Name: 一种研究食细胞诱导免疫应答的 mellonella 口服液模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 了解如何使用Galleria mellonella幼虫口服模型研究先天免疫应答。该方法通过口腔途径给予细菌，分析免疫标志物表达，为替代啮齿类动物研究人类致病菌提供简便方案。

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本工作由德国研究基金会（DFG，SPP1656项目）、DFG研究培训组1708、德国联邦教育与研究部（BMBF）以及德国感染研究中心（DZIF）资助。

1. G. mellonella 的饲养及实验用幼虫的准备
注意：从卵到末龄幼虫的周期大约需要5-6周。
<ol>
	<li>将成年蛾产下的卵转移至含有蜡螟培养基（22% 玉米粗粉、22% 小麦粉、17.5% 蜂蜡、11% 脱脂奶粉、11% 蜂蜜、11% 甘油、5.5% 干酵母）的 2 L 盒子中。整个饲养过程在 30 °C 黑暗条件下进行。</li>
	<li>约 1–2 周后，当观察到出现细小幼虫时，将含有幼虫的 25 g 培养基转移至新鲜培养基中。2 周后根据幼虫大小进行同步化处理，并将 30–40 头幼虫为一组继续饲养于 2 L 容器中的蜡螟培养基上，再维持 2 周。</li>
	<li>根据体重筛选用于实验的幼虫。仅使用体色苍白、活动迅速且体重为 180–200 mg 的幼虫。</li>
</ol>
2. 培养与制备 Bacteroides vulgatus 和 大肠杆菌 用于口服给药
<ol>
	<li>在37 °C条件下，使用厌氧罐和产气袋（见材料表）15,16，厌氧培养专性厌氧菌Bacteroides vulgatus mpk。将B. vulgatus 培养2天，并在实验前一天晚上于脑心浸液（BHI）肉汤中进行过夜传代培养。</li>
	<li>在37 °C有氧条件下，于Luria-Bertani（LB）肉汤中培养兼性厌氧菌Escherichia coli mpk。将E. coli 在LB肉汤中过夜培养，并在实验当天于37 °C继续传代培养2小时。</li>
	<li>以1,700 x g 离心5分钟收集菌体。用DPBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）重悬菌体沉淀。测定细菌培养物在600 nm处的光密度（OD），并计算细菌浓度。将细菌浓度调整至109/mL。</li>
</ol>
3. 通过细菌悬液对G. mellonella幼虫进行强制喂食
<ol>
	<li>使用胰岛素注射器和钝头针，经口给予每只幼虫 10 µL 含 107 个细菌的调整后细菌悬液。注射时使用胰岛素注射器将细菌悬液口服给予每只幼虫。
	<ol>
		<li>将注射器固定在微量注射泵中（图 1），以确保给予每只幼虫的悬液体积准确（参见 材料表）。小心地将注射器插入幼虫的上颚之间，切勿强行插入。等待幼虫主动张开取食器，再插入注射器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将经强制喂食的幼虫在 37 °C 黑暗条件下孵育 1–24 小时。以给予 DPBS 的幼虫作为模拟对照，以排除因强制喂食操作过程中处理幼虫所可能引发的应激反应。</li>
</ol>
4. 口服幼虫的处理及RNA提取
<ol>
	<li>在通风橱内操作并佩戴安全眼镜。清洁通风橱并喷洒试剂以防止RNase污染。
	<ol>
		<li>将培养后的活体幼虫在液氮中快速冷冻，然后进行匀浆。使用研钵和研杵进行匀浆。向研钵中加入液氮，研磨每只幼虫个体，直至形成粉末状匀浆物。</li>
		<li>将匀浆物倒入一次性称量舟中，等待液氮完全挥发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将不含液氮的冷冻粉末匀浆物与1 mL Trizol混合于2 mL离心管中，在室温下孵育1小时。</li>
	<li>在室温下以8,000 × g 离心15分钟，将上清液转移至新管中，弃去沉淀。向上清液中加入200 µL 1-溴-3-氯丙烷（BCP），涡旋混匀后在室温下孵育5分钟，再置于冰上孵育10分钟。</li>
