶段：重复第一至第四阶段，直至达到所需层数（例如 100 层）。 
	注意：补充文件中提供了四个阶段的两个示例设计；SPMS Main Body.xlsx 用于第一和第二阶段，SPMS Engine.xlsx 用于第三和第四阶段。</li>
	<li>分别打印两批厚度为 200 层和 100 层的丝素蛋白 SPMS。 
	注意：过氧化氢酶发动机位于每个搅拌子一端的侧面，因此每个搅拌子具有一个催化发动机（参见 图 1 红色区域）。</li>
	<li>为将样品从硅片上取下，将其浸入去离子水中并轻轻振荡，直至样品脱落。</li>
</ol>
8. 自驱动搅拌器的数据采集/追踪与轨迹分析
<ol>
	<li>用去离子水清洗一个直径为 9 cm 的玻璃培养皿，确保表面无灰尘。</li>
	<li>清洗干净并晾干后，向培养皿中加入 10 mL 预先过滤（0.45 μm）的 5% w/v H2O2 溶液，并静置。使用冷白光发光二极管（LED）光源从下方照亮培养皿，利用配备微距变焦镜头的高速相机从上方拍摄运动过程。将视频保存为 .avi 文件。 
	注意：所用设备的详细信息请参见材料表。</li>
	<li>将打印好的丝素搅拌器浸入去离子水中清洗 10 分钟，以去除未结合的 PEG400。用无菌注射器针尖小心取出一个清洗后的搅拌器，将其置于培养皿中心。当清洗后的搅拌器接触 H2O2 燃料时，发动机周围开始产生气泡，可观察到搅拌器的圆周运动。待系统趋于稳定后（通常约 10−30 秒），在录制软件中点击录制按钮开始视频采集。</li>
	<li>对微搅拌器进行逐帧追踪，追踪其两端位置，如图 3 中 A 和 B 点所示。 
	注意：此步骤可手动完成，也可借助追踪软件辅助进行。</li>
	<li>根据获得的追踪数据，使用下方公式计算连续两帧之间（例如第 1 帧与第 2 帧）的瞬时速度，并对整个序列中所有计算得到的速度取平均值，以获得平均瞬时速度。</li>
	<li>进一步地，计算取向角 φ，并利用 φ 的变化率确定旋转速度（图 3）。 
	<img alt="瞬时速度公式，v_inst=(sqrt((x2-x1)^2+(y2-y1)^2))/Δt_frame；公式示意图。" src="/files/ftp_upload/59030/59030eq2v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
	注意：从追踪图像数据计算瞬时速度时，必须首先拍摄一个已知尺寸物体的初始图像，以便准确换算像素与微米之间的比例关系。该换算值取决于所使用的相机、物镜及拍摄距离。根据打印颗粒的类型，选择不同的追踪点来计算速度。例如，本实验中使用 A、B 及 C 点（质心）三个追踪点来确定瞬时速度（图 3）。</li>
</ol>
9. 使用扫描电镜对SPMSs进行表征
<ol>
	<li>从硅片或块体溶液中取出未使用和已使用的 SPMSs，并将其转移至安装在铝制扫描电子显微镜（SEM）样品台上的 10 mm 宽碳导电胶带上。将样品在 60 °C 的烘箱中干燥 10 分钟。</li>
	<li>将样品台装入溅射镀膜仪的镀膜腔中。在氩等离子体（0.05 Torr）条件下对样品进行溅射镀金，镀层厚度为 50–100 nm，确保样品表面被金层均匀覆盖。</li>
	<li>从溅射镀膜仪中取出样品台，并在真空条件下使用扫描电子显微镜（SEM）以 5.0 kV 的加速电压进行成像。 
	注意：过高的加速电压可能会烧蚀丝素蛋白材料，导致出现伪影。</li>
</ol>

<ol><li>Gregory, D. A., Campbell, A. I., Ebbens, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Catalyst+Distribution+on+Spherical+Bubble+Swimmer+Trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Effect of Catalyst Distribution on Spherical Bubble Swimmer Trajectories.