一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型

这种人源性血脑屏障模型可用于研究分子向神经系统的转运过程，以及微生物如何到达受感染的脑部或脑瘤部位。在此血脑屏障（BBB）模型中加入类脑器官，可进一步研究病原体及各类分子对BBB在脑内功能行为的影响。

为演示该实验步骤，将由我实验室的博士生Florian Bakao进行操作。为建立血脑屏障（BBB）微型脑模型聚酯膜培养插入装置，需将细胞用不完全内皮细胞培养基稀释至每插入装置5×10⁴个细胞的浓度，并向12孔板中的每个聚酯膜培养插入装置加入相应体积的细胞悬液。随后，将插入装置放入细胞培养孵育箱中，直至细胞达到100%汇合度。

在室温下，将12孔板每孔加入1毫升多聚-D-赖氨酸，孵育4小时。随后每孔加入1毫升层粘连蛋白，4℃孵育过夜。弃去层粘连蛋白，每孔加入1毫升内皮细胞培养基，培养基中添加5%胎牛血清（FBS）。

将样品置于培养箱中孵育一小时。为制备微型培养物，用胰蛋白酶轻柔处理CHME克隆5细胞中的人类神经元星形胶质细胞。将细胞沉淀与完全内皮细胞培养基混合。

每孔接种 3.6 × 10⁵ 个神经元和星形胶质细胞，以及 0.4 × 10⁵ 个 CHME5 细胞，使用 12 孔板，并将 12 孔板进行接种。接种 24 小时后，构建血脑屏障迷你脑模型：更换为新鲜的完全内皮细胞培养基，并将包被有脑微血管内皮细胞的聚酯膜培养小室转移至迷你脑细胞上方。

然后，将 BBB 多脑装置放入培养箱中。为了验证 BBB 类脑微血管内皮通透性，在新的 12 孔板中每孔加入 1.5 毫升转运缓冲液。并将每个滤膜翻转倒置，小心移除培养基，避免影响内皮细胞屏障。

将每个滤膜放入盛有转运缓冲液的孔板的一个孔中，并向每个孔中加入 0.5 毫升荧光黄。然后将孔板置于培养箱中孵育 10 分钟，随后将滤膜转移至另一个装有转运缓冲液的 12 孔板中。在按照演示方法构建好血脑屏障（BBB）多脑装置后，非常小心地在管腔室上层加入 3500 个平台单位的黄热病病毒法国神经营养病毒株稀释液以及 50 微升 2% FPS 内皮细胞培养基。

向对照组血脑屏障微型脑模型中加入50微升含2%FBS的内皮细胞培养基，不添加病毒。然后将暴露于病毒的血脑屏障微型脑装置放入培养箱中培养24小时。次日，取出插入物以测定内皮细胞通透性，并设置相应的对照孔，操作方式如前所述。

从每个孔中保留一毫升样品，用于测定中间室的病毒滴度。操作插入物时应轻柔，避免管腔室液体泄漏至基底外侧室。为研究靶向神经元的生物分子跨越血脑屏障的转运过程，将感兴趣的生物分子加入插入物中，并将培养板放回细胞培养箱中继续孵育。

24小时后，远程插入并测定内皮通透性。随后使用适当的抗体对大量脑细胞进行染色，以检测微型脑中目标生物分子的存在。人脑微血管内皮细胞表达所有受体亚型、外排转运蛋白或转运蛋白，这些是与其生物学功能密切相关的关键蛋白质。

某些法国神经亲和性黄热病毒株可在感染后24小时穿越血脑屏障。随后，病毒在脑细胞内复制，病毒载量在接下来的两天内持续扩增。此外，当这种具有神经侵袭性的病毒群体在类脑细胞上连续传代时，可刺激特定病毒生物标志物的表达，且其表达水平与病毒载量严格相关。

加入后，细胞穿透分子Neuro-Tag Neurovita可到达血脑屏障的限隔室，并能靶向人神经元。细胞穿透分子Neuro-Tag Delta Neurovita可穿过内皮细胞屏障，但对人神经元的靶向效率较低。加入小中隔室后，细胞穿透分子Neuro-Tag Neurovita可穿越血脑屏障，并在损伤后促进人神经元轴突的再生。

与细胞穿透分子 Neuro-Tag Neurovita Delta 不同，Neurovita 的非活性形式。在轴突划伤后应用时，细胞穿透分子 Neuro-Tag Neurovita 可触发受损神经元的神经保护作用及轴向再生。仅用于良好实验实践之目的。

不要过度使用I细胞传代。尽量保持培养基和区域的一定稳定性，并检测支原体的污染情况。通过转录组学或经典生物学技术，可进一步研究类脑器官与药物以及目标微生物之间的相互作用。