Name: 小鼠脑脊髓子宫转导后超微结构神经可塑性参数的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学习透射电子显微镜结合子宫内转导技术，研究小鼠神经系统发育过程中的超微结构神经可塑性变化。该方法为先天性神经退行性疾病的转化治疗提供高分辨率成像支持。

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作者感谢德国波鸿鲁尔大学医学院动物实验中心的同事们提供的支持与动物护理。

所有涉及动物的实验程序均已获得德国汉堡州和北莱茵-威斯特法伦州各机构动物伦理委员会的批准。整个手术过程中须使用无菌器械、防护手套和无菌手术衣。
1. 子宫内转导
<ol>
	<li>在 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备编码目标基因的 1 型腺相关病毒（AAV1）（AAV1 浓度为 4 × 1011 病毒颗粒/µL），加入 0.1 mg/µL 的快绿（Fast Green），并将 AAV1-快绿混合液置于 37 °C 条件下保存。</li>
	<li>使用微量移液器拉制仪（参数设置：压力 = 500，加热 = 700，拉力 = 0，速度 = 80，时间 = 200，参见材料表）制备所需形状的细玻璃毛细管尖端（长度 8 mm，外径 80 µm，内径 50 µm），然后将毛细管尖端折断至 4–5 mm 长度。</li>
	<li>将毛细管尖端与吸管管（44 cm × 0.7 cm）组装，吸入 15 µL AAV1-快绿混合液至毛细管中。</li>
	<li>在整个操作过程中，保持实验动物的生理体温恒定在 37 °C。</li>
	<li>将一只妊娠期为 14.5 天的 C57Bl/6 小鼠放入预孵育室中，并使用 4% 气体异氟烷（气流速率为 0.6–0.8 L/min）对其进行麻醉。</li>
	<li>皮下注射布托啡诺（剂量为 0.1 mg/kg 体重）。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于预热的手术板（37 °C）上。</li>
	<li>用润滑剂覆盖小鼠的眼睛。</li>
	<li>在手术板上为小鼠佩戴麻醉面罩（使用 1.5% 气体异氟烷，气流速率为 0.6–0.8 L/min），并剃除腹部皮肤区域的毛发。&#160;用 75% 乙醇擦拭剃毛区域三次，随后使用聚维酮碘溶液擦拭。 
	注意：持续监测麻醉小鼠的呼吸情况。根据小鼠的吸气-呼气模式调整异氟烷气体浓度。</li>
	<li>通过轻捏小鼠后肢脚趾趾骨检查是否存在足底反射缺失。</li>
	<li>使用弯曲带齿虹膜镊（10 cm）夹住皮肤，沿腹中线使用直型碳化钨剪刀（10 cm）剪开皮肤；再使用直型 Dumont 镊子（12 cm，0.2 mm × 0.12 mm）夹住腹膜壁，沿白线使用直型 Vanna 剪刀（8 cm）剪开腹膜壁，以打开腹腔。</li>
	<li>在腹部切口处放置一片带窗的石蜡膜，并使用微型蚊式止血钳（12.5 cm，弯曲型）在两端固定该膜。</li>
	<li>使用勺状器械暴露子宫角，避免损伤子宫角内的胚胎。在子宫角上滴加数滴 PBS（37 °C），并在子宫囊内检查胚胎是否有损伤或畸形。</li>
	<li>记录胚胎在子宫角内的顺序和位置。在子宫囊内小心转动胚胎，直至达到所需的注射位置。</li>
	<li>在体视显微镜下观察注射部位（如脑室）及染料渗透情况，注射 1–2 µL AAV1-快绿混合液。</li>
	<li>记录已注射的胚胎，并将含有已注射胚胎的子宫角放回腹腔内。</li>
	<li>向腹腔内滴加数滴 PBS（37 °C）。使用 Halsted 蚊式止血钳（12.5 cm，弯曲型）缝合腹膜壁（使用 6-0 规格的聚酰胺缝线）和皮肤（使用 3-0 规格的聚酰胺缝线）。&#160;也可采用简单的间断缝合方式，或使用不锈钢缝线/钉合器关闭腹腔和皮肤。</li>
</ol>
2. 分离组织的远程显微摄影
<ol>
	<li>缓冲液的配制
	<ol>
		<li>通过在1 L蒸馏水中加入14.95 g Na2HPO4和2.18 g KH2PO4，并在200 rpm下搅拌溶解，配制Sörensen缓冲液（1 L）。&#160;对于晚期妊娠幼崽和/或出生后阶段幼崽的灌注，应选用合适尺寸的针头进行腹腔或胃内注射，并确保终末用戊巴比妥钠麻醉剂的剂量不超过180 mg/kg体重。</li>
		<li>将500 mL蒸馏水加热至75 °C，边搅拌（200 rpm）边加入50 g多聚甲醛粉末，再加入200 µL 5 N NaOH、1,500 mL Sörensen缓冲液、1,750 mL蒸馏水和500 mL 25%戊二醛，最后用蒸馏水定容至5,000 mL，配制成Mugnaini固定液（5 L）。使用该终末缓冲液进行灌注。 
		注意：应在通风橱内配制Mugnaini固定液，佩戴护目镜，并避免接触挥发气体。可加入亚甲蓝（0.05 g/L）以更清晰地观察灌注过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠灌注与组织分离
	<ol>
		<li>对携带转导胚胎的孕鼠（胚胎研究情况下）或在目标年龄（例如出生后第24天）的已出生转导幼鼠，按照标准操作进行心脏灌注6,7,11,12,13,14,15,16,17，腹腔注射终末用戊巴比妥钠麻醉剂（200 mg/kg体重）。</li>
		<li>使用26 G、1英寸针头经心脏注射肝素溶液（500 U），在固定前经心脏灌注10 mL PBS以冲洗体内血液，随后经心脏灌注30 mL预热至40 °C的Mugnaini固定液。 
