Name: 登革热病毒诱发急性病毒性脑炎样疾病的鼠害模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 23 s
Description: 了解利用低滴度登革热病毒感染免疫健全ICR乳鼠建立急性病毒性脑炎样疾病模型的方法。该体内平台可用于筛选与神经发病机制相关的病毒和宿主因素。

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本研究由科技部（MOST107-2321-B-038-001）和台北中国台湾的校内资助项目106TMU-CIT-01-2提供经费支持。

动物实验方案已获台湾国防医学院机构动物照护与使用委员会批准（IACUC编号：16-261），并遵循中国台湾科技部制定的指导原则。
1. 感染操作步骤
<ol>
	<li>制备非适应性登革病毒2型（DENV2，PL046株）毒株9（最初来源于中国台湾疾病控制中心，滴度范围为2.5 × 107 至 1 × 109 PFU/mL）。</li>
	<li>用RPMI 1640培养基将病毒原液稀释至1 × 106 PFU，总体积为40 μL。</li>
	<li>取一支配有30 G针头的0.3 mL注射器，吸入10 μL稀释后的病毒液（含2.5 × 105 PFU）；另取一支配有30 G针头的0.3 mL注射器，吸入30 μL稀释后的病毒液（含7.5 × 105 PFU）。</li>
	<li>抓握7日龄ICR乳鼠，并执行以下步骤。
	<ol>
		<li>进行颅内注射时，用食指和拇指夹住乳鼠耳廓，使其呈俯卧位，将10 μL稀释病毒液注射至人字缝与矢状缝交点处（即λ点）的颅内区域16。</li>
		<li>完成颅内注射后，用食指和拇指将乳鼠固定为仰卧位，轻柔地将30 μL稀释病毒液经腹腔注射至小鼠腹部。 
		注意：为防止母鼠同类相食，可使用75%酒精暂时消除母鼠的嗅觉感知。此外，建议用母鼠的粪便和尿液覆盖仔鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将乳鼠放回笼中，静置5分钟，观察其刺激后的活动状态，包括行走能力及吸吮母乳情况，以评估其安全性。 
	注意：通常情况下，乳鼠在刺激后表现出正常活动，未见明显不良反应。本实验中，动物饲养与操作均遵循中国台湾国防医学院机构动物照护与使用委员会的规范。</li>
	<li>每日评估乳鼠的体重变化（使用微克天平测量）、急性病毒性脑炎样疾病进展（按第2节所述疾病评分标准）以及存活率9,10,11,12,13,14,15。</li>
</ol>
2. 疾病评分
<ol>
	<li>监测急性病毒性脑炎样疾病的严重程度。健康小鼠评分为0分；出现轻微疾病症状（包括体重减轻、活动能力下降和弓背体态）的小鼠评分为1分；出现边缘系统癫痫发作的小鼠评分为2分；出现边缘系统功能减弱（如行动困难、前肢或后肢无力）的小鼠评分为3分；瘫痪小鼠评分为4分；死亡小鼠评分为5分。 
	注意：当评分达到3分时，认为疾病症状正在迅速进展。</li>
	<li>根据步骤2.1，将每天的疾病评分绘制成曲线图，采用每组每日测试评分的均值±标准差（mean ± SD）表示。</li>
</ol>