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 119 (27), 15339-15348 (2015).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Inkjet+Printing+of+Functional+Silk+Stirrers+for+Enhanced+Mixing+and+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Reactive Inkjet Printing of Functional Silk Stirrers for Enhanced Mixing and Sensing.</a> Small. , e1804213(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案制备的SPMSs的一个关键特征是，可通过掺入过氧化氢酶等酶的丝素蛋白进行按需喷射（RIJ），快速、简便地设计出不同的形状和结构，并通过气泡推进实现化学驱动运动5。结合这些搅拌器优异的生物相容性18，使其在水体修复领域以及用于医学诊断设备的芯片实验室系统中具有广阔的应用前景。
此处通过采用一种简单的线条设计来展示其推进能力，其中发动机部分被打印在侧边，如图1所示。红色圆点代表掺有具有催化活性的过氧化氢酶的发动机部分，蓝色圆点代表无活性的部分。为了通过按需喷射打印（RIJ）生成三维结构，必须打印多个层以形成z轴方向的高度。在此实验中，沉积在硅片上的层数分别为100层和200层。通过改变层数，可观察到推进速度或旋转速度的差异，其效果相当于沉积了两倍量的材料。为了在喷墨打印过程中获得结构清晰的图案，选择合适的喷射参数至关重要，以实现形态清晰的液滴，如图2所示。这些参数会因所用墨水和喷射装置的不同而有所变化。如果墨水无法产生稳定的液滴，则很可能已不再适合打印，可能已经开始向凝胶状态转变。需要注意的是，分辨率极限在很大程度上取决于所用喷嘴的尺寸，较小的喷嘴能够实现更高的分辨率，并可打印出更小的结构或颗粒。
一个RIJ打印的丝素搅拌棒示例如图所示 图4，其中可见掺入过氧化氢酶的发动机部件（以红色标记区域指示）附着在主体侧面（也可参见示意图 图1 有关详细信息，请参见正文）。打印的丝素蛋白支架是一种允许燃料溶液扩散至整个三维结构的材料，因此在过氧化氢酶催化下过氧化氢分解过程中会产生氧气气泡。释放的氧气气泡在丝素蛋白支架结构中形成微米级孔隙，这一点可通过比较暴露于H₂O₂前后的扫描电镜（SEM）显微图像看出。2O2 燃料图5A）以及H之后2O2 暴露（图 5B）。为了确保观察到的运动是由H的分解引起的2O2 燃料驱动而非通过释放聚乙二醇产生的表面张力驱动400在将搅拌子用于燃料溶液推进之前，应先将其浸入水中至少10分钟，并在去离子水中测试其表面张力驱动的运动性能。
如 Gregory 等人先前所述5，使用 PEG400 可促进气泡从丝素蛋白表面更有效地释放19，但也可能引发由表面张力驱动的推进运动，这在某些应用中可能是有利的，具体取决于实际需求20。第二种机制还使得能够制备具有两种时间依赖性驱动机制的丝素蛋白微球（SPMSs），这对于某些特定应用可能具有优势，例如在初始阶段需要剧烈搅拌，随后在较长时间内维持缓慢持续搅拌的情况20。
总之，通过使用 RIJ 技术制造自主自驱动装置，可以轻松设计和打印出各种形状和尺寸。以蚕丝作为装置的基础材料，能够方便地将酶和其他分子基团封装到结构中，从而为这些装置赋予额外功能。

人工自驱动微搅拌器（SPMSs）采用多种推进机制产生运动，这些机制可分为化学推进1,2,3,4,5,6或物理外部推进。一种常见的化学推进机制是利用催化或酶促活性，通过生成驱动运动的浓度梯度，或产生在脱离时赋予物体动量的气泡来实现推进。以往的研究已探索了多种催化性和化学性SPMSs，包括表面吸附铂纳米颗粒和铬的聚苯乙烯微球1、金-铂双金属Janus纳米棒2、镁基Janus微搅拌器3、由镁核和二氧化钛壳构成并嵌入金纳米颗粒的微搅拌器4，以及支架内嵌入过氧化氢酶的丝素蛋白Janus微火箭5。物理推进机制包括磁驱动7,8、光驱动9和超声驱动10系统，均通过外部物理源进行控制。根据预期应用的不同，SPMS的尺寸可从几纳米到数百微米不等。上述及其他SPMSs的潜在应用示例包括利用芯片实验室设备进行疾病医学诊断11、药物的负载及体内靶向递送12、环境修复3（例如清理油污泄漏）以及对炭疽杆菌（Bacillus anthracis）和神经毒剂等化学与生物战剂进行光催化降解4。由于目标应用不同，理想情况下应能够制造出执行特定轨迹的SPMSs，例如在运输任务中需要长距离直线轨迹，而在微混合应用中则需要旋转轨迹。本文重点关注用于搅拌应用的旋转运动。