	<li>将加入BCP的反应液在4 °C下以18,000 × g 离心15分钟。将上层透明液体转移至新的2 mL离心管中，其余部分弃去。向转移的上层液体中加入500 µL异丙醇，通过反复颠倒混匀5分钟，使RNA沉淀。</li>
	<li>在4 °C下以18,000 × g 离心15分钟。用500 µL 75%乙醇洗涤沉淀的RNA沉淀物。</li>
	<li>在室温下干燥RNA沉淀5–10分钟。注意不要过度干燥，否则后续难以溶解。</li>
	<li>将核糖核酸酶抑制剂按1:100比例稀释于无核酸酶水中，取100 µL该溶液重悬干燥的RNA沉淀。轻轻涡旋混匀，直至沉淀完全溶解。</li>
	<li>测定RNA的质量和浓度。确保260/280比值约为2.0，260/230比值在2.0–2.2范围内（见材料表）。</li>
	<li>取5 µg提取的RNA进行DNase消化。将5 µL 10×缓冲液、1 µL核糖核酸酶抑制剂酶、2 µL DNase酶、5 µg RNA混合，并用无核酸酶水补足至50 µL总体积。在室温下孵育30分钟。
	<ol>
		<li>加入6 µL失活试剂，在室温下孵育2分钟，期间偶尔涡旋混匀。在10,000 × g 下离心1分钟。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。 
		注：该RNA包含幼虫RNA以及用于口服给药的相应菌株的细菌RNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 灌胃后细菌16S拷贝数的定量分析
注意：表达的细菌16S拷贝数通过第4节中提取的RNA反转录合成的cDNA进行测定。最终定量通过标准曲线计算得出，该标准曲线使用含有 B. vulgatus 或 E. coli 的16S PCR片段克隆的质粒构建。
<ol>
	<li>质粒标准品的制备
	<ol>
		<li>扩增16S片段 E. coli mpk 或 B. vulgatus 通过PCR扩增mpk基因组DNA。混合 10 µL 5×缓冲液 1 µL 10 mM dNTP 溶液 2.5 µL 的 10 µM 上游引物和 2.5 µL 的 10 µM 反向引物稀释液， 1 µL DMSO 1 µL 基因组DNA模板 31.5 µL 无核酸酶水 0.5 µL 校对酶</li>
		<li>运行PCR（初始变性： 98 °C 30 秒，变性： 98 °C 10 秒，退火： 60 °C 30秒，延伸： 72 °C 30 秒，最终延伸： 72 °C 5分钟，重复变性、退火和延伸30个循环。
		<ol>
			<li>使用16S E. coli 引物（p_forward：GTTAATACCTTTGCTCATTGA，p_reverse：ACCAGGGTATCTAATCCTGTT）17，320 bp）或16S B. vulgatus 引物（p_forward：AACCTGCCGTCTACTCTT，p_reverse：CAACTGACTTAAACATCCAT）18，400 bp）用于扩增。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 E. coli 和 B. vulgatus 用于平末端克隆的16S PCR片段，连接反应体系的设置与混合 10 µL 2×缓冲液 1 µL 非纯化的PCR产物 1 µL 平末端克隆质粒 7 µL 无核酸酶水 1 µL T4 DNA连接酶。室温孵育连接反应10分钟。</li>
		<li>准备 E. coli DH5α 感受态细胞
		<ol>
			<li>在锥形瓶中，将1 mL过夜培养物接种至100 mL LB培养基中。培养至OD600 nm达到0.4–0.6。将培养物均分为两份，分别加入两个50 mL离心管中，并将离心管置于冰上孵育10分钟。</li>
			<li>将培养物在 1,700 x g 10 分钟 4 °C. 弃去上清液，每份沉淀物用 5 mL RFI 溶液（30 mM CH）小心重悬3COOK，100 mM KCl，10 mM CaCl，50 mM MnCl2，用冰醋酸调节pH至5.8，经无菌滤膜过滤。每根试管中再加入45 mL RFI溶液。</li>