<ol><li>Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Dengue infection.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055(2016).</li>
<li>Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue%3A+knowledge+gaps%2C+unmet+needs%2C+and+research+priorities%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities.</a> Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).</li>
<li>Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+complications+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurological complications of dengue virus infection.</a> Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).</li>
<li>Geneva: World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Dengue%3A+Guidelines+for+Diagnosis%2C+Treatment%2C+Prevention+and+Control%3A+New+Edition%22">Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition</a>. , WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).</li>
<li>Amaral, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+infection+with+dengue-3+virus+induces+meningoencephalitis+and+behavioral+changes+that+precede+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 23(2011).</li>
<li>de Miranda, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue-3+encephalitis+promotes+anxiety-like+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice.</a> Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).</li>
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<li>Tsai, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+retard+dengue+virus-induced+acute+viral+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis.</a> Scientific Reports. 6, 27670(2016).</li>
<li>Cheng, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Nrf2+by+the+dengue+virus+causes+an+increase+in+CLEC5A%2C+which+enhances+TNF-alpha+production+by+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes.</a> Scientific Reports. 6, 32000(2016).</li>
<li>Ho, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+dengue+virus+infection+and+viral+cytotoxicity+in+neuronal+cells+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+endocytic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6910(2017).</li>
<li>Jhan, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-TNF-alpha+restricts+dengue+virus-induced+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).</li>
<li>Kao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiparasitic+drug+niclosamide+inhibits+dengue+virus+infection+by+interfering+with+endosomal+acidification+independent+of+mTOR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715(2018).</li>
<li>Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+heat+shock+factor+1+as+an+antiviral+strategy+against+dengue+virus+replication+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo.</a> Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).</li>
<li>Jhan, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+virus+infection+increases+microglial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dengue virus infection increases microglial cell migration.</a> Scientific Reports. 7 (1), 91(2017).</li>
<li>Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+Stereotaxic+Delivery+of+rAAV+and+Special+Considerations+in+Vector+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling.</a> Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).</li>
<li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+encephalitis%2Fencephalopathy+with+reversible+splenial+lesion+%28MERS%29+due+to+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).</li>
<li>Sarathy, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lethal+murine+infection+model+for+dengue+virus+3+in+AG129+mice+deficient+in+type+I+and+II+interferon+receptors+leads+to+systemic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease.</a> Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).</li>
<li>Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dengue+fever+viremia+model+in+mice+shows+reduction+in+viral+replication+and+suppression+of+the+inflammatory+response+after+treatment+with+antiviral+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).</li>
<li>Tyler, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Viral+Encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute Viral Encephalitis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).</li>
<li>Yauch, L. E., Shresta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+dengue+virus+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of dengue virus infection and disease.</a> Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).</li>
<li>Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+dengue+syndrome%3A+subacute+thyroiditis+and+intracerebral+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage.</a> BMC Infectious Diseases. 12, 240(2012).</li>
<li>Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+hemorrhage+in+dengue+fever%3A+management+and+outcome%3A+a+series+of+5+cases+and+review+of+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature.</a> Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).</li>
<li>Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+of+prochlorperazine+for+use+against+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).</li>
<li>Rocha, B. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue-specific+serotype+related+to+clinical+severity+during+the+2012%2F2013+epidemic+in+centre+of+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Poverty%22%5BJournal%5D)">Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil.</a> Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116(2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在重症登革热患者的中枢神经系统中已检测到登革病毒（DENV）感染3,17，提示登革病毒致病过程中可能出现急性病毒性脑炎。本文报道一种用于研究中枢神经系统功能障碍在重症登革病中作用的登革病毒（DENV）感染体内小鼠模型，尤其聚焦于DENV诱导的急性病毒性脑炎样疾病。与以往模型相比，特别是单途径感染模型（仅静脉注射、仅腹腔注射或仅颅内注射），该模型具有极高的病毒滴度（1 × 108 PFU）的DENV用于免疫功能健全的小鼠。然而，在免疫功能低下小鼠中，使用相对较低但可变的滴度（1 x 105 至 1 × 108 PFU）的DENV可进行18,19,20在本研究中，我们采用双途径感染方式，以低滴度（颅内：2.5 × 105 PFU；腹腔内：7.5 × 10...