目前尚无单一公认的SPMSs制备方法，但在医学和环境应用中，必须使用一种生物相容、可生物降解、环境友好、易于获取、成本低廉且无需复杂设备即可方便地制备复杂SPMSs的材料。再生丝素蛋白（RSF）正是满足所有这些条件的材料之一，同时还获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。
丝素蛋白是一类多种天然纤维状蛋白质的通称，其中最广为人知的是家蚕（Bombyx mori）幼虫在化蛹前产生的丝。这些蚕茧由一种称为丝素蛋白（fibroin）的纤维状蛋白质构成，并由另一种名为丝胶蛋白（sericin）的蛋白质粘合在一起。研究发现，丝素蛋白（SF）具有优异的力学性能、生物相容性和可生物降解性13，使其成为制备SPMSs的理想材料。SF存在三种多晶型结构，分别为丝素I型、II型和III型。丝素I型是一种水溶性的亚稳态结构，主要包含螺旋结构和无规卷曲；丝素II型为不溶于水的结构，主要由反平行β折叠片层组成的结晶态丝素；丝素III型则是一种三重聚甘氨酸II型螺旋结构，存在于丝素溶液的水-空气界面。与其他纤维状蛋白质类似，SF具有重复的氨基酸序列单元。天然蚕茧中的SF由三种主要的六肽重复单元（GAGAGX）组成，其中X可以是A、S或Y。通过氢键作用，(GA)n序列形成反平行β折叠结构，再通过范德华力进一步堆叠，形成疏水性纳米结晶结构14,15。
通过利用天然存在的酶在液体介质（燃料）中产生浓度梯度或气泡以驱动推进，可进一步提高生物相容性。因此，在本研究中，使用过氧化氢作为水相燃料介质，以酶过氧化氢酶作为&#34;发动机&#34;来实现推进。过氧化氢酶是一种存在于几乎所有生物体中的酶，可催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气16。氧气泡从SPMSs的酶作用位点释放，对物体施加作用力，使其向气泡释放的反方向运动5（图1）。
在催化驱动的自推进微系统（SPMS）中，催化位点的不同位置会导致不同的推进行为和运动轨迹1。为了开发高效的微搅拌器，有必要制备具有明确几何形状和发动机位置的搅拌器，并比较不同发动机的功率。本文介绍了如何利用反应性喷墨打印（RIJ）技术在毫米尺度上制备再生丝素蛋白SPMS，以促进此类研究。喷墨打印是一种非接触式材料沉积方法，能够高精度地生成各种复杂结构，使小型复杂结构的制造变得简便。当两种或多种不同的反应性材料被沉积并在基底上发生反应生成目标产物时，即发生反应性喷墨打印（RIJ）。因此，通过将催化搅拌位点偏心打印，可使微系统产生不对称性，从而实现旋转运动。该方法还便于根据计算机辅助设计（CAD）定义的多种形状和结构配置批量制造微搅拌器，从而在实际应用中更易于精确控制所需的运动模式。最后，本文还展示了制造具有不同厚度、并表现出不同推进特性的打印器件的能力。
本研究提供了利用再生丝素蛋白（RSF）在微米至毫米尺度上制造SPMS的蓝图。采用RIJ技术制造RSF微搅拌器，为从原位生成的支架或水凝胶等材料高通量、多功能地生产微搅拌器开辟了新途径，而这些材料通常无法通过蒸发等其他方法进行沉积或加工。经过适当的进一步功能化修饰（如酶修饰）后，这些SPMS可用于环境修复3，例如清除生物毒素、有机污染物以及化学和生物战剂4。