		注意：对于成年小鼠，可通过腹主动脉逆行灌注作为替代方法14。</li>
		<li>分离灌注后的目标组织（如全脑或脊髓），并在至少10 mL Mugnaini固定液中于4 °C继续后固定24小时。</li>
		<li>在室温下用10 mL PBS清洗组织3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂糖包埋、记录与切片
	<ol>
		<li>将分离的组织（如全脑）置于具有可重复切片角度的专用模具中8,9,10。也可选用可调节切片厚度的振动切片机。</li>
		<li>将神经组织放入模具中，调整位置以便进行远距宏观成像，并记录其坐标。</li>
		<li>配制3%低熔点琼脂糖包埋介质：将3 g琼脂糖加入100 mL Sörensen缓冲液中，在水浴中加热至90 °C。</li>
		<li>将3%琼脂糖（30 °C）倒入含有组织的模具中，用预热的金属块覆盖模具，静置至凝固。在凝固过程中，使用远距宏观成像设备对包埋组织及其在模具中的坐标进行成像记录。</li>
		<li>将包埋在琼脂糖中的组织转移至另一个切片间隙与前一模具坐标相对应的模具中。</li>
		<li>使用带有薄型振动刀片的设备（见材料表）将包埋组织切成所需厚度的切片（如1.5 mm）。 
		注意：为改善刀片滑动性能，可在包埋组织表面滴加数滴甘油。</li>
		<li>在PBS中对每一片组织切片进行成像，并将图像收集至文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 透射电子显微镜用分离组织的制备
注意：所有后续孵育步骤均需在通风橱内的玻璃培养皿中进行，培养皿需带有可紧密封闭的盖子，并置于摇床上操作。
<ol>
	<li>用 PBS 清洗组织切片，每次 30 分钟，共清洗 2 次。将切片在 2% 的四氧化锇水溶液（OsO4）中室温孵育 2 小时。 
	注意：四氧化锇具有毒性，接触皮肤时可能有害。</li>
	<li>用 PBS 清洗经四氧化锇处理的切片，每次 30 分钟，共清洗 2 次。</li>
	<li>将切片在室温下依次置于 30%、50% 和 70% 的乙醇中孵育 10–15 分钟（可选：在 4 °C 下用 70% 乙醇孵育过夜）。</li>
	<li>在 70% 乙醇中，使用来自左右两侧、角度为 45° 的 LED RGB 光源（2×15 W）对经四氧化锇处理的样本进行成像8,9,10。使用黑色培养皿和哑光黑色背景，以最大限度减少照明过程中的光散射和反射。 
	注意：成像过程中切勿让切片干燥。</li>
	<li>将文件夹中按顺序采集的切片图像及其坐标信息整合，构建切片图像图谱。</li>
	<li>将样本在室温下依次置于 100% 乙醇（2 次，每次 30 分钟）和 100% 环氧丙烷（2 次，每次 30 分钟）中。 
	注意：更换溶液时切勿让切片干燥。</li>
	<li>在玻璃容器中，边用玻璃棒轻轻搅拌，边将 260 mL 树脂与 240 mL 十二烯基琥珀酸酐混合。定期检查是否存在不均匀、气泡或污迹。手动非常轻柔地搅拌至少 45 分钟。</li>
	<li>按 1:2 和 1:1 的比例配制树脂与环氧丙烷的混合液，并加入 3% 的加速剂（2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚）。</li>
	<li>将组织在步骤 3.8 中配制的 1:2 包埋液中孵育 2 小时，随后在步骤 3.8 中配制的 1:1 包埋液中室温旋转孵育 2 小时。</li>
	<li>将组织置于平底聚丙烯皿中，用含 3% 加速剂的新鲜树脂覆盖组织，并在 65–85 °C 下固化 12–24 小时。</li>
	<li>将包埋后的组织冷却至室温，并从聚丙烯皿中取出树脂包埋的样本。</li>
</ol>
4. 超微结构神经可塑性参数的定量分析选择
<ol>
	<li>划定目标区域
	<ol>
		<li>选择一个目标区域（例如海马或小脑），并通过选择包含该区域的图谱图像（步骤 3.5）在图谱中定位该区域。</li>
		<li>将目标区域的边界勾画到切片图像上，并在树脂样本上找到或叠加这些区域边界。</li>
		<li>使用细针头（26 G，1 英寸）在树脂样本上划痕标记目标区域的边界（例如海马或小脑）。</li>
		<li>将树脂样本放入烘箱中加热至 85 °C，以软化树脂便于修块；或者使用修块装置、薄刀片或砂纸进行修块。</li>
		<li>用剃刀刀片从树脂样本中切下目标区域（参见材料表）。使用胶水将样本固定在所需规格的丙烯酸玻璃支撑杆上（例如直径 8 mm，长度 1 cm），并对固定后的样本进行修块，以备半薄和超薄切片。</li>
		<li>使用超薄切片机对修整后的区域制备半薄切片（0.75 µm）和超薄切片（70 nm）：设置切片速度为 1.5 mm/s 以获得 0.75 µm 厚度，设置为 0.7 mm/s 以获得 70 nm 厚度。</li>
		<li>将半薄切片收集到玻璃载片上，并用 1% 甲苯胺蓝 PBS 溶液染色（染色 4 分钟）。</li>
		<li>用去离子水多次清洗切片。在光学显微镜下使用 4x（NA 0.1 ∞/-）、10x（NA 0.22 ∞/0.17）、40x（NA 0.65 ∞/0.17）和 100x（NA 1.25 ∞/0.17）物镜观察染色后的切片。</li>
		<li>将超薄切片收集到镍网上。将镍网置于透射电子显微镜（TEM）下，以 180 kV 电压和 3,200x、6,000x 和/或 8,000x 放大倍数进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电镜分析
	<ol>