登革病毒（DENV）是一种节肢动物传播的黄病毒科（Flaviviridae）病毒，其基因组为正义单链RNA，编码三种病毒结构蛋白（衣壳蛋白、前膜蛋白和包膜蛋白）以及七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5）。登革病毒有四种血清型（DENV1-4），每年约感染3.9亿人，尽管各国政府已投入大量资源用于蚊媒控制和疾病防治，但仍对全球公共卫生构成重大负担1。目前，具有保护作用的疫苗和治疗性抗病毒药物尚处于研发阶段，仍需进一步的长期验证2。在临床实践中，虽然登革病毒感染累及中枢神经系统（CNS）的情况较为罕见，但仍需深入研究以全面了解登革病发展的多样性3。尤其值得注意的是，世界卫生组织（WHO）已将中枢神经系统功能障碍（如认知障碍、惊厥、脑病和脑炎）纳入重症登革病的分类标准，因此亟需进一步的研究与验证3,4。构建登革病毒感染的动物模型对于探索其神经致病机制至关重要。
为建立登革病毒（DENV）引起的中枢神经系统（CNS）感染，多项研究采用了不同的DENV感染途径，包括：（1）向接受4 × 103斑块形成单位（PFU）非适应性DENV3的小鼠C57BL/6品系进行颅内接种5,6；（2）向接受7 × 104 PFU体外神经适应性DENV4的BALB/c小鼠进行腹腔接种7；（3）向接受1 × 105 PFU体内神经适应性DENV1的Swiss小鼠进行颅内接种8；以及（4）向接受1 × 106 PFU非适应性DENV2的ICR suckling小鼠进行颅内与腹腔联合接种9。根据这些研究5,6,7,8,9的结果，小鼠感染DENV后可在脑组织中发生病毒复制，导致类似急性病毒性脑炎的综合征，伴随肢体麻痹和姿势不稳等行为改变，以及中枢神经系统神经毒性与炎症反应、通过血脑屏障（BBB）发生的全身性和局部血浆渗漏，并最终导致死亡。所有这些研究5,6,7,8,9的结果均表明，DENV具有感染中枢神经系统的能力，并可在感染后诱发类似急性病毒性脑炎的疾病。
基于我们目前的研究结果9,10,11,12,13,14,15，我们建立了一种登革病毒（DENV）感染的小鼠模型，作为体内平台，用于评估靶向药物/因子对病毒复制及神经毒性的治疗效果。本文报告了用于建立免疫功能健全的远交系ICR小鼠模型的实验方案，以研究中枢神经系统（CNS）感染，并监测由DENV引起的不同程度神经病变的发展过程。结果显示，DENV感染小鼠出现类似脑炎疾病的显著进展，且具有时间依赖性。

<table><tbody><tr><td>罗斯威尔公园纪念研究所1640培养基（RPMI）</td><td>Gibco</td><td>11875-085</td><td>稀释病毒</td></tr><tr><td>0.3 mL 胰岛素注射器&amp;nbsp;</td><td>BD Ultra-Fine&amp;shy;II</td><td>328838</td><td>脑内和腹腔注射</td></tr><tr><td>微量天平</td><td>METTLER TOLEDO's LabX</td><td>AL104</td><td>称量小鼠</td></tr><tr><td>未适应的DENV2（PL046株）</td><td>中国台湾疾病控制中心</td><td>-</td><td>感染小鼠</td></tr><tr><td>ICR乳鼠</td><td>BioLASCO Taiwan Co., Ltd</td><td>-</td><td>我们的小鼠模型</td></tr></tbody></table>

一种模拟登革病毒感染所致急性病毒性脑炎的小鼠模型

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

登革病毒（DENV）是一种通过蚊子传播的节肢动物传播病毒，可能引起严重的登革出血热，其特征是因血浆渗漏、腹水、胸腔积液、呼吸窘迫、严重出血及器官功能损害而导致致命性并发症。少数DENV感染病例会出现神经系统表现；然而，目前尚无研究深入探讨DENV诱导的神经病理发生机制。本研究中，我们提出了一种利用免疫健全的非近交系ICR（Institute of Cancer Research）小鼠来研究DENV诱导中枢神经系统（CNS）感染及随后急性病毒性脑炎样疾病进展的实验方案。

已有报道称，重症登革热相关的神经系统并发症出现在登革病毒致病过程中4。尽管此类病例在临床上较为罕见，但建立一种具有完整免疫能力的小鼠登革病毒（DENV）感染模型，不仅可用于研究免疫病理发生机制，还可用于探索中枢神经系统（CNS）感染、神经炎症、神经毒性以及类似急性病毒性脑炎的疾病。在本研究中，根据我们现有的模型9,10,11,12,13,14,15，采用出生后7天的ICR乳鼠，通过脑内微量注射（2.5 × 105 PFU）和腹腔注射（7.5 ×...