<table><tbody><tr><td>碳酸钠</td><td>Alfa Aesar</td><td>11552</td><td>无水，99.5%，颗粒状</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fluka Analytical</td><td>C1016</td><td>无水，&gt;93%，颗粒状</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>菲舍尔科学</td><td>10542382</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>PEG-400</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>202398</td><td>平均 Mn 400，四聚体分子量约 250 kDa&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>西格玛生命科学</td><td>E3289</td><td>&gt;20K 单位</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Acros Organics</td><td>268280025</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td>30% (w/w)</td></tr><tr><td>蚕丝</td><td>中国西南大学</td><td>NA</td><td>生丝茧，家蚕（Bombyx Mori）</td></tr><tr><td>透析管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9777</td><td>纤维素，平均扁平宽度 25 mm，典型截留分子量 = 14000</td></tr><tr><td>Fisherbrand Hoffman 夹子&amp;nbsp;</td><td>菲舍尔科学</td><td>12744396</td><td>用于封闭透析管末端的夹子</td></tr><tr><td>硅片</td><td>Sigma Aldrich</td><td>647535</td><td>用作打印基底</td></tr><tr><td>天平</td><td>OHAUS Pioneer&amp;nbsp;</td><td>PA214C&amp;nbsp;</td><td>分析天平</td></tr><tr><td>电导率仪</td><td>Mettler Toledo</td><td>FG3</td><td>Mettler Toledo FiveGo 便携式电导率仪</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>10355052</td><td>Thermo Scientific 销售的 Heraeus Biofuge fresco 离心机</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Stuart</td><td>US152</td><td>Stuart US152 磁力搅拌器</td></tr><tr><td>相机</td><td>PixeLink</td><td>PL-D732CU-T</td><td>高速彩色相机</td></tr><tr><td>镜头</td><td>Navitar</td><td>Navitar 1-60135</td><td>宏变焦镜头</td></tr><tr><td>喷射装置</td><td>Microfab Technologies Inc.</td><td>MJ-AT-01-40-8MX</td><td>喷嘴直径 80 µm 的喷射装置</td></tr><tr><td>MJ-AT-01-80-8MX</td><td>喷嘴直径 80 µm 的喷射装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光源板</td><td>AGPTEK</td><td>UN-HL0245-EUUN</td><td>用于游泳实验的照明光源</td></tr><tr><td>移液器</td><td>艾本德</td><td>3123000063</td><td>单通道，可调式，&amp;nbsp;100&amp;nbsp;&amp;ndash;&amp;nbsp;1,000&amp;nbsp;&amp;micro;L，蓝色</td></tr><tr><td>3123000055</td><td>单通道，可调式，20&amp;nbsp;&amp;ndash;&amp;nbsp;200&amp;nbsp;&amp;micro;L，黄色</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>尼康</td><td>LV100ND</td><td>手动直立显微镜</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>Fei</td><td>F50</td><td>用于扫描电子显微成像</td></tr></tbody></table>