		<li>选择用于定量透射电镜分析的超微结构参数（例如含突触小泡的突触小体和线粒体，或有髓和无髓轴突），并在 3,500x、6,000x 和/或 8,000x 放大倍数下拍摄这些参数的透射电镜图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex%3A+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).</li>
<li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li>
<li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+Fine+Structure+of+the+Nervous+System%22">The Fine Structure of the Nervous System</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).</li>
<li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li>
<li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li>
<li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li>
<li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferenzph%C3%A4nomene+am+osmierten+Pr%C3%A4parat+f%C3%BCr+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139(1974).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndres%2C+KH+%22Principle+and+Techniques+of+Electron+Microscopy%3A+Biological+Appliccations%22">Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations</a>. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndres%2C+KH+%22Techniques+in+Neuroanatomical+Research%22">Techniques in Neuroanatomical Research</a>. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).</li>
<li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li>
<li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li>
<li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S%C3%A4ugern%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern.</a> Mikroskopie. 21, 169(1967).</li>
<li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+%C3%A9lectronique.+Essai.+De+g%C3%A9n%C3%A9ralisation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Microscopie%22%5BJournal%5D)">Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li>
<li>Descarries, L., Schröder, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+%C3%A0+grand+debit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Microscopie%22%5BJournal%5D)">Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li>
<li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Records%22%5BJournal%5D)">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84(2014).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48(2017).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).</li>
<li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960(2012).</li>
<li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li>
<li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

