高通量环境样品铁载体筛选：植物组织、原位土壤和根际土壤

铁载体是一类低分子量的金属螯合生物分子，参与环境中铁元素的循环。本实验方案可实现对土壤和植物样品中铁载体活性的快速高通量评估。以往的铁载体检测方法忽略了微生物群落这一关键环境因素。

我们的技术能够在相对完整的微生物群落及其所处生境中进行检测。由于铁的有效性对农业生产至关重要，因此本方案可用于研究微生物在调节植物铁可用性方面的作用。此外，该方法还可用于评估农业管理措施对土壤健康以及产铁载体微生物群落的影响，以及这些群落随时间的演变过程。

首先，在使用玻璃器皿进行CAS检测之前，需将其在100毫摩尔盐酸和100毫摩尔硝酸中酸洗至少两小时。准备一个装有实验室级沙子的铝制烤盘，并用铝箔覆盖。在121摄氏度下高压灭菌30分钟，然后放置一旁备用。

将0.365克HDTMA加入20毫升双去离子水中，配制HDTMA溶液，并将该溶液置于37摄氏度水浴中以促进溶解。在25毫升双去离子水中加入0.302克CAS，同时用无菌磁力搅拌子轻轻搅拌。然后，在持续轻轻搅拌的条件下，向25毫升CAS溶液中加入5毫升1摩尔六水合氯化铁。

现在，将 20 毫升 HDTMA 溶液缓慢加入铁 CAS 复合物溶液中，同时轻轻搅拌。通过将 15.12 克 PIPES 溶解于 375 毫升双去离子水中并轻轻搅拌来配制缓冲溶液。用 5 摩尔氢氧化钠将 pH 值调节至 6.8。

然后加水至体积达到 450 毫升。现在向溶液中加入 5 克琼脂糖。将 PIPES 缓冲液和铁 CAS 复合物溶液在 121 摄氏度下高压灭菌 30 分钟。

在生物安全柜中，将铁CAS复合物溶液全部加入已分别经过高压灭菌的PIPES缓冲液中。将混合溶液置于50摄氏度的水浴中。现在将无菌试剂舟放入生物安全柜内的无菌沙中，并加热至50摄氏度。

将铁CAS复合物琼脂转移至平皿中，然后迅速向每孔加入100 µL，分装至透明平底无菌96孔微孔板的各个孔中。用先前制备的改良M9培养基配制800 µmol/L的绿脓菌素标准品溶液，并将其依次稀释为400、200、100、50、25、12.5和6.25 µmol/L的系列浓度溶液。

向500毫升预先制备的改良M9培养基中加入EDTA，配制3.2毫摩尔EDTA标准溶液。将该溶液稀释为1600、800、400、200、100、50、25、12.5和6.25微摩尔的系列溶液。为生成标准曲线，将每种浓度的绿脓菌素和EDTA各100微升分别加入含有100微升铁CAS复合琼脂培养基的96孔微孔板的不同孔中。

每个浓度均需设置重复的技术重复样本。同时设置仅含M9的空白孔。使用酶标仪，在22°C培养1小时、6小时和24小时后测定吸光度，并利用吸光度测定值绘制标准曲线。用22微米滤膜过滤的双蒸水冲洗采样设备，随后用70%乙醇冲洗，并用纸巾擦干。

在取样前以及样品之间进行洗涤操作，以维持无菌操作技术并减少交叉污染。在野外采集植物组织并挖取少量根团后，将根团放入单独标记的塑料袋中，以便在实验室环境中进行样品分离。将所有样品直接置于冰上，并在四摄氏度下保存，直至进行铁载体产生测定实验。

将与根系相关的土壤样品分为散装土、松散结合根际土和紧密结合根际土。具体操作为：将根团从袋中取出，并轻轻振荡以去除根团表面的土壤。振落的土壤与袋中残留的土壤共同构成散装土。