			<li>将培养物在 1,700 x g 10 分钟 4 °C. 弃去上清液，用6 mL RFII（10 mM MOPS，15 mM CaCl₂）小心重悬每份沉淀2，10 mM KCl，15% 甘油，经高压灭菌）溶液。合并两部分组分，将12 mL悬浮液在冰上孵育15分钟。制备细胞悬浮液等分试样（200 µL). 将分装样品储存于 -80 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将连接反应产物转移至一份感受态细胞中 E. coli DH5α细胞并在冰上孵育15分钟。将细胞在45秒内进行热激处理。 42 °C 加入1 mL LB培养基。
		<ol>
			<li>在37°C下孵育转化反应45分钟 37 °C添加 100 µL 于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上涂布转化产物，并在37°C过夜培养 37 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对步骤5.1.5中LB琼脂平板上获得的8个转化子进行菌落PCR。用牙签挑取每个菌落，先将其点种到含氨苄青霉素的新鲜LB平板（主平板）上，再将同一根牙签浸入含有 5.5 µL 在PCR条带中加入无核酸酶水。
		<ol>
			<li>添加 7.5 µL 2x PCR 混合液 0.5 µL 的 10 µM 上游引物和 0.5 µL 的 10 µM 反向引物稀释。使用第5.1.1节中提到的相同引物对。</li>
			<li>进行PCR（初始变性： 95 °C 5分钟，变性： 95 °C 1 分钟，退火： 60 °C 30秒，延伸： 72 °C 1 分钟，最终延伸： 72 °C 7分钟，重复变性、退火和延伸35个循环。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在1%琼脂糖凝胶上验证16S片段的大小。使用0.5×Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液溶解1 g琼脂糖，并在微波炉中煮沸。向凝胶中加入1:50,000的染料，混匀后倒入制胶模具。将菌落PCR反应产物和100 bp DNA Ladder加样至凝胶孔中，在110 V电压下电泳运行45分钟。</li>
		<li>接种一环来自主平板（第5.1.6节）的单克隆至5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，每种样品分别处理 E. coli 和 B. vulgatus 含有正确插入片段大小的16S质粒。
		<ol>
			<li>将细菌过夜培养物在2 mL离心管中以1,700 x g弃去上清液，将沉淀重悬于 600 µL 无菌水</li>
			<li>添加 100 µL 加入裂解缓冲液，通过倒置离心管6次混匀。添加 350 µL 冷的4°C）中和溶液，通过倒置试管彻底混匀。</li>
			<li>以最大转速离心 3 min。转移上清液（~900 µL)加入离心柱中，于离心机中以最大速度离心15秒。</li>
			<li>弃去流穿液，并加入 200 µL 加入内毒素去除洗涤液，于离心机中以最大速度离心15秒。</li>
			<li>添加 400 µL 向柱中加入洗涤液，在离心机中以最大速度离心30 s。将柱转移至一支干净的1.5 mL离心管中，加入 30 µL 向柱中加入洗脱缓冲液，在室温下孵育1分钟。</li>
			<li>以最大转速离心30秒（见 材料表).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过混合测定质粒DNA浓度 1 µL 质粒DNA的 199 µL 工作溶液的1 µL 每单位荧光染料 199 µL 每反应加入适量缓冲液。通过混合制备两个标准品 10 µL 标准1或 10 µL 标准品2的 190 µL. 将样品管和标准管涡旋混匀，反应孵育2分钟。测定浓度（参见 材料表).</li>
		<li>在10至100,000拷贝范围内，以10倍系列稀释法配制标准浓度：计算单个质粒的质量（m = (n) × (1.096×10⁻²¹ g/bp)，其中n为质粒大小，m为质量）。计算含有目标拷贝数所需的质粒DNA质量（目标拷贝数 × 单个质粒质量 = 所需质粒DNA质量）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品定量前的制备
	<ol>
		<li>合成 cDNA。混合 2 µL 7x 缓冲液 1 µL 第4步中经DNase消化的RNA 11 µL 无核酸酶水。在2分钟内孵育 42 °C.