子宫内转导的一个关键步骤是注射操作。准确地将物质注射到脑室或其他目标区域需要丰富的经验和实际操作技巧。微毛细管的尖端越细，可能造成的组织损伤就越小；然而，这会增加注射所需的压力。与子宫内电穿孔19,20,21,22相比，子宫内转导后胚胎的存活率非常高。子宫角内的所有胚胎均可进行注射，即使胚胎位于子宫角根部，需要在子宫囊内重新调整位置。注射和分析的发育阶段可根据具体科学问题灵活调整。
当注射到脑室时，AAV1颗粒通过脑脊液分布至整个脑室系统。那些具有与脑脊液密切接触表面的发育中结构，例如海马和小脑，会被所施加的病毒颗粒转导5,6,7。对这些结构中...

光子无法像电子一样穿透超薄组织样本达到其深度级别。这使得透射电子显微镜（TEM）在捕捉精细结构的纳米级分辨率图像方面相比光学显微技术具有不可估量的优势。例如，TEM可用于观察细胞内细胞器，如线粒体、黑色素体以及各种类型的分泌颗粒、微管、微丝、纤毛、微绒毛和细胞间连接结构（细胞表面特化结构），尤其是神经系统中的突触1,2,3,4。本方法学研究的总体目标是通过结合原位转导与透射电子显微技术的最新进展，揭示产前干预条件下神经可塑性发育过程中发生的超微结构变化。已有研究将病毒编码的目的蛋白通过原位转导方式导入中枢神经系统5,6,7，包括脊髓6。例如，原位转导联合TEM技术已被用于研究细胞黏附分子L1在L1缺陷型小鼠运动学习可塑性中的作用，特别是探讨L1与小脑神经元中核受体蛋白之间相互作用的影响7。
分析神经可塑性参数需要关于神经系统内最小区域定位的精确信息。因此，有必要描述超微结构细节及其相对于其他结构的精确拓扑方位。本研究介绍了一种特定的制备方法，旨在基于光学显微镜和电子显微镜对特定形态学区域进行详细研究。该方法结合了多种组织处理技术，首先对小鼠脑和脊髓进行子宫内转导，随后进行灌注固定、模具包埋，并将组织加工用于透射电子显微镜（TEM）观察。在包埋与组织用于TEM加工之间，一个关键步骤是利用干涉反射光技术对组织进行记录，该技术可实现组织样本的精确显微摄影和低倍率成像8,9,10。将该技术整合入本方法中，可使研究人员在组织进行TEM制样前，对其神经组织表面及切片剖面的拓扑结构和形态特征进行观察与分析。
一种用于切取全脑切片的特殊框架与立体定位坐标相对应。该框架有助于神经系统组织内特定区域的形态学三维（3D）重建，并可用于形态计量分析。可视化切片的宏观图像被赋予拓扑坐标，按序列编号的切片构成组织图谱中的定位图谱。
树脂处理后，根据上述组织图谱的地图，将包埋的组织切成含有选定区域的超薄切片（&#60;70 nm）。对这些超薄切片进行透射电子显微镜（TEM）观察，以获得其内容物可塑性参数（例如突触小结或轴突纤维横截面轮廓面积）以及与复杂神经网内邻近结构形成接触的高分辨率图像。
通过本文所述方法，可实现从宏观结构到微观及纳米结构的平滑过渡，从而允许对神经元形态可塑性进行深入的比较研究 在子宫内 发育神经系统的转导

