微聚焦 X 射线 CT (微CT) 阿克蒂尼亚 equina (Cnidaria),哈莫特霍sp. (安妮利达) 和Xenoturbella japonica (西纳科洛莫卡) 成像

在这里,详细介绍了对三种海洋无脊椎动物进行微聚焦X射线计算机断层成像(微CT)成像的协议。本研究描述了样品固定、染色、安装、扫描、图像重建和数据分析等步骤。还就如何针对不同的样本调整协议提出了建议。

由于微生物在形态学上的多样性，微CT尚未广泛应用于海洋无脊椎动物。我们的方法使样品能够以适合其形态的任何角度轻松安装。它可以使用常见的材料，如水，粘土和管，如果适用，以各种形状的样品，从长蠕虫到圆球。

演示该程序将是日本国家遗传学研究所的技术员阿基特鲁·马野。首先，在250毫升的锥形烧瓶中溶解500毫克的阿加糖，将烧瓶放在微波炉中，功率为800瓦，加热约1至3分钟。在室温下冷却烧瓶。

要安装不适合在 1000 微升微吹风板蓝色尖端（如 A.equina）中的大型样品，请先将染色样品放在 60 毫米的培养皿中，并加有蒸馏水，以洗去表面过多的染色溶液。在50毫升的管子中，轻轻倒入5毫升0.5%的加糖，而不会产生气泡。将管子放在冰上，使加糖变硬。

然后将20毫升0.5%的加糖加入管子，放在冰上，直到加糖开始变硬，然后用钳子将标本放在加糖内。调整试样的位置，使其车身轴垂直。把冰上的阿加罗斯硬化。

将粘土放在 microCT 安装阶段，并在粘土上放置 50 毫升管。要安装适合 1000 微升微移子蓝色尖端的小样品，如 Harmothoe sp. 和 X.japonica，请将染色样品放入 60 毫米的培养皿中，而无需使用钳子。

用环钳，轻轻地将样品转移到另一个装满蒸馏水的60毫米盘中，以洗去表面过多的染色溶液。接下来，将100微升0.5%的加糖放入1000微升的微移子蓝色尖端，放在冰上硬化。处理哈莫特霍时

在尖端的阿加罗斯插头中加入 1000 微升 0.5% 的阿加糖。使用环钳将哈莫托鞋从 60 毫米的盘子轻轻地转移到尖端的 agarose 溶液中。

使用小针或精密钳子，调整 Harmothoe sp. 的位置和方向，使 chaetae 不会不自然弯曲。确保不存在气泡，然后将尖端放在冰上，使红糖变硬。

在处理易碎样品（如 X.japonica）时，使用微管将 1000 微升蒸馏水加入蓝色尖端，并加入硬化的 agarose 塞。将 X.Japonica 定位在蒸馏水中，以便它在尖端壁之间保持稳定。对于较小的样品，可以使用 200 微升微移液管黄色尖端。

在这种情况下，使用30微升的阿加罗斯插头，并添加200微升的阿加罗斯或蒸馏水。接下来，切断新的 1000 微升微吹风机蓝色尖端，并将插入的尖端插入新尖端。将粘土放在 microCT 安装阶段，并在粘土上设置带样品的尖端。

安装样品后，立即打开 80 千伏和 100 微安的 X 射线束。在观察 X 射线传输图像时，移动舞台，以便通过单击 x 轴和 z 轴按钮以及手动调整安装舞台上的 y 轴旋钮来查看整个样品。调整图像的对比度条件，以便可以观察到内部结构。

通过改变粘土中管的角度来调整样品的方向。通过将旋转轴设置为 90，然后单击"相对移动"按钮，将舞台旋转 90 度。执行相同的操作四次以完成完全旋转。

每次打开样品门时手动关闭 X 射线束，除非系统会自动将其关闭。现在单击 z 轴按钮并手动调整 y 轴旋钮以移动安装阶段，使样品位于视图的中心。转动舞台 90 度，然后再次将样品调整到中心。

将舞台转 90 度三次，并根据需要进行调整，以确保样品从各个方向位于视图的中心。接下来，单击 x 轴按钮，沿 X 轴向 X 射线光束源移动舞台以放大样本，并根据需要进行调整，使其适合视图。转动舞台并根据需要进行调整，以确保样品从所有方向都适合视图。

调整扫描条件，然后开始扫描。在这个实验中，在用25%Lugol溶液染色后，在Actinia equina、Harmothoe sp. 和Xenoturbellajaponica上进行了微CT成像。

染色成功地增强了所有试样内部结构的对比度，从而能够观察内部软组织。这种方法适用于易碎的标本，即使外部损坏，从X.japonica标本与严重损坏的表皮。为哈莫特霍孢子重建了整个标本的单一高分辨率数据集。

和X.japonica从多个扫描执行不同但重叠的部分的标本。确保将样品放在管子或尖端中，并在 microCT 中安装管或尖端，使其在扫描过程中不会移动。从该程序获得的数据可用于三D图像重建，使研究人员能够充分了解样品的内部和外部形态。

所有 microCT 系统都使用 X 射线，但具体细节可能不同，因此请确保密切遵循每个系统的说明。