		<ol>
			<li>将反应物立即置于冰上。混匀 4 µL 5x RT缓冲液 1 µL 逆转录酶引物混合液 1 µL RT酶及第5.2.1步反应。在15分钟内于 42 °C孵育3分钟于 95°C 以灭活RT酶。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用荧光法测定cDNA浓度，方法如步骤5.1.9所述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌载量的测定
	<ol>
		<li>将cDNA浓度调整至每份5 ng 12 µL 用于定量PCR的反应。混合2x RT-PCR反应液， 0.25 µL 的 100 µM 上游引物， 0.25 µL 的 100 µM 反向引物（5.1.1）和 12 µL 调整后的cDNA。进行qPCR（初始变性： 95 °C 5分钟，变性： 95 °C 10 秒，退火： 60 °C 30秒，重复变性与退火步骤35个循环，熔解： 95 °C，冷却至 4 °C).</li>
		<li>绘图日志10 质粒标准曲线浓度（10-100,000 拷贝），即 1-5（x 轴），对相应的 ct 值（y 轴）进行线性回归，得到回归方程。解该方程求 x（浓度）。使用该公式计算 log10 通过将ct值代入公式来计算拷贝数。计算其反对数以获得拷贝数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 使用定量 RT-PCR 检测先天免疫标志物基因
<ol>
	<li>通过 PCR 及随后的琼脂糖凝胶电泳检测引物的基因特异性，以验证扩增片段大小是否正确。PCR 操作步骤如第 5.1.5 节所述。 
	泛素 130 bp：上游引物 TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC，下游引物 CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19（内参基因） 
	Nox-4 159 bp：上游引物 TGGCACGGCATCAGTTATCA，下游引物 ACAGCGACTGTCATGTGGAA8 
	Nos 76 bp：上游引物 ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA，下游引物 GCCATTTTACAATCGCCACAA8 
	Gst 156 bp：上游引物 GACAGAAGTCCTCCGGTCAG，下游引物 TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8 
	ApoIII 265 bp：上游引物 AGACTTGCACGCCATCAAGA，下游引物 TGCATGCTGTTTGTCACTGC8 
	hemolin 267 bp：上游引物 CTCCCTCACGGAGGACAAAC，下游引物 GCCACGCACATGTATTCACC8 
	gallerimycin 161 bp：上游引物 GAAGTCTACAGAATCACACGA，下游引物 ATCGAAGACATTGACATCCA8 
	cecropin 158 bp：上游引物 CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT，下游引物 GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8 
	gloverin 101 bp：上游引物 GTGTTGAGCCCGTATGGGAA，下游引物 CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8 
	moricin 124 bp：上游引物 GCTGTACTCGCTGCACTGAT，下游引物 TGGCGATCATTGCCCTCTTT8）
	</li>
	<li>评估引物扩增效率应为 E=2。
	<ol>
		<li>取 2 µL 的 5–10 种不同阳性样本混合（即表达待检测引物对所针对基因的样本）。</li>
		<li>制备样本混合液的 1:5 梯度稀释系列：标准品 1（S1）：未稀释的混合液；S2：2 µL S1 + 8 µL 无核酸酶水；S3：2 µL S2 + 8 µL 无核酸酶水；S4：2 µL S3 + 8 µL 无核酸酶水。</li>
		<li>将 1 µL 的 S1–S4 样本及无模板对照（无核酸酶水）加入 96 孔 qPCR 板中。每孔加入 5 µL RT 主混合液、0.1 µL 的 100 µM 上游引物和下游引物各一种、3.7 µL 无核酸酶水以及 0.1 µL RT 混合液。</li>