<table><tbody><tr><td>2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚</td><td>Serva</td><td>36975</td><td></td></tr><tr><td>26 G × 1'' 针头</td><td>Henke-Sass, Wolf GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>410 型麻醉气体泵装置</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>8323102</td><td></td></tr><tr><td>腺相关病毒血清型 1 (AAV1)</td><td>UKE (病毒核心设施)</td><td>-</td><td>有关 AAV1 的参考文献和靶向区域，请参见：https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ 以及：Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. 重组腺相关病毒载体（假型化为血清型 1、2 和 5 的病毒衣壳）在递送至中枢神经系统不同区域后表现出不同的转导效率和细胞嗜性。Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. 自互补重组腺相关病毒 (scAAV) 载体可在不依赖 DNA 合成的情况下实现高效转导。McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>低熔点琼脂糖</td></tr><tr><td>空气泵</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>Eheim 100</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂 Araldite</td><td>CIBA-GEIGY</td><td>23857.9</td><td>用于组织包埋的树脂</td></tr><tr><td>移液器调谐组件</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>小鼠用阳极氧化铝呼吸面罩</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Temgesic</td><td>安瓿</td><td>镇痛药</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Science-Products</td><td>GB100TF-10</td><td>带填充丝</td></tr><tr><td>十二烯基琥珀酸酐</td><td>Fluka</td><td>44160</td><td></td></tr><tr><td>杜蒙特镊子 (#3，12 cm，直头，0.2 × 0.12 mm)</td><td>FST</td><td>11203-23</td><td></td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td>Philips</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>强生缝合线 (Ethilon，6-0 和 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>-</td><td>聚酰胺</td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td>Bepanthene</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>快绿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>用于可视化注射液体</td></tr><tr><td>气体路由切换器 4/2 接口</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>8433020</td><td></td></tr><tr><td>哈尔斯泰德蚊式止血钳 (12.5 cm，直头)</td><td>FST</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>25 000 I.E./5 mL</td></tr><tr><td>小鼠诱导箱&lt;br/&gt; 带水平移动盖板。&lt;br/&gt; 内部尺寸：长×宽×高：155 mm × 115 mm × 130 mm。&lt;br/&gt; 壁厚：6 mm</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊 (10 cm，弯头，带齿)</td><td>FST</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪 (11 cm，直头，碳化钨)</td><td>FST</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷手术台，电加热，小型&lt;br/&gt; 外部尺寸：257 mm × 110 mm × 18 mm。&lt;br/&gt; 加热区域：190 mm × 90 mm&lt;br/&gt; 异氟烷从呼吸面罩逸出后的废气&lt;br/&gt; 按照规定向下排放&lt;br/&gt;</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 (Attane)</td><td>JD medical</td><td></td><td>吸入麻醉剂</td></tr><tr><td>LED RGB 灯</td><td>Cameo</td><td>CLQS15RGBW</td><td>LED 灯 2 × 15 W</td></tr><tr><td>基础型倒置显微镜 DM E</td><td>Leica</td><td>-</td><td>配备 4x (N.A. 0.1 &amp;infin;/-)、10x (N.A. 0.22 &amp;infin;/0.17)、40x (N.A. 0.65 &amp;infin;/0.17)、100x (N.A. 1.25 &amp;infin;/0.17) 物镜</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Science-Products</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>蚊式止血钳 (12.5 cm，弯头)</td><td>FST</td><td>13010-12</td><td></td></tr><tr><td>镍网，200 目</td><td>Ted Pella</td><td>1GC200</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇 (OsO₄)</td><td>Degussa</td><td>73219</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Fluka</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Schick</td><td>87-10489</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠 (Narcoren)</td><td>Merial GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TC01mR 单通道带反馈温度控制器</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Technovit 4004 双组分胶水</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>远距离显微装置</td><td>Canon</td><td>-</td><td>佳能 EOS2000D 单反相机，EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM 镜头，延长管总长小于 150 mm，手动延长管（7 mm 环、14 mm 环、28 mm 环），反接环（58 mm），佳能复制支架。</td></tr><tr><td>热拉制仪 P-97</td><td>Sutter Instruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>薄型振动剃刀装置</td><td>Krup</td><td>-</td><td>配备 Szabo 薄刀片</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜 C20</td><td>Phillips</td><td>-</td><td>最高可达 200 kV</td></tr><tr><td>Tygon 6/4 连接管材，用于连接所有部件&lt;br/&gt; 外径：6 mm&lt;br/&gt; 内径：4 mm&lt;br/&gt; 壁厚：&lt;br/&gt; 1 mm</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut E</td><td>Reichert-Jung</td><td>-</td><td>超薄切片机</td></tr><tr><td>Univentor 废气清除装置</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>8338001</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪 (8 cm，直头)</td><td>FST</td><td>15009-08</td><td></td></tr></tbody></table>

