使用基因激活型 CRISPR 过表达长链非编码 RNA

非编码RNA通常具有多种异构体。在体外过表达研究中，往往难以研究所有这些表达的异构体。该技术可使用户直接从基因组中获得表达，从而让细胞表达特定非编码RNA的内源性异构体。

这种强大的技术能够以高保真度和精确性，特异性地调控基因组中任意基因的表达。通过设计针对特定基因的向导RNA，研究人员可以利用细胞内源的基因剪接机制，在特定细胞中表达天然的同工型。本次实验操作将由我实验室的博士后研究员Robert Rankin进行演示。

设计位于转录起始位点100个碱基对范围内的引导RNA序列时，使用BLAT等遗传数据库确保该引导RNA序列对目标基因具有唯一性。将引导RNA和失活的Cas9质粒保存在4摄氏度。在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上划线接种大肠杆菌，并在37摄氏度下过夜培养细菌。

第二天，挑取单菌落，将细菌接种于5毫升含氨苄青霉素的LB培养基中，在37摄氏度摇床中剧烈振荡培养过夜。次日，将2毫升菌液加入含有氨苄青霉素的200毫升LB培养基中（使用2升容量的三角瓶），在37摄氏度摇床中剧烈振荡培养过夜。随后在4°C下以3,724 × g离心20分钟收集菌体，并进行DNA纯化。

为了构建含有dCas9的慢病毒，首先用5毫升0.01%的多聚-L-赖氨酸包被100毫升组织培养皿，每皿接种500万个HEK293T细胞至10毫升完全DMEM培养基中。随后，通过将10微克含有LTR的向导RNA载体或含有LTR的失活Cas9载体与包含病毒组分的质粒混合，制备DNA转染样品。加入水至总体积为450微升，并使用连接在注射器上的0.2微米滤膜滤头过滤混合物。接着，向每份DNA转染样品中加入50微升2.5摩尔的氯化钙，轻轻混匀。

将钙-DNA 混合物通过连接在注射器上的 0.2 微米滤膜滤头过滤。用移液器吸取 500 微升 2X HBS 加入一个 5 毫升聚苯乙烯管中。逐滴加入 500 微升钙-DNA 混合物，并轻轻涡旋混匀。

室温孵育三分钟。向每皿含HEK293T细胞的组织培养皿中加入一毫升DNA-氯化钙HBS悬浮液，于含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中过夜孵育。第三天，缓慢吸出并弃去培养皿中的培养基。

用 PBS 轻柔洗涤细胞一次。加入 6 mL 完全 DMEM，补充 20 毫摩尔 HEPES 和 10 毫摩尔丁酸钠。然后将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中孵育 5 至 6 小时。

孵育后，用 PBS 洗涤细胞一次，并向 HEK293T 细胞中加入 5 毫升含 20 毫摩尔 HEPES 的完全 DMEM 培养基。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中孵育 12 小时。第 4 天，收集 HEK293T 细胞的上清液，并过滤含有病毒的上清液。

开始病毒颗粒计数时，首先将P24 ELISA试剂盒中的洗涤浓缩液用19份去离子蒸馏水稀释。然后，使用RPMI 1640培养基作为稀释液，将该试剂盒中的阳性对照稀释至200纳克/毫升，并根据P24 ELISA试剂盒提供的稀释表，在1.5毫升离心管中配制标准曲线所需的一系列稀释液。为测定样品中病毒的浓度，将样品按1:1000起始稀释比例加入96孔板的指定孔中，并根据需要调整加样体积，使其检测值落在标准曲线范围内。

然后用 Triton X-100 将样品稀释至终浓度为 0.5%，并分别向指定孔中加入 200 微升的各样品和 RPMI 1640 培养基。密封培养板，在 37°C 下孵育 2 小时。用 1× 洗涤缓冲液每孔 300 微升洗涤 6 次。

将平板倒置并轻敲在纸巾上，以去除多余的液体。然后向除底物空白孔外的所有孔中加入100微升试剂盒中的检测抗体。用封板膜密封平板，并在37摄氏度下孵育一小时。

洗涤反应板，然后将板倒置并轻拍在纸巾上以去除多余的液体。为检测抗体信号，使用SA-HRP稀释液将链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin horseradish peroxidase）按1:100的比例稀释。充分混匀稀释后的SA-HRP，除空白孔外，向所有孔中各加入100 µL。

