用于可重复图案形成的混合凝胶立方体装置中初始三维细胞簇的控制

本方案采用一种简单的方法来提高三维细胞培养模型的可靠性，且无需使用任何特殊设备。该技术的主要优势在于，我们可通过控制立方装置内的初始培养条件，实现可重复的三维培养实验。制备一个5毫米×5毫米的聚碳酸酯立方框架后，将其放置于预冷的载玻片和冰盒上，使用移液器从立方框架的顶面将12微升预热的1.5%琼脂糖溶液加入到底面。

铺展琼脂糖以获得平整的表面，并让聚合物充分凝固。用镊子将框架移至玻片边缘，旋转框架使其开口朝下，然后将框架放回载玻片上。按照上述方法，向框架的接下来两个表面加入更多琼脂糖，填充完毕后，从开口面向下倾倒，使琼脂糖在第四和第五侧形成琼脂糖壁。

为了建立初始的细胞簇形态，将适用于目标细胞培养的适当细胞外基质注入杂化凝胶立方体培养空间中，并将制备好的微模具放置在立方体上。随后将该立方体置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育25分钟。当细胞外基质完全固化后，小心地取出微模具，以避免基质受损。

将在细胞外基质中制备出具有目标模具形状的孔隙。将实验细胞悬液在适当的实验细胞培养基中离心浓缩后，将细胞接种至细胞外基质中的孔隙内。将样品置于二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育20分钟，使细胞沉降至细胞外基质的孔隙中，从而填充微模具所形成的空腔。

孵育结束后，将立方体放入24孔板的一个孔中，并向孔内加入100 µL适当的细胞培养基。注射额外的细胞外基质以封闭口袋，然后将立方体放回培养箱中孵育25分钟。当细胞外基质凝固后，在立方体的顶面滴加约10 µL 20 °C的琼脂糖，封闭表面，并在37 °C下固化10至20分钟。

然后用新鲜培养基完全覆盖整个立方体，以促进渗透压，从而有利于营养物质向立方体内部细胞的转运。为了通过多方向观察实现无创的三维形态识别，将培养板置于显微镜载物台上，使用明场或相差显微镜获取立方体每一面的图像，并在每次成像之间用镊子旋转立方体以暴露待成像的表面。对于通过多方向观察进行免疫荧光成像，首先吸除含有立方体的孔中的上清液，并在室温下用4%多聚甲醛固定立方体20分钟。

固定结束后，用 PBS 洗涤样本块两次，每次 10 分钟。在 4 摄氏度下，使用 0.5% Triton X-100 和 PBS 对样本块进行透化处理，持续 10 分钟。接着，用 PBS 洗涤样本块三次，每次 10 分钟，然后在室温下用山羊血清和免疫荧光缓冲液封闭非特异性结合位点，封闭时间为 60 分钟。

然后根据标准的抗体染色方案，使用相应的特异性一抗对细胞进行染色。接着，按照刚刚演示的方法，在激光共聚焦显微镜或荧光显微镜下对立方体的全部六个面进行成像。在此代表性实验中，对与正常人支气管上皮细胞共培养的杂合水凝胶立方体进行多方向成像，通过相差显微镜和免疫荧光成像显示，细胞培养物最初形成了柱状或棱柱状结构。

此处显示的是在杂交凝胶立方体中最初被控制为圆柱形的正常人上皮细胞，在支气管树形成后的免疫染色结果。多维成像显示，分支结构垂直于圆柱体轴线。将细胞以高密度接种至细胞外基质腔中至关重要，因为细胞密度过低可能导致孵育后细胞质量下降。

该方法模式通过多方向成像进行定量测量，重复形成三维细胞模式，以研究培养皿发育的机制。