基于丝素蛋白的自驱动微搅拌器的反应性喷墨打印及推进力分析

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

本研究报道了一种利用反应性喷墨打印技术制备具有明确定义形状的酶驱动丝素微泳动器的实验方案。所制得的器件属于无需外部驱动即可自主运动的自推进物体，其在医学和环境科学领域具有广泛的应用潜力，包括微尺度搅拌、靶向治疗递送以及水体修复（例如清除油污）等多种用途。该方法采用反应性喷墨打印技术，通过将水溶性的再生丝素蛋白（丝I型）转化为不溶性的丝素蛋白（丝II型），形成具有精确形貌的微尺度固态丝结构。此外，在特定区域选择性地掺杂酶——过氧化氢酶，以实现通过气泡生成与脱离而驱动运动。打印层数决定了器件的三维（3D）结构，本文也报道了该参数对推进轨迹的影响。实验结果表明，通过调节打印结构的尺寸可有效调控其运动行为。

煮沸蚕丝后，干燥的纤维重量应比处理前减轻约三分之一，表明丝胶蛋白已成功去除。在Ajisawa试剂中溶解蚕丝的过程中，纤维应完全溶解，得到黄色黏稠液体。透析后，蚕丝溶液的黏度应有所降低，但仍呈现微黄色。如果蚕丝已形成凝胶，则表明溶解过程未成功。
喷墨装置形成的稳定液滴将实现打印样品的更高分辨率。 图2 显示了一个稳定的单个液滴示例，可获得良好的打印效果，例如所示的打印丝质搅拌棒 图4根据墨水的黏度不同，在基底上出现扩散是正常现象。
根据所使用的喷墨打印机及液滴尺寸，需要调整每个打印液滴之间的距离，以使它们相互重叠形成连续的线条。如果液滴间距过大，打印结构将会断裂。此外，如果打印的层数不足，微搅拌器在放入燃料溶液时可能发生断裂。一旦将搅拌器从基底上取下并清洗后，将其放入过氧化氢燃料溶液中应立即产生气泡。良好的气泡释放成功率在很大程度上取决于酶的活性；若酶活性较低，则形成的气泡较少，从而导致推进效果不佳。图5展示了由于气泡从内部结构释放并形成微小孔隙，导致搅拌器表面形貌发生变化的情况。成功的微搅拌器应与图6以及两个补充视频Supplemental Videos S1和S2中所示的样品相似。
图6展示了两种典型的微搅拌器在5% H2O2燃料中的静态视频帧：分别为100层（图6A）和200层（图6B）。红色和绿色线条表示追踪的运动轨迹（见补充视频S1和S2）。旋转速度可通过取向角（ɸ，图3）随时间的变化率来确定，如图7所示。对比100层和200层掺杂过氧化氢酶的微搅拌器，其旋转速度显著提高了约0.6倍，从60 ± 6 rpm增加至100 ± 10 rpm（图7）。
<img alt="过氧化氢的催化分解，2H2O2→2H2O+O2，运动示意图，化学反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：搅拌子支架中特定位置（以红色显示）嵌入的过氧化氢酶催化过氧化氢分解为水和氧气的示意图。反应生成的氧气气泡为搅拌子的运动提供了必要的推进力。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微流控实验中液滴形成的序列，显示间隔为100毫秒的液滴。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：丝素蛋白（RSF）从喷射装置（喷嘴直径80 µm）中形成液滴的时间推移图像。 图像下方的数字表示自丝墨液滴喷射开始以来经过的时间，单位为微秒（µs）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示角度 φ、运动方向、路径 A-B-C 及跟踪点的机械运动示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：连续两帧图像中粒子追踪的示意图。