子宫内转导发育期小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

本研究结合子宫内转导与透射电子显微镜（TEM）技术，旨在对通过病毒转移方式将目标蛋白引入机体后所影响的明确解剖结构中的超微结构参数进行精确的形态计量学分析。这种联合方法可通过组织图谱中的解剖导航图，实现从宏观结构到超微结构识别的顺畅过渡。对子宫内转导组织进行高分辨率电镜观察，可揭示神经网的精细超微结构及其可塑性参数，包括突触小体横切面面积、小体内突触囊泡和线粒体的数量、突触接触长度、轴突横切面积、髓鞘厚度、髓鞘板层数量以及线粒体轮廓的横切面积等。对这些参数的分析可深入揭示神经系统中受遗传构建体病毒转移影响区域的超微结构可塑性变化。该联合方法不仅可用于研究基因工程生物分子和/或药物对神经可塑性的直接作用，还为研究子宫内神经可塑性修复提供了可能（例如在神经退行性疾病背景下）。

为实现对小鼠可靠且快速的麻醉，已考虑多种安全参数，优化后的麻醉设备工作区域被证明是充分的（图1A）。该设备可精确控制液态异氟烷与环境空气的混合比例，满足对小鼠和大鼠等小型动物进行手术的要求。根据设定参数，在蒸发器中将空气与异氟烷混合后，输送至麻醉箱或通过面罩给予动物（图1A）。废气清除系统可收集并灭活所产生的过量异氟烷气体，从而提供安全的操作环境。气体被收集后通过滤 cartridge 中的活性煤进行处理（图1A）。
一套经过优化的器械（图1B）使科研人员能够快速对怀孕小鼠实施手术。...

