合成用于制备位点选择性修饰免疫偶联物的巯基反应性试剂及其生物偶联方法

本方案描述了PODS的合成及其在蛋白质和多肽位点特异性生物偶联中的应用，PODS是一种新型的生物偶联试剂。该技术相较于传统的马来酰亚胺-巯基生物偶联方法具有显著改进。此方法最大的优势在于试剂制备过程极为简便。

该方法使得试剂几乎可在任何实验室中合成。取100毫克氨基苯并噁二唑硫醇，溶于3毫升甲醇中，置于10毫升圆底烧瓶内。向该溶液中加入360微升二异丙基乙胺及一枚磁力搅拌子。

用橡胶塞密封烧瓶，并在室温下搅拌溶液10分钟。使用一支1毫升玻璃注射器，刺穿橡胶塞，迅速向混合物中加入32微升碘甲烷。在室温下让混合物反应45分钟。

在25毫升圆底烧瓶中，将387毫克Boc保护的羧酸溶解于10毫升二氯甲烷中。向该溶液中加入480微升二异丙基乙胺、264毫克EDCI、200毫克苯胺及一根磁力搅拌子。用玻璃塞密封烧瓶，并在室温下搅拌反应液五天。

反应完成后，将反应混合物转移至分液漏斗中，用五毫升一摩尔的盐酸洗涤三次。收集有机相并转移至分液漏斗中。随后依次用一摩尔的碳酸钠溶液和水洗涤有机相。

接下来，收集有机相并加入硫酸镁以除去残留的水分。然后使用中等玻璃砂芯漏斗过滤混合物。使用旋转蒸发仪在减压条件下除去挥发性溶剂，得到白色至微黄色固体。

随后，将分离得到的固体重新溶解于10毫升乙酸乙酯中。然后通过逐渐加入30毫升环己烷使产物沉淀。使用中等玻璃砂芯漏斗过滤溶液，得到白色粉末状氨基甲酸酯产物。

在10毫升圆底烧瓶中，将30毫克氨基甲酸酯溶解于4毫升二氯甲烷中。缓慢向混合物中加入49毫克70%间氯过氧苯甲酸和一个磁力搅拌子，用玻璃塞密封烧瓶。室温下搅拌溶液过夜，最终得到黄色混合物。

第二天，将混合物转移至分液漏斗中，先用 0.1 摩尔的氢氧化钠溶液洗涤，再用水洗涤。收集有机相，并加入硫酸镁以除去残留的水分。

然后使用中等玻璃砂芯漏斗过滤该混合物。在25毫升圆底烧瓶中，将30毫克氨基甲酸酯溶解于2毫升二氯甲烷中。向该混合物中加入一个磁力搅拌子。

加入400微升三氟乙酸，用玻璃塞密封烧瓶。然后在室温下搅拌反应混合物3小时。反应完成后，使用旋转蒸发仪在室温下减压除去挥发性物质，得到油状残余物。

将油状残留物溶于7 mL水中，转移至分液漏斗中。用4 mL乙酸乙酯分三次洗涤水溶液。

在1.5毫升离心管中，加入10毫克PODS和300微升二甲基亚砜，使其溶解。然后向溶液中加入26微升N,N-二异丙基乙胺。将15.2毫克DOTA NCS溶于100微升二甲基亚砜中，再将该溶液与PODS溶液混合。

密封微量离心管，并在室温下孵育过夜。接下来，在低蛋白结合的1.5毫升微量离心管中，将61 µL的曲妥珠单抗储备液与859 µL的PBS稀释。向此混合液中加入6.7 µL新配制的10 mM TCEP水溶液。

向反应混合物中加入73微升浓度为1毫克/毫升的PODS-DOTA溶液。最后，密封微量离心管，并在室温下孵育溶液2小时。PODS的合成具有良好的稳健性和可靠性。

脱保护并取代氨基苯基噁二唑硫醇得到硫醚化合物一，产率为定量。硫醚化合物一与Boc保护的羧酸发生连接反应，得到化合物二，产率为55%。氧化反应得到化合物三，产率为90%。

去除bocs保护基团后，以98%的产率得到PODS。通过氢核磁共振（¹H NMR）、碳核磁共振（¹³C NMR）和高分辨质谱（HR-MS）确认了各产物的结构。将含有异硫氰酸酯基团的螯合剂DOTA衍生物与PODS的侧链伯胺偶联，以75%的产率获得双功能螯合剂。该产物的结构通过氢核磁共振（¹H NMR）、碳核磁共振（¹³C NMR）和高分辨质谱（HR-MS）确认。本文展示了PODS-DOTA与靶向HER2的抗体曲妥珠单抗进行位点选择性生物偶联的过程。

选择性还原抗体铰链区的二硫键后，将抗体与PODS-DOTA孵育，得到携带DOTA的免疫偶联物，产率为80%。MALDI-TOF分析显示，每分子抗体标记1.8个DOTA，该标记程度在多种人源化、人源及嵌合型IgG1抗体中保持一致。

然而，相同条件下对小鼠 IgG1 抗体产生的免疫偶联物标记程度为 1.5。由于该化合物对光敏感，所有反应均需在用铝箔包裹的容器中进行。这将提高产物的总体得率。

尽管本实验方案描述的是PODS-DOTA的合成，但类似的方法也可应用于多种潜在载荷，包括荧光染料、毒素以及其他螯合剂。该方法将有助于构建结构明确、均一且高度稳定的免疫偶联物，可用于多种不同领域。需要注意的是，本实验第一步中加入的碘甲烷可能具有有害作用，因此应在通风橱中操作。