A 和 B 表示跟踪点，C 表示质心。φ 表示取向角度。SPMS 的轨迹方向由黑色曲线箭头表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="过氧化氢酶活性；显微镜图像；酶定位；反应位点；生物化学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：清洗前新近通过 RIJ 打印的微搅拌器（100 层）的光学显微图像。 红色框标示掺入过氧化氢酶的区域（发动机区域）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="过氧化氢处理前后毛发表面变化的扫描电子显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：气泡释放导致形成孔隙后，SPMS 主体结构与过氧化氢酶发动机部分的扫描电镜图像。 在 SPMS 的扫描电镜图像中，可明显观察到由氧气气泡释放引起的发动机表面孔隙。（A）暴露于 5% w/v H2O2 燃料溶液前的丝素微搅拌器。（B）暴露于 5% w/v H2O2 燃料溶液后的丝素 SPMS。右侧图像为红色区域的放大图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="延时粒子轨迹分析、实验示意图、粒子运动追踪。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：在5%燃料溶液中两个微搅拌器的视频帧，显示随时间变化的运动轨迹。 （A）100层微搅拌器。（B）200层微搅拌器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的角度取向；100层与200层的比较图，科学数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：100层（60 ± 6 rpm）与200层（100 ± 10 rpm）微搅拌子取向角（φ）的比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充视频 S1：在 5% w/v H2O2 中进行自驱动运动的典型 100 层自驱动微搅拌器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/Video_1.mp4">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 S2：在 5% w/v H2O2 中进行自驱动的典型 200 层自驱动微搅拌器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/Video_2.mp4">请点击此处下载该文件。</a>

本方案展示了利用反应性喷墨打印技术制备可自主运动、生物相容且环境友好的微搅拌器，可用于生物医学和环境领域的应用。

本研究报道了一种利用反应性喷墨打印技术制备具有明确定义形状的酶驱动丝素微泳器的实验方案。

我们能够制备出适用于微混合应用的多功能、生物相容且可生物降解的丝素微米马达，可用于酶活性检测增强、熔岩石芯片诊断以及环境监测与修复。通过采用反应性喷墨打印技术制备酶驱动和马兰戈尼效应驱动的丝素微米搅拌器，可快速、简便地调控其形状、尺寸、催化剂分布，并将其他分子组分掺入结构中，从而精确控制其运动轨迹、行为及功能。此外，反应性喷墨打印技术还可使用除丝素外的其他水相反应性墨水制备微米马达装置，充分展示了该方法的高度通用性。演示该操作的人员将是我实验室的博士生 Ana Jimenez-Franco。首先，用剪刀将五克洁净的蚕茧切成一平方厘米大小的小片。在通风橱中，用磁力加热板将两升去离子水在两升烧杯中煮沸。将磁力搅拌子加入去离子水烧杯中。然后缓慢加入 4.24 克碳酸钠，以避免溶液沸腾溢出，并使其充分溶解。待溶液再次开始沸腾后，将剪碎的蚕茧 pieces 加入溶液中。确保所有丝线完全浸没，并在持续搅拌下加热溶液90分钟。用铝箔覆盖烧杯。90分钟后，用玻璃棒将提取的丝素蛋白纤维从碳酸钠溶液中取出。