透射电子显微镜与宫内转导相结合是一种研究神经系统发育过程中精细超微结构形态变化的有力方法。这种联合技术能够深入揭示神经可塑性相关结构细节的变化及其拓扑表征。

本研究结合子宫内转导与透射电子显微镜（TEM）技术，旨在对……进行精确的形态计量学分析。

我们的综合方法有助于解答在子宫内对发育初期的神经系统进行早期干预后，超微结构神经可塑性参数如何发生变化。本方法的主要优势在于能够在组织图谱预定义的坐标系中，获取宏观、介观、微观及纳米结构的高分辨率图像。该方法的意义在于其对先天性神经退行性疾病具有转化治疗潜力。例如，利用这种子宫内转导技术在胚胎期进行处理和挽救。我们的方法可应用于其他任何模型。例如，可更换小鼠品系，也可更换感兴趣区域。初次尝试本方法的研究人员需要具备扎实的外科手术训练背景，以及掌握如何制备用于电子显微镜成像的组织样本的知识。首先，将含有 4 × 10¹¹ 个腺相关病毒 1 型颗粒（针对所需靶点进行包被）并用快绿染料标记的定制毛细管尖端装载到吸管上。向毛细管中加入 15 µL 标记的腺相关病毒颗粒。接着，确认麻醉后的妊娠14.5天小鼠对脚趾夹捏无反应，并对皮肤进行消毒。使用带锯齿的弯虹膜镊和直的碳化钨手术剪，沿腹中线（linea mediana）做皮肤切口。用直头杜蒙镊夹住腹膜壁，沿白线（linea alba）继续使用直头瓦纳斯剪剪开，并将一片带窗的石蜡膜覆盖在腹腔开口上，然后使用勺状器械暴露子宫角，注意避免损伤子宫角内的胚胎。在子宫角上滴加几滴37摄氏度的PBS后，检查子宫囊内胚胎是否有损伤或畸形。小心地在子宫囊内转动胚胎，直至达到每次注射所需的位置。当胚胎定位完成后，向每个胚胎注射一至二微升含Fast Green标记的病毒颗粒溶液。所有胚胎注射完成后，将子宫角放回腹腔，并向腹腔内加入数滴37°C的PBS。然后使用6-0规格的聚酰胺缝线缝合腹膜壁，使用3-0规格的聚酰胺缝线和Halsted蚊式止血钳缝合皮肤。为对感兴趣的分离组织进行远程宏观摄影包埋，需将组织样本置于具有可重复切面角度的专用框架中，并记录其坐标。将30摄氏度的3%琼脂糖填充至框架中，直至组织被完全覆盖，并用塑料盖盖住框架，等待琼脂糖凝固。在琼脂糖凝固过程中，使用远距宏成像装置对包埋的组织及其在框架内的坐标进行成像。当琼脂糖完全固化后，将包埋在琼脂糖中的组织转移至另一个框架中，该框架的切割间隙需与第一个框架的坐标相对应。使用带有薄而振动的剃须刀片的设备将包埋的组织切成适当实验厚度的切片。然后在磷酸盐缓冲液（PBS）中对每张组织切片进行成像，并将图像收集到一个文件夹中。为透射电子显微镜制备组织样本时，在生物安全柜中，先用 PBS 洗涤组织切片两次，每次 30 分钟，随后在室温下用 2% 的四氧化锇水溶液孵育 2 小时。孵育结束后，用 PBS 再清洗锇酸固定的切片两次，每次 30 分钟，并按照所示步骤将切片依次浸入乙醇中进行脱水，每次乙醇浸泡 10 至 15 分钟。在 70% 乙醇浸泡后，将每个样品置于黑色培养皿中，背景为无光泽黑色，在 LED RGB 光源下从左右两侧以 45 度角照射样品，于 70% 乙醇中对样品成像。将样品图像按顺序收集到一个文件夹中，建立带有坐标的切片图像图谱。将样品在室温下先后进行两次30分钟的100%乙醇孵育，接着进行两次30分钟的100%丙烯酸甲酯孵育。在样品孵育的同时，将新鲜配制的树脂与丙烯酸甲酯按1:1和1:2的比例混合，并向两种溶液中均加入3%加速剂。第二次丙烯酸甲酯孵育结束后，将样品转移至1:2树脂-丙烯酸甲酯包埋介质溶液中，在室温下孵育2小时，随后再转入1:1树脂-丙烯酸甲酯包埋介质溶液中，继续在室温下孵育2小时。第二次孵育结束后，将组织转移至平底聚丙烯培养皿中，并在65至85摄氏度条件下，用含有3%加速剂的新鲜树脂包埋组织，固化12至24小时。随后将组织冷却至室温，并从聚丙烯培养皿中取出树脂包埋的样本。为定位目标区域，从先前制备的图像图谱中选择包含该目标区域的图像。在切片图像上勾画出目标区域的边界，通过显微镜将这些边界光学叠加到包埋的样本上，并使用一英寸26号针头在树脂样本上划出这些区域的边界。然后，将样本加热至95摄氏度，以软化树脂。接着，从烘箱中取出温热的树脂样本，用剃刀刀片切除目标区域。将样品粘接到适当规格的有机玻璃持载棒上，并对已固定的样品进行修整，以制备半薄切片和超薄切片。使用超薄切片机获取0.7微米的半薄切片和70纳米的超薄切片，将半薄切片收集在玻璃载片上，超薄切片收集在镍网上。用含1%甲苯胺蓝的PBS溶液对半薄切片染色4分钟，随后用去离子水多次洗涤，再通过光学显微镜观察切片。超薄切片可直接在180千伏下通过透射电子显微镜进行观察，无需进一步处理。切片完成后，组织切片通过远距离宏观摄影成像，如上所述。经锇酸处理并浸入乙醇后，再通过干涉光远距离宏观成像技术对切片进行二次成像，可显示出每种组织表面特有的彩色图案。经过进一步脱水和树脂包埋后，选择感兴趣的区域并进行透射电子显微镜的后续处理。在海马和小脑中，苔藓纤维突触与其他突触相比具有独特的超微结构特征，包括较大的突触前末梢。在其横截面轮廓中，这些末梢含有大量囊泡和线粒体，并且经常包裹多个树突棘。在脊髓中，背索包含许多由少突胶质细胞髓鞘化的轴突纤维。在横切面上，背索位于脊髓两侧后角之间。在透射电子显微镜图像中，横切的有髓轴突呈圆形，包绕轴突的髓鞘呈层状结构排列。制备好的图谱以及超微结构参数的透射电子显微镜显微图像，不仅有助于在不同处理条件下比较各脑区形态学神经可塑性的差异，也有助于对同一区域内的不同参数进行比较。在开始胚胎内转导实验前，务必进行充分的规划和准备，并确保材料和仪器有备用方案，以应对可能出现的并发症。在采用本方法的基础上，还可结合其他技术，例如在电镜观察前进行免疫胶体金标记，以实现对特定目标分子的超微结构示踪。从整个生物体的整体视角出发，逐步深入到分子层面的拓扑结构，我们能够研究并调控组织功能与形态之间的关系。四氧化锇具有危险性。使用该试剂时，务必在通风橱中操作，并佩戴防护眼镜和手套。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

