Name: 研究病原体或药物交叉障碍及其与大脑相互作用的人血脑界面模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 了解人血脑屏障微型脑模型的建立方法，用于研究病原体和药物穿越血脑屏障及其与神经元的相互作用。该技术有助于评估分子转运和神经保护效果。

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本研究获得了巴斯德研究所内部资助，包括一项激励性资助（PTR 435），以及赛诺菲巴斯德公司向巴斯德研究所提供的“研究支持合同”资助。A. da Costa 获得了赛诺菲-巴斯德资助，Florian Bakoa 获得了法国国家研究与技术协会（ANRT）提供的博士研究生资助。我们感谢Pierre-Olivier Couraud教授和Florence Miller博士提供的有益讨论。

该系统的知识产权为参考文献32、35和38中引用的专利。

本文中，我们展示了如何通过将血脑屏障（BBB）模型与混合脑皮层细胞（Minibrain）培养物整合到一个独立装置中，构建一种细胞内血脑界面——BBB-Minibrain。该系统具有生物学相关性，对于熟练掌握细胞培养技术的研究人员而言，操作简便且易于使用。
对于任何其他体外血脑屏障模型而言，只有严格控制屏障的紧密性，才能获得可靠的结果。应仔细检测小室的通透性，任何通透性不符合要求（即LY的表观通透系数PeLY高于1.2）的小室均应弃用。
应仔细检测FBS样品，以确定不会破坏血脑屏障（BBB）特性的批次。对于稀释病毒颗粒或生物分子的载体培养基，也应遵循同样的建议。此外，为避免改变管腔侧培养基的组成，建议尽可能减少生物分子或病毒悬液的体积。由Ntera/CL2.D1细胞系建立的人源共培养神经元/星形胶质细胞体系是一种经过验证的技术。与处于有丝分裂后状态的人类神经元不同，星形胶质细胞仍具有分裂能力，有时可观察到星形胶质细胞的高增殖活性。若出现此情况，则必须弃用该迷你脑（Minibrain）培养物。本实验室所使用的...

大脑被一种非通透性结构与体循环隔离开来，该结构限制了脑实质与血液之间的物质交换，这种结构称为血脑屏障（BBB）。血脑屏障主要由脑内皮细胞构成，并与邻近脑实质中的星形胶质细胞、血管周围小胶质细胞以及神经元动态相互作用。血脑屏障的三大主要功能是为神经元活动建立并维持离子稳态、向大脑供应营养物质，以及防止有毒损伤或病原体入侵1,2，这些功能共同维持了大脑的稳态及其正常功能3。该屏障极为有效，仅有极少数药物能够穿越血脑屏障4,5。目前，预测某种分子是否能够通过血脑屏障并扩散至大脑的方法包括：利用尸体组织进行离体研究、通过磁共振成像（MRI）或正电子发射断层扫描（PET）对人脑志愿者进行体内示踪成像，或在动物中开展药效学与药代动力学的临床前研究6,7,8。这些技术与模型均存在一定局限性，例如PET分辨率有限、MRI灵敏度较低6,8，难以定量检测脑内穿透能力较差的分子（例如基于抗体的分子）7，而临床前研究还存在成本高昂以及需使用动物实验等问题。
最后一点非常重要，因为根据“3R原则”（替代、减少和优化动物实验），监管机构已要求研究人员紧急开发出科学上准确的动物实验替代方法9,10,11,12,13,14,15。
近几十年来，已提出多种血脑屏障（BBB）的体外模型16,17,18，其方法是在滤膜插件上培养来自不同物种（如小鼠、大鼠、牛和猪）的内皮细胞。对于人类血脑屏障模型而言，由于原代细胞来源稀少且获取困难，研究人员转而开发基于永生化脑微血管内皮细胞或人源性干细胞的模型19,20,21。这些体外模型若能表达内皮细胞标志物、紧密连接蛋白标志物、外排转运蛋白、溶质载体、受体，并对内皮细胞刺激产生响应，则可作为合适的血脑屏障替代模型20。已有若干研究检测了使用滤膜插件并接种内皮细胞与其他细胞类型（如星形胶质细胞、神经元或周细胞22,23,24）构建的血脑屏障模型。此类共培养模型的目标是利用星形胶质细胞/神经元或周细胞分泌的可溶性因子，以增强血脑屏障的物理特性。
然而，这些模型均未包含脑实质，无法用于研究和预测药物候选物穿过屏障后的去向。因此，我们的目标是将血脑屏障模型与混合脑细胞培养相结合，构建一种细胞内的血脑界面——BBB-Minibrain，集成于单一试剂盒中。BBB-Minibrain采用一种培养系统，该系统由插入多孔细胞培养板孔中的多孔滤膜组成。滤膜上包被hCMEC/D3细胞——一种已被证实高度可靠的用于血脑屏障药物测试的人脑微血管内皮细胞系25,26,27，以形成血脑屏障。Minibrain则由来源于NTera/Cl2.D1细胞系的人类神经元与星形胶质细胞共分化培养物28,29，与人小胶质细胞系CHME/Cl530按脑组织中小胶质细胞与神经元-星形胶质细胞比例混合构成31，培养于培养板孔底部。
除了研究药物通过血脑屏障（BBB）及其在脑实质中的命运外，体外细胞模型中的血脑界面还可作为研究病原体进入大脑（神经侵袭性）、在脑内扩散（神经趋向性）以及对脑实质细胞产生毒性作用（神经毒力）的有力工具。神经毒力和神经侵袭性研究将受益于高效的体外细胞模型的建立，并有望替代动物模型。利用BBB-Minibrain试剂盒32，我们证实了罕见黄热病毒（Yellow Fever Virus）突变株的神经侵袭表型，这些突变株富集于用于制备已停用的黄热病毒活疫苗的法国嗜神经病毒株（FNV-YFV33,34），同时也验证了一种名为Neurovita（文中简称为NV）的具有神经再生和神经保护功能的生物分子的跨BBB能力35。由于NV本身无法自然穿过细胞膜或血脑屏障，因此将其与羊驼单链抗体的可变区（VHH）融合，该VHH能够穿透包括血脑屏障在内的生物膜，并作为细胞穿透分子（CPM）发挥作用36。VHH的细胞穿透特性似乎取决于其等电点及长度37。
这种细胞内检测方法有望在对动物（理想情况下也包括人体）进行药代动力学和药效学分析之前，筛选出可能穿过血脑屏障（BBB）的分子，同时还能预测这些分子在神经实质中的行为。该系统具有生物学相关性，且对于细胞培养技术熟练的专业人员而言，易于建立和操作26,29,30,38。此类细胞内检测的意义是双重的：一方面可降低临床前试验的成本，另一方面可减少动物实验的使用。