用一升预热的去离子水将丝素纤维清洗三次，每次清洗时逐渐降低水温。将丝素纤维铺展在750毫升的硼硅酸盐玻璃结晶皿中，并在60摄氏度、常压条件下放入干燥烘箱中过夜干燥。干燥后，将丝素纤维置于密闭容器中，室温保存。制备一种三元溶液，其中包含 4.8 克去离子水、3.7 克乙醇和 3.1 克氯化钙。先将氯化钙溶解于去离子水中，然后加入乙醇。将一个 100 毫升双口圆底烧瓶置于磁力加热搅拌器上的水浴中。然后将三元溶液加入烧瓶中。接着，将温度计插入烧瓶的一个瓶口中，以准确监测溶液温度。用铝箔覆盖另一个瓶口，防止溶液因蒸发而干燥。然后，将溶液加热至 80 摄氏度。当溶液温度稳定在 80 摄氏度时，移去铝箔，并向溶液中加入一克干燥的丝素蛋白。加入一个小型磁力搅拌子，以确保在溶解过程中溶液充分混合。用铝箔覆盖烧瓶的第二个瓶口以减少蒸发，并静置溶解90分钟。溶解90分钟后，让丝素蛋白溶液冷却至室温，持续10分钟。在一根15厘米长的透析管的一端打一个结。用自来水流动冲洗试管数分钟。打开透析管的另一端，加入丝素蛋白溶液。使用金属夹夹紧透析管的另一端，确保尽可能紧密封闭。通过螺旋盖将透析管的一端连接到一个空的30毫升塑料小瓶上，以使透析管能够漂浮在水中。接着，将透析管放入盛有两升去离子水的2升烧杯中。定期更换水，并在每次换水时检测水的电导率，以监测透析过程。透析完成后，用剪刀剪开透析管的一端，将溶液倒入一系列1.5毫升离心管中。在16000 × G条件下离心5分钟，以去除纤维蛋白溶液中的任何颗粒。然后，将上清液收集至一个30毫升塑料瓶中，并在4摄氏度下保存。为打印人工自驱动微搅拌器（spms）的主体部分，将丝素蛋白溶液、聚乙二醇400和去离子水混合，制备1.5毫升的墨水A。为打印spms的催化发动机部分，将丝素蛋白溶液、聚乙二醇400、过氧化氢酶和去离子水混合，制备1.5毫升的墨水B。通过将考马斯亮蓝以0.05 mg/mL的浓度溶解于甲醇中，制备1.5毫升的墨水C。使用喷射装置在硅基底上进行打印，喷嘴直径为80微米，将硅片基底置于载物台上，喷嘴与硅片基底之间的工作距离约为5毫米。将墨水A、B和C分别装入三个储液器中，然后通过调节每个独立通道的背压阀来调整背压，确保墨水不会从喷射装置中滴落。接下来，调整每个通道的喷射参数，以确保每种墨水均能形成稳定且良好的液滴。在洁净的抛光硅片基底上，将丝素蛋白墨水与甲醇交替逐层打印。分别打印两批厚度为200层和100层的丝素蛋白微结构。将样品从硅片上取下时，将其浸入去离子水中并轻轻搅动，直至样品脱落。用去离子水清洗一个九厘米的玻璃培养皿，并确保表面无尘。向洁净干燥的培养皿中加入10毫升预先过滤的5%过氧化氢，并静置使其稳定。使用冷白光LED光源照射培养皿底部，然后利用配备微距变焦镜头的高速相机从上方捕捉其运动。接下来，将打印好的丝素搅拌棒浸入去离子水中清洗10分钟，以去除未结合的聚乙二醇400。用无菌注射器针尖小心取一个已清洗的搅拌子，将其置于培养皿的中央。当清洗后的搅拌子接触到过氧化氢燃料时，搅拌子周围开始产生气泡，并可观察到搅拌子的圆周运动。当系统趋于稳定后，在录像软件中点击“录制”以开始视频采集。对微搅拌器进行逐帧跟踪，跟踪搅拌器的每一端。由喷射装置形成的稳定液滴可实现更高分辨率的打印样品，如此处所示。根据所用喷墨打印机的液滴尺寸，需要调整每个打印液滴之间的距离，使其相互重叠，从而形成连续的线条。当丝素蛋白微搅拌器置于过氧化氢燃料溶液中时，由于内部结构释放气泡，搅拌器的表面形貌发生变化，形成微小孔隙。此处展示了两个具有代表性的100层和200层微搅拌器在5%过氧化氢燃料中的静态视频帧。红色和绿色线条表示追踪的运动轨迹。旋转速度可通过此处所示的方向变化率来确定。对掺入过氧化氢酶的100层和200层微搅拌子进行比较，显示其旋转速度显著提高了约0.6倍，从60 ± 6 rpm增加至100 ± 10 rpm。为本实验制备可打印油墨时，关键在于溶解过程中纤维必须完全溶解。该技术使我们能够制备由多种机制驱动的微型搅拌器，适用于搅拌和污染检测研究，我们近期已在《Small》期刊上发表了相关成果。

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

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