小鼠脑脊髓子宫转导后超微结构神经可塑性参数的评价

本文介绍了一种利用独特手术方法和特殊形状电极将基因转入发育中 小鼠大脑...

小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

本文详细描述了一种在小鼠胚胎发育第14.5天（E14.5）对大脑皮层和海马体进行子宫内电穿孔的实验方案。我们还证明，该方法是研究这两个脑区中树突和树突棘的有力工具。...

利用可视化与遗传学操作技术研究小鼠大脑皮层和海马中的树突及树突棘 在子宫内 电穿孔

来源： Lutz, D., et al. 在子宫内转导发育中小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估。 J. Vis. Exp.

子宫内小鼠病毒转导

来源：Lutz, D., 等. 小鼠发育中的脑和脊髓宫内转导后超微结构神经可塑性参数的评估。J. Vis. Exp.

利用透射电子显微镜对小鼠脑组织切片进行超微结构分析

尽管下丘脑在功能和医学上具有重要意义， 在子宫内 其发育过程的遗传操作鲜有尝试。本文展示了一种详细的实验流程 在子宫内...

通过遗传操作调控小鼠发育期下丘脑 在子宫内 电穿孔

本方案详细描述了如何通过特定方法转染C57BL/6中枢神经系统的不同区域 in utero...

大脑皮层、海马、丘脑、下丘脑、外侧隔核和纹状体特异性 子宫内 C57BL/6小鼠中的电穿孔技术

本文介绍了一种在新生小鼠中建立可重复性脊髓压迫损伤（SCI）的方法。该模型为研究自发性功能恢复背后的适应性可塑性机制提供了一个有利的平台。...

一种新生小鼠脊髓压迫性损伤模型

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在新的脑区中对年轻神经元进行挑战，可以揭示环境如何塑造神经元命运和成熟过程的重要见解。本方案描述了一种从特定脑区分离中间神经元前体细胞，并将其同位或异位移植到出生后幼鼠脑内的实验方法。...

同龄期中间神经元前体细胞移植至出生后早期小鼠大脑

在本实验方案中，我们描述了如何在E7.5时期向小鼠羊膜腔注射慢病毒，从而实现整个神经板的均匀转导，同时对胚胎存活率或发育过程造成极小的不利影响。...

小鼠胚胎7.5天在体纳米注射靶向神经板（NEPTUNE）技术

学习透射电子显微镜结合子宫内转导技术，研究小鼠神经系统发育过程中的超微结构神经可塑性变化。该方法为先天性神经退行性疾病的转化治疗提供高分辨率成像支持。

子宫内转导发育期小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估

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