<table><tbody><tr><td>12孔板</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>5-氟-2&amp;rsquo;脱氧尿苷</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>85毫米培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83-3902-500</td><td></td></tr><tr><td>抗-Nf200</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>N4142</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>CHME/Cl5</td><td>单位&amp;eacute; 病毒神经免疫学</td><td>应拉丰博士的要求</td><td></td></tr><tr><td>羧甲基纤维素钠</td><td>Calbiochem</td><td>217274</td><td></td></tr><tr><td>胞嘧啶 &amp;beta;-D-阿拉伯呋喃糖苷</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>黑色96孔板</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Endogro IV</td><td>Millipore</td><td>SCME004</td><td>内皮细胞培养基</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Carlo Erba</td><td>529121</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30015-04</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨</td><td>RAL 诊断</td><td>320310</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>115-545-003</td><td></td></tr><tr><td>Goat-抗兔</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>含 Ca2+-Mg2+ 的 HBSS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14025-100</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3</td><td>Cedarlane</td><td>CLU512</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630-070</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>33263</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>L6274</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>MEM 10X</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21430</td><td></td></tr><tr><td>MEM 1X</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>42360</td><td></td></tr><tr><td>Ntera/Cl2D.1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1973</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca²⁺-Mg²⁺ 的 PBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>PBS-Ca²⁺-Mg²⁺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Eurobio</td><td>CXXPES00-07</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>QIAGEN</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 I 型胶原蛋白</td><td>Cultrex</td><td>3443-100-01</td><td></td></tr><tr><td>全反式维甲酸</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RNA纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 5.6%</td><td>Eurobio</td><td>CXXBIC00-07</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>T75 细胞培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>83-1813-302</td><td>用于敏感贴壁细胞的经特殊表面处理组织培养聚苯乙烯培养瓶（Cell+）</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>康宁</td><td>3460</td><td>聚酯多孔膜培养小室</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>默克-西格玛奥德里奇</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15040-033</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>YFV-FNV</td><td>IP 达喀尔</td><td>疫苗瓶</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