这是松散结合的根际土壤。取带有紧密结合样品的根，放入离心管中，以制备紧密结合的根际土壤。加入30毫升双蒸去离子水，涡旋振荡两到三分钟。

去除根系以获得紧密结合的根际土壤悬液稀释液。在不打开样品袋的情况下，通过充分混合和翻转，将每个土壤样品在样品袋内均质化。每个样品充分混匀后，取两克土壤样品，加入无菌50毫升离心管中，用20毫升改良M9培养基进行分装和悬浮。

将样品稀释后，用无菌泡沫塞密封试管以允许通气。对于紧密结合的根际样品，将2毫升根际土壤悬液加入无菌50毫升离心管中的20毫升改良M9培养基内。将样品稀释后，用无菌泡沫塞密封试管以允许通气。

制备组织样品时，先用70%乙醇对根、茎和谷粒表面进行灭菌。取2克新鲜组织，在20毫升改良M9培养基中使用搅拌机高速匀浆30秒。然后将样品转移至无菌的50毫升离心管中，稀释后用无菌泡沫塞密封管口。

为了通过铁限制促进铁载体的产生，将50毫升离心管在室温下孵育，并以160 RPM振荡。在启动富集培养后的24、48和72小时，使用无菌技术从富集管中取出1毫升的子样品。将子样品在2毫升离心管中以10,000 ×g离心1分钟，以沉淀细胞。

采用无菌操作技术，将上清液各 100 微升加入 96 孔板中含铁 CAS 复合物琼脂溶液的孔内，每组设两个或三个复孔。同时，加入 100 微升无菌 M9 培养基作为阴性对照。随后将培养板置于 28 摄氏度条件下孵育。

每块平板在放入培养箱前应密封并用铝箔包裹。将每个样品的剩余上清液和沉淀分别悬浮于各自的无菌2毫升离心管中。向每个样品的上清液管中加入400微升无菌甘油，并重新悬浮沉淀，以制备甘油菌种保存液。

将菌种在零下80摄氏度冷冻保存，以备后续分析。在6、24、48和72小时，于420纳米波长下测定吸光度。采用铜绿假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物合成的绿脓菌素混合物作为标准品，用于解释和定量样品中绿脓菌素当量的吸光度，单位为微摩尔（µM）。

此处展示了在 420 纳米处的吸光度与绿脓菌素起始浓度之间的关系。在培养 48 小时后，评估了 72 小时富集样品的铁载体活性，以确定基因型和样品类型对铁载体分离的影响。在土壤总样品中，铁载体活性相对较低，且不同小麦基因型来源的土壤总样品之间未表现出差异。

然而，与来自 Madsen 和 727 基因型的松散结合土壤相比，来自 725 基因型的松散结合土壤富集物表现出更高的铁载体产量，但与 Lewjain 无显著差异。相反，紧密结合土壤富集物中的铁载体产量受基因型影响较小。无论基因型如何，籽粒组织的富集培养物产生的铁载体均相对较低。

Lewjain 品系的茎组织富集物中，铁载体产量显著低于其他基因型，而 725 品系的茎组织培养物中铁载体产量表现出更高的变异性。在根组织富集培养物中，铁载体活性差异最为显著，其中 725 品系的铁载体活性比其他所有基因型高出 200% 以上。执行该实验方案最具挑战性的环节之一是在完成 CAS 铁琼脂微孔板制备及样品铁载体活性检测的多个步骤过程中，维持无菌条件。

多种基于培养或基于DNA的色谱技术可应用于实际的微孔板孔或甘油保存的菌种，以进行进一步的生化检测、遗传表征及代谢建模。通过使用本方案，可将铁载体活性与产生该活性的特定生物体相关联，或进一步针对该机制研究其对更大范围生态影响的作用。本方案可轻松修改，用于评估从其他环境区室（包括空气、水和沉积物）采集样品所获得的富集培养物中的铁载体产生情况。