使用细胞外通量分析仪检测原代培养小鼠新生心肌细胞的耗氧率

本方案使我们能够分离并培养仅存在于小鼠心肌细胞中的高双极性心肌细胞（bi-BBT）。为了评估线粒体功能，可使用实时银通量分析仪检测心肌细胞的耗氧率。该技术的优势之一在于，可在96孔板的贴壁状态下轻松测定心肌细胞的耗氧量，从而能够在大量重复条件下同时测试多种实验条件。

该装置为心脏病学研究领域提供了重要的研究依据。除了耗氧量外，我们还可以研究其他代谢参数，如灰格里酸和过酸环氧化反应。实现心肌细胞的高变异性对于本实验至关重要。

这需要对心脏进行高效消化。由于新生心肌细胞非常脆弱，轻柔操作心肌细胞也至关重要。在细胞培养超净台中，将5 ml HBSS分装至6孔细胞培养板的每孔中，并置于冰上。

此外，将10 ml HBSS分装至一个10 cm细胞培养皿中，然后在50 ml无菌锥形管中配制20 ml胰蛋白酶预消化液。将所有溶液置于冰上保存。接着，取出心脏并立即转移至含有HBSS的无菌细胞培养皿中。

去除残留的肺组织和较大的血管。用HBSS轻轻振荡洗涤心脏。随后，用精细剪刀将心脏剪成8块，并用镊子将心肌组织转移至含有HBSS的6孔细胞培养板中的一个孔内。

使用莫里亚勺将心脏组织在盛有HBSS的6孔板各孔之间转移，以清洗组织。然后将心脏组织转移至含有20 ml胰蛋白酶的锥形管中，在4摄氏度条件下轻轻振荡孵育4小时。在此步骤中，将胶原酶消化液在37摄氏度水浴中预热。

将含有心脏组织和预消化液的锥形管从4摄氏度转移至细胞培养操作台。让心脏组织沉降至管底，使用10 ml血清移液管移除预消化液。随后，向管中加入10 ml HBSS。

使用10 ml血清移液管用HBSS重悬心脏组织2至3次，以洗去胰蛋白酶。吸除HBSS，向含有心脏组织的试管中加入10 ml预热的胶原酶消化液。第一次消化时，将含有心脏组织的试管置于37摄氏度水浴中孵育10分钟，期间不进行震荡。

随后，将试管转移至细胞培养操作台。使用10 ml血清移液管轻轻重悬组织10次，进行吹打。这将使心脏组织分散，并释放出心肌细胞。

让未消化的组织沉淀。将富含心肌细胞的消化液转移至新的锥形管中，并立即加入等体积的细胞培养基以终止胶原酶消化。然后向含有剩余未消化心脏组织的试管中加入10 ml胶原酶消化液。

进行第二次消化时，将含有心肌组织的离心管置于37摄氏度水浴中孵育10分钟。重复第一次消化的操作步骤，并在终止胶原酶消化前，将富含心肌细胞的消化液转移至新的锥形管中。接着，将无菌细胞筛置于新的无菌50 ml锥形管上。

用 2 至 3 ml 细胞培养基预润湿细胞筛网，并将细胞通过细胞筛网过滤。随后，用细胞培养基冲洗细胞筛网。然后，将含有心肌细胞的锥形管在 180 ×g 条件下离心 5 分钟。

5分钟后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于10 ml细胞培养基中。将细胞接种至10 cm细胞培养皿中，孵育1小时。随后，轻轻振荡培养皿。

用10 ml血清移液管反复吹打培养皿中的培养基，以洗去非贴壁细胞，并重悬细胞。然后，将非贴壁细胞转移至新的10 cm细胞培养皿中，再孵育1小时。1小时后，轻轻振荡培养皿，洗去非贴壁细胞。

将心肌细胞转移至一个新的50 ml锥形管中。接着，通过在96孔细胞培养板的每个孔中分装50微升包被溶液，准备一块96孔培养板。如果存在气泡，使用20微升移液器将其去除。

将培养板置于37摄氏度孵育至少一小时，以使基质包被干燥。随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞以每孔1万至3万细胞的密度接种至包被有细胞外基质的96孔细胞培养板中。

将细胞放入培养箱中。为了进行耗氧量检测，需将通量分析仪传感器 cartridge 至少水化 3 小时，向校准板的每个孔中加入 200 µL 校准液。将传感器 cartridge 放回校准板上，并在 37 °C、无 CO₂ 和 O₂ 补充的条件下孵育至少 3 小时。

在检测前一小时，轻轻吸去细胞培养基，用 200 微升预热的线粒体应激检测试剂重复洗涤细胞两次。第二次洗涤后，加入 175 微升预热的线粒体应激检测试剂。随后将细胞置于 37 摄氏度、无二氧化碳和氧气补充的环境中培养。

用线粒体应激测试培养基配制每种测试化合物3 ml。使用多通道移液器将每种化合物各25微升加入传感器微孔板的加样孔中。细胞状态及任何预处理均可能影响加入解偶联剂FCCP后所引发的最大呼吸响应。

细胞对解偶联剂的敏感性也可能发生变化，因此，针对每种特定处理条件优化FCCP的工作浓度至关重要。随后，建立细胞外通量检测方案并启动程序。首先，将传感器微孔板放入仪器中进行校准。

完成校准步骤后，更换检测板中的校准液。如需要，检测结束后使用多通道移液器小心弃去所有检测培养基，并将细胞培养微孔板于负20摄氏度保存，以备后续通过蛋白检测进行细胞归一化处理。

采用所述方案，从出生第0天的新生幼鼠中分离心脏，并将心肌细胞以每孔1万、2万或3万细胞的密度接种于96孔板中。经过过夜培养后，心肌细胞已良好贴附于包被的塑料表面，未贴壁的细胞极少。此时，可清晰观察到自发性收缩的心肌细胞。

每孔接种密度为 30,000 个细胞，在接种后一天细胞铺展即达到汇合状态。心肌细胞使用抗肌节α-辅肌动蛋白抗体进行免疫染色，该蛋白为心肌细胞特异性标志物。如图所示，大多数细胞均显示α-辅肌动蛋白阳性染色，表明心肌细胞分离具有较高的纯度。

此处展示了一次典型的线粒体应激测试的示意图。线粒体应激测试首先测量氧消耗率的基础值，随后加入寡霉素以抑制ATP合酶。接着，加入解偶联试剂FCCP以测量最大氧消耗率。

最后，加入两种电子传递链复合体抑制剂后，线粒体呼吸完全停止，氧消耗速率（OCR）降至最低水平。为获得一致且可重复的结果，实现细胞高存活率至关重要。

因此，在心肌细胞研究中使用新生的新生儿以及轻柔处理的心脏组织非常重要。通过使用新的或已有的基因操作小鼠品系，该方法可轻松转化为有助于理解心脏生物能量调控新机制的数据。线粒体在心脏功能中发挥着关键作用。

我们预期该方法将有助于鉴定调控氧化代谢的新调控因子和信号通路，并发现治疗心力衰竭的新治疗靶点。