针对神经系统药物在相关且可靠的细胞内血脑屏障（BBB）模型中进行早期筛选，以评估其穿透能力以及与屏障和脑实质的相互作用，目前仍是一项未被满足的需求。为填补这一空白，我们设计了一种二维细胞内模型——BBB-Minibrain，该模型将聚酯多孔膜培养小室构建的人源血脑屏障模型与由三种人源脑细胞（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）共培养形成的Minibrain相结合。利用BBB-Minibrain模型，我们能够检测一种神经保护候选药物（例如Neurovita）穿越血脑屏障的转运过程，确定该分子对神经元的特异性靶向性，并证明药物在穿越血脑屏障后仍保留其神经保护特性。我们还证实，BBB-Minibrain是一种有价值的模型，可用于检测病毒颗粒穿过内皮细胞屏障的过程，并监测神经侵袭性病毒颗粒对Minibrain的感染情况。BBB-Minibrain是一种可靠且易于操作的系统，适用于掌握细胞培养技术的研究人员，且能够预测药物处理或损伤后脑细胞的表型变化。此类细胞内检测模型的应用具有双重意义：一方面可在药物研发早期引入降低风险的步骤，另一方面有助于减少动物实验的使用。

BBB-Minibrain 是一种细胞内的血脑屏障界面实验模型。
BBB-Minibrain 建立在聚酯膜培养小室系统上，用于模拟血脑屏障界面的上层为血液区室、下层为脑区室的结构（图 2A、B）。该系统由管腔区室和非管腔区室组成：管腔区室包含在滤膜上形成的 hCMEC/D3 内皮细胞，构成血脑屏障；非管腔区室则包含 Minibrain 人源三细胞共培养体系（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）。Minibrain 细胞表现出典型的三细胞共培养混合群体表型（图 1，右下面板），并表达每种细胞类型的特异性标志物，如 da Costa A. 等人，201834 所示。
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本文介绍了一种在细胞内构建血脑屏障-微型脑聚酯多孔膜培养插入系统的方法，用于评估生物分子或感染性物质穿过人血脑屏障的转运过程及其对邻近脑细胞的生理影响。