本文介绍了一种建立免疫健全的ICR（Institute of Cancer Research）小鼠中枢神经系统感染模型的方案，用于展示神经病变的发生过程。可通过相同的疾病评分对急性病毒性脑炎疾病进行监测，以在体内展示登革病毒诱导的神经病变。

登革病毒（DENV）是一种通过蚊子传播的节肢动物传播病毒，可能引起严重疾病登革出血热，该疾病表现为……

本方案所展示的疾病模型可用于研究登革病毒感染脑组织，从而建立一个体内平台，以筛选与神经病理发生相关的病毒和宿主因子。与以往模型不同，本模型采用低病毒滴度感染免疫功能健全的癌症研究所（Institute of Cancer Research） suckling 小鼠，诱导类似脑炎疾病的产生。本次实验操作将由我实验室的博士研究生 Ting-Jing Shen 演示。在开始感染程序之前，将未适应的登革病毒二代毒株稀释至每40微升RPMI 1640培养基中含有1×10⁵个蚀斑形成单位的浓度。接着，取一支配有30号针头的0.3毫升注射器，加入10微升稀释后的病毒液；另取一支配有30号针头的0.3毫升注射器，每只动物接种30微升病毒液。进行病毒颅内接种时，用拇指和食指轻轻夹住一只出生7天的吸乳型癌症研究所小鼠，使其呈俯卧位，并将10 µL稀释后的病毒液注射至矢状缝与人字缝交界处的λ区。颅内注射完成后，用拇指和食指将小鼠转为仰卧位，再经腹腔缓慢注射30 µL稀释后的病毒液至小鼠腹部。为评估疾病进展程度，需每日根据急性病毒性脑炎样症状的严重等级，对每只接种小鼠赋予0至5分的评分，并以各组每日检测评分的均值加减标准差绘制曲线图形式展示每日评分结果。与模拟感染组（仅接种培养基）小鼠的体重变化相比，登革病毒感染组动物在试验期间的每个时间点均表现出体重下降。此外，与模拟感染组动物相比，登革病毒感染动物出现明显的弓背姿势、边缘系统性惊厥、肢体无力、瘫痪及死亡率升高等症状。事实上，登革病毒感染小鼠的存活率呈时间依赖性降低，而模拟感染组动物则未出现此现象，这证实了在中枢神经系统内成功建立了登革病毒感染模型，能够体现小鼠急性病毒性脑炎样疾病的进展过程。穿刺位点错误可能导致针头被划痕堵塞，以及病毒溶液溢出颅外，从而导致注射失败和感染失败。操作完成后，可采集脑组织样本，分别通过苏木精-伊红染色、流式细胞术和蚀斑形成实验，进行病理损伤、免疫细胞浸润和病毒复制分析。我们建立的免疫健全小鼠模型，为探索登革病毒的致病机制、登革病毒疫苗研发以及抗登革病毒药物开发提供了研究平台。登革病毒是一种生物安全二级病原体，因此所有涉及该病毒的实验均应在合格的动物生物安全二级实验室中进行。

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免疫学与感染

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慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与临床评分

利用荧光素酶和活体成像系统（IVIS）作为一种新方法，在临床症状出现前识别疾病终点。IVIS使我们能够实时观察脑炎病毒在多天内的侵袭过程，从而为未来研究提供更为精确的疾病模型。该技术还使我们能够比当前常用的动物模型更快地评估抗病毒药物和疫苗的潜在保护作用。通过在多个时间点对同一动物进行连续监测，可减少实验动物使用数量、降低成本，并降低动物的整体发病率，确保疾病研究过程更加人道且更具科学性。...

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在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

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流感A病毒在感染小鼠模型中的研究

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