子宫内转导发育期小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估

我们的综合方法有助于解答在子宫内对发育初期的神经系统进行早期干预后，超微结构神经可塑性参数如何发生变化。本方法的主要优势在于能够在组织图谱预定义的坐标系中，获取宏观、介观、微观及纳米结构的高分辨率图像。该方法的意义在于其对先天性神经退行性疾病具有转化治疗潜力。

例如，利用这种子宫内转导技术在胚胎期进行处理和挽救。我们的方法可应用于其他任何模型。例如，可更换小鼠品系，也可更换感兴趣区域。

初次尝试本方法的研究人员需要具备扎实的外科手术训练背景，以及掌握如何制备用于电子显微镜成像的组织样本的知识。首先，将含有 4 × 10¹¹ 个腺相关病毒 1 型颗粒（针对所需靶点进行包被）并用快绿染料标记的定制毛细管尖端装载到吸管上。向毛细管中加入 15 µL 标记的腺相关病毒颗粒。

接着，确认麻醉后的妊娠14.5天小鼠对脚趾夹捏无反应，并对皮肤进行消毒。使用带锯齿的弯虹膜镊和直的碳化钨手术剪，沿腹中线（linea mediana）做皮肤切口。用直头杜蒙镊夹住腹膜壁，沿白线（linea alba）继续使用直头瓦纳斯剪剪开，并将一片带窗的石蜡膜覆盖在腹腔开口上，然后使用勺状器械暴露子宫角，注意避免损伤子宫角内的胚胎。

在子宫角上滴加几滴37摄氏度的PBS后，检查子宫囊内胚胎是否有损伤或畸形。小心地在子宫囊内转动胚胎，直至达到每次注射所需的位置。当胚胎定位完成后，向每个胚胎注射一至二微升含Fast Green标记的病毒颗粒溶液。

所有胚胎注射完成后，将子宫角放回腹腔，并向腹腔内加入数滴37°C的PBS。然后使用6-0规格的聚酰胺缝线缝合腹膜壁，使用3-0规格的聚酰胺缝线和Halsted蚊式止血钳缝合皮肤。为对感兴趣的分离组织进行远程宏观摄影包埋，需将组织样本置于具有可重复切面角度的专用框架中，并记录其坐标。

将30摄氏度的3%琼脂糖填充至框架中，直至组织被完全覆盖，并用塑料盖盖住框架，等待琼脂糖凝固。在琼脂糖凝固过程中，使用远距宏成像装置对包埋的组织及其在框架内的坐标进行成像。当琼脂糖完全固化后，将包埋在琼脂糖中的组织转移至另一个框架中，该框架的切割间隙需与第一个框架的坐标相对应。

使用带有薄而振动的剃须刀片的设备将包埋的组织切成适当实验厚度的切片。然后在磷酸盐缓冲液（PBS）中对每张组织切片进行成像，并将图像收集到一个文件夹中。为透射电子显微镜制备组织样本时，在生物安全柜中，先用 PBS 洗涤组织切片两次，每次 30 分钟，随后在室温下用 2% 的四氧化锇水溶液孵育 2 小时。

孵育结束后，用 PBS 再清洗锇酸固定的切片两次，每次 30 分钟，并按照所示步骤将切片依次浸入乙醇中进行脱水，每次乙醇浸泡 10 至 15 分钟。在 70% 乙醇浸泡后，将每个样品置于黑色培养皿中，背景为无光泽黑色，在 LED RGB 光源下从左右两侧以 45 度角照射样品，于 70% 乙醇中对样品成像。将样品图像按顺序收集到一个文件夹中，建立带有坐标的切片图像图谱。

将样品在室温下先后进行两次30分钟的100%乙醇孵育，接着进行两次30分钟的100%丙烯酸甲酯孵育。在样品孵育的同时，将新鲜配制的树脂与丙烯酸甲酯按1:1和1:2的比例混合，并向两种溶液中均加入3%加速剂。第二次丙烯酸甲酯孵育结束后，将样品转移至1:2树脂-丙烯酸甲酯包埋介质溶液中，在室温下孵育2小时，随后再转入1:1树脂-丙烯酸甲酯包埋介质溶液中，继续在室温下孵育2小时。

第二次孵育结束后，将组织转移至平底聚丙烯培养皿中，并在65至85摄氏度条件下，用含有3%加速剂的新鲜树脂包埋组织，固化12至24小时。随后将组织冷却至室温，并从聚丙烯培养皿中取出树脂包埋的样本。为定位目标区域，从先前制备的图像图谱中选择包含该目标区域的图像。

在切片图像上勾画出目标区域的边界，通过显微镜将这些边界光学叠加到包埋的样本上，并使用一英寸26号针头在树脂样本上划出这些区域的边界。然后，将样本加热至95摄氏度，以软化树脂。接着，从烘箱中取出温热的树脂样本，用剃刀刀片切除目标区域。

将样品粘接到适当规格的有机玻璃持载棒上，并对已固定的样品进行修整，以制备半薄切片和超薄切片。使用超薄切片机获取0.7微米的半薄切片和70纳米的超薄切片，将半薄切片收集在玻璃载片上，超薄切片收集在镍网上。用含1%甲苯胺蓝的PBS溶液对半薄切片染色4分钟，随后用去离子水多次洗涤，再通过光学显微镜观察切片。

超薄切片可直接在180千伏下通过透射电子显微镜进行观察，无需进一步处理。切片完成后，组织切片通过远距离宏观摄影成像，如上所述。经锇酸处理并浸入乙醇后，再通过干涉光远距离宏观成像技术对切片进行二次成像，可显示出每种组织表面特有的彩色图案。

经过进一步脱水和树脂包埋后，选择感兴趣的区域并进行透射电子显微镜的后续处理。在海马和小脑中，苔藓纤维突触与其他突触相比具有独特的超微结构特征，包括较大的突触前末梢。在其横截面轮廓中，这些末梢含有大量囊泡和线粒体，并且经常包裹多个树突棘。

在脊髓中，背索包含许多由少突胶质细胞髓鞘化的轴突纤维。在横切面上，背索位于脊髓两侧后角之间。在透射电子显微镜图像中，横切的有髓轴突呈圆形，包绕轴突的髓鞘呈层状结构排列。

制备好的图谱以及超微结构参数的透射电子显微镜显微图像，不仅有助于在不同处理条件下比较各脑区形态学神经可塑性的差异，也有助于对同一区域内的不同参数进行比较。在开始胚胎内转导实验前，务必进行充分的规划和准备，并确保材料和仪器有备用方案，以应对可能出现的并发症。在采用本方法的基础上，还可结合其他技术，例如在电镜观察前进行免疫胶体金标记，以实现对特定目标分子的超微结构示踪。

从整个生物体的整体视角出发，逐步深入到分子层面的拓扑结构，我们能够研究并调控组织功能与形态之间的关系。四氧化锇具有危险性。使用该试剂时，务必在通风橱中操作，并佩戴防护眼镜和手套。