密封后在室温下孵育 30 分钟。随后用 1× 洗涤缓冲液洗涤平板，并轻拍去除多余液体。将一片邻苯二胺底物片剂加入 11 毫升底物稀释液中，配制成足够用于一块平板的底物溶液。

剧烈涡旋OPD溶液以彻底溶解，并避光保存。向所有孔（包括空白孔）中加入100 µL OPD底物溶液。立即使用分光光度计在450 nm处读取吸光度。

以一秒钟的间隔重复10次，并取平均测量值。将Jurkat T细胞重悬并接种于T75培养瓶中，密度为每五毫升低血清培养基中含一百万个细胞，并加入polybrene。然后加入含有一百万个携带dCas9的病毒颗粒的HEK293T条件培养基。

将细胞置于含5%二氧化碳的37摄氏度环境中孵育。感染后三天，以233 × g离心5分钟，收集细胞，并将其重悬于10毫升添加了嘌呤霉素的完全DMEM培养基中。将细胞接种于T75培养瓶中，于含5%二氧化碳的37摄氏度环境中培养。

在九天期间内，每隔三天将细胞在233 × g条件下离心五分钟，并更换为添加了嘌呤霉素的完全DMEM培养基。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。随后，在组织培养处理过的96孔板中，于第一个孔内加入10,000个细胞，细胞悬液体积为100 µL，溶剂为添加了嘌呤霉素的完全DMEM培养基。

用添加嘌呤霉素的完全DMEM对以下孔中的内容物进行1:1系列稀释。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。将单克隆细胞扩增至两个24孔板中，然后将三个克隆的细胞分别以每孔两百万细胞接种至6孔板中。

将另外三个孔接种未转导的Jurkat细胞作为对照。最后，将细胞接种到T75培养瓶中，并在细胞培养箱中过夜培养。为了开始定量PCR以检测基因表达，首先进行互补DNA的合成：在250微升离心管中加入1微克RNA、4微升cDNA合成缓冲液和1微升逆转录酶，然后加水至终体积为20微升。

然后，将反转录酶在42摄氏度下使用PCR仪反应30分钟，再于95摄氏度下反应5分钟以灭活。cDNA合成后，加入60微升水进行稀释。对含有0.5微升正向引物和0.5微升反向引物（终浓度为10微摩尔）、5微升SYBR Green和4微升cDNA的反应管进行聚合酶链式反应扩增。

最后，在添加了潮霉素B的DMEM培养基中对Jurkat-dCas9细胞进行10天的筛选。每三天离心细胞并更换培养基。纯化RNA酶后，进行RT-qPCR。

在本研究中，选取了距离转录起始位点10至100个碱基对以内的gRNA序列，用于将Cas9激活复合物引导至与炎症性肠病相关的长链非编码RNA IFNG-AS1的转录位点。为了筛选双重转导的细胞，采用双质粒系统将dCas9或gRNA分别转导至细胞中。其中，MS2蛋白可增强IFNG-AS1的过表达。

两种克隆的Cas9表达均得到确认。使用针对HPRT1的引物来确认非转导细胞中RNA的存在。通过在cDNA反应中省略逆转录酶来确认mRNA的表达。

使用转录本特异性引物组或针对所有已知 IFNG-AS1 转录本的引物组均可检测到三种 IFNG-AS1 剪接变体。所有荧光曲线均呈指数增长，内参基因 HPRT1 在对照细胞与表达 IFNG-AS1 gRNA 的细胞中的指数期相差不到半个循环周期。在不同实验之间，针对所有已知 IFNG-AS1 转录本的引物检测信号最强，测得 IFNG-AS1 表达量增加了 20 倍。

然而，IFNG-AS1 的第三种转录本显示出 IFNG-AS1 水平显著增加五到十倍。为了有效过表达目标基因，步骤 2.1 中向导 RNA 的设计对本实验方案的成功至关重要。此外，高质量病毒颗粒的制备将确保实验方案各组分的高效表达。

在目标基因过表达后，可进行功能研究以探讨该基因的作用机制。在本示例中，我们选择检测目的基因过表达后细胞因子的产生情况。该技术最初由 Griesbach 团队于 2013 年建立，此后已被其他研究团队广泛采用并进一步完善。

我们很兴奋能将这一技术应用于长链非编码RNA，以探索其特定功能。复制缺陷型慢病毒应在已获准进行病毒操作的实验室中处理。此外，人源细胞系和大肠杆菌（E.coli）均被视为生物危害物。

最后，重组 DNA 质粒应由经过培训的人员操作。