在相关且可靠的细胞内血脑屏障模型上对神经系统药物进行早期筛选，以评估其穿透能力及与……的相互作用

这种人源性血脑屏障模型可用于研究分子向神经系统的转运过程，以及微生物如何到达受感染的脑部或脑瘤部位。在此血脑屏障（BBB）模型中加入类脑器官，可进一步研究病原体及各类分子对BBB在脑内功能行为的影响。为演示该实验步骤，将由我实验室的博士生Florian Bakao进行操作。为建立血脑屏障（BBB）微型脑模型聚酯膜培养插入装置，需将细胞用不完全内皮细胞培养基稀释至每插入装置5×10⁴个细胞的浓度，并向12孔板中的每个聚酯膜培养插入装置加入相应体积的细胞悬液。随后，将插入装置放入细胞培养孵育箱中，直至细胞达到100%汇合度。在室温下，将12孔板每孔加入1毫升多聚-D-赖氨酸，孵育4小时。随后每孔加入1毫升层粘连蛋白，4℃孵育过夜。弃去层粘连蛋白，每孔加入1毫升内皮细胞培养基，培养基中添加5%胎牛血清（FBS）。将样品置于培养箱中孵育一小时。为制备微型培养物，用胰蛋白酶轻柔处理CHME克隆5细胞中的人类神经元星形胶质细胞。将细胞沉淀与完全内皮细胞培养基混合。每孔接种 3.6 × 10⁵ 个神经元和星形胶质细胞，以及 0.4 × 10⁵ 个 CHME5 细胞，使用 12 孔板，并将 12 孔板进行接种。接种 24 小时后，构建血脑屏障迷你脑模型：更换为新鲜的完全内皮细胞培养基，并将包被有脑微血管内皮细胞的聚酯膜培养小室转移至迷你脑细胞上方。然后，将 BBB 多脑装置放入培养箱中。为了验证 BBB 类脑微血管内皮通透性，在新的 12 孔板中每孔加入 1.5 毫升转运缓冲液。并将每个滤膜翻转倒置，小心移除培养基，避免影响内皮细胞屏障。将每个滤膜放入盛有转运缓冲液的孔板的一个孔中，并向每个孔中加入 0.5 毫升荧光黄。然后将孔板置于培养箱中孵育 10 分钟，随后将滤膜转移至另一个装有转运缓冲液的 12 孔板中。在按照演示方法构建好血脑屏障（BBB）多脑装置后，非常小心地在管腔室上层加入 3500 个平台单位的黄热病病毒法国神经营养病毒株稀释液以及 50 微升 2% FPS 内皮细胞培养基。向对照组血脑屏障微型脑模型中加入50微升含2%FBS的内皮细胞培养基，不添加病毒。然后将暴露于病毒的血脑屏障微型脑装置放入培养箱中培养24小时。次日，取出插入物以测定内皮细胞通透性，并设置相应的对照孔，操作方式如前所述。从每个孔中保留一毫升样品，用于测定中间室的病毒滴度。操作插入物时应轻柔，避免管腔室液体泄漏至基底外侧室。为研究靶向神经元的生物分子跨越血脑屏障的转运过程，将感兴趣的生物分子加入插入物中，并将培养板放回细胞培养箱中继续孵育。24小时后，远程插入并测定内皮通透性。随后使用适当的抗体对大量脑细胞进行染色，以检测微型脑中目标生物分子的存在。人脑微血管内皮细胞表达所有受体亚型、外排转运蛋白或转运蛋白，这些是与其生物学功能密切相关的关键蛋白质。某些法国神经亲和性黄热病毒株可在感染后24小时穿越血脑屏障。随后，病毒在脑细胞内复制，病毒载量在接下来的两天内持续扩增。此外，当这种具有神经侵袭性的病毒群体在类脑细胞上连续传代时，可刺激特定病毒生物标志物的表达，且其表达水平与病毒载量严格相关。加入后，细胞穿透分子Neuro-Tag Neurovita可到达血脑屏障的限隔室，并能靶向人神经元。细胞穿透分子Neuro-Tag Delta Neurovita可穿过内皮细胞屏障，但对人神经元的靶向效率较低。加入小中隔室后，细胞穿透分子Neuro-Tag Neurovita可穿越血脑屏障，并在损伤后促进人神经元轴突的再生。与细胞穿透分子 Neuro-Tag Neurovita Delta 不同，Neurovita 的非活性形式。在轴突划伤后应用时，细胞穿透分子 Neuro-Tag Neurovita 可触发受损神经元的神经保护作用及轴向再生。仅用于良好实验实践之目的。不要过度使用I细胞传代。尽量保持培养基和区域的一定稳定性，并检测支原体的污染情况。通过转录组学或经典生物学技术，可进一步研究类脑器官与药物以及目标微生物之间的相互作用。

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研究病原体或药物交叉障碍及其与大脑相互作用的人血脑界面模型

在本视频中，我们描述了一种建立体外模型的全面方案，该模型可模拟血-脑肿瘤屏障。该模型有望用于研究治疗脑肿瘤药物的递送机制。...

血脑肿瘤屏障（BBTB）模型：用于评估治疗药物向肿瘤递送的血脑屏障（BBB）模型改良方法

本视频展示了一种用于研究病原体穿越血脑屏障（BBB）的体外模型。表达紧密连接的微血管内皮细胞在上室形成内皮层，而神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞则在下室代表脑实质，两者之间由多孔膜隔开。在该BBB模型中进行病毒感染，可模拟病原体从血液进入脑组织的过程。当引入嗜神经病毒后，病毒通过转胞吞作用穿越血脑屏障，感染神经细胞，进行复制并释放子代病毒，从而展示出成功的神经侵入过程。...

一个 体外 研究病原体穿越血脑屏障及脑细胞感染的模型

建立人源血脑屏障（BBB）模型有助于研究与BBB功能障碍相关脑部疾病。本文介绍一种改良的接触式BBB模型制备技术，可在多孔膜的两侧分别共培养人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。...

改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法

此处，我们描述了一种人源血脑屏障模型，可用于研究淋巴细胞向中枢神经系统的跨膜迁移 体外.

使用淋巴细胞外渗分析 体外 人源血脑屏障模型

来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。...

从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

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通过微生物穿越微血管内皮细胞分析血脑屏障通透性

血脑屏障（BBB）是一种多细胞构成的神经血管功能单元，可严格调控大脑内环境的稳态。通过结合人诱导多能干细胞（iPSCs）与器官芯片技术，我们构建了一种可用于疾病建模及中枢神经系统药物穿透能力预测的个体化血脑屏障芯片。本文详细描述了该血脑屏障芯片的制备与操作流程。...

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血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。...

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bEnd.3 血管内皮细胞屏障功能完整性记录 通过 跨内皮电阻力检测

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