		<li>运行定量 RT-PCR（反转录：50 °C 10 分钟，初始变性：95 °C 5 分钟，变性：95 °C 10 秒，退火：60 °C 30 秒，重复变性与退火 40 个循环，熔解曲线：95 °C，冷却至 4 °C）。</li>
		<li>以 S1–S4 的相对单位对数值 log10（1, 0.2, 0.04, 0.008）为横坐标（x 轴），对应 ct 值为纵坐标（y 轴）作图。进行线性回归分析，确定标准曲线的斜率，并计算扩增效率 E：E = 10-(1/斜率)。20 
		注：斜率为 -3.32 表示反应条件理想，引物扩增效率为 E=2.00，即每个循环中 PCR 产物量翻倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以 100 ng 消化后的 RNA（100 ng/µL）作为 RT-PCR 的模板。配制 RT-PCR 试剂并按照第 6.2 节所述运行 RT-PCR。使用内参基因引物对和目标基因引物对分别检测所有细菌处理组和 DPBS 处理组样本。为评估扩增效率，每次实验均需在同一块 qPCR 板上同时运行内参基因引物对和目标基因引物对的 S1–S4 稀释样本。</li>
	<li>根据实验测定的内参基因和目标基因引物对的扩增效率，使用以下公式计算 RNA 基因表达的相对比率（R）。将细菌刺激组样本相对于模拟处理对照组进行归一化处理20。 
	<img alt="qPCR 相对定量公式；基因表达分析方程；ΔCт 计算方法。" src="/files/ftp_upload/59270/59270eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
	R：比率 
	Etarget：使用目标基因引物对测得的 S1–S4 扩增效率 
	Ehousekeeping：使用内参基因引物对测得的 S1–S4 扩增效率 
	Δcttarget(control-sample)：使用目标基因引物对测得的（DPBS 处理样本 ct 值）减去（细菌处理样本 ct 值）的 Δct 值 
	Δcthousekeeping(control-sample)：使用内参基因引物对测得的（DPBS 处理样本 ct 值）减去（细菌处理样本 ct 值）的 Δct 值</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

G. mellonella 模型是一种常用于评估细菌毒力因子的全身感染模型21。由于许多病原体和细菌通过口腔定植或感染途径进入宿主，因此需要获得新的认识，以评估G. mellonella 作为口腔定植和感染模型的价值。
能够在15-37 °C范围内饲养G. mellonella是一个显著优势，因为大多数哺乳动物模型的体温维持在37 °C5。G. mellonella幼虫可从不同供应商处购买，但建立自有的繁殖种群具有诸多优点，例如避免了可能干扰实验的抗生素残留，能够更准确地预估实验起始时间（因为供应商并不总能提供适合直接使用的幼虫阶段），并避免了因运输或温度变化引起的应激反应。由于G. mellonella具有较宽的温度耐受范围，其繁殖可在较广的温度区间内进行。较高温度可促进幼虫更快发育，根据繁殖温度，我们可以估算从卵到末龄幼虫的整个生命周期。用于实验的幼虫仅选择体色浅且活动迅速的个体，以避免任何应激...

肠道微生物组是维持稳态的重要组成部分，涉及先天性和适应性免疫反应1,2。共生微生物群落的特征在于其主要的共生成分：一类是通过重要的免疫调节功能发挥有益作用的共生菌，另一类是在遗传易感宿主中可能产生有害效应并促进和触发肠道炎症的致病菌3,4。目前已有大量关于共生菌和致病菌及其对宿主免疫系统影响的研究，主要集中在适应性免疫反应方面。
由于这些研究涉及大量动物，且实验动物的保护与替代日益受到公众关注，因此我们致力于寻找一种替代模型，以实现对不同细菌免疫原性特征的筛选。昆虫，尤其是 Galleria mellonella，是感染研究中广泛使用的替代模型。G. mellonella 具备多种优势，如成本低、通量高；可实现细菌的口服给药，即自然暴露途径；也可建立全身性感染5,6。G. mellonella 还可在 37 °C 下培养，该温度是哺乳动物的生理体温，也是细菌毒力因子表达的最佳条件5。G. mellonella 的主要优势在于其保守的先天免疫系统，能够区分“自我”与“非自我”，并编码多种模式识别受体，如载脂多糖蛋白（apolipophorin）和调理素血淋素（hemolin）6,7。在识别微生物后，G. mellonella 可触发多种下游体液免疫反应，包括诱导氧化应激反应并分泌活性氧（ROS），该过程涉及NOS（一氧化氮合酶）和NOX（NADPH氧化酶）的活性6,8。此外，G. mellonella 可激活强烈的抗菌肽（AMP）反应，分泌多种不同的AMP混合物，如gloverin、moricin、cecropin以及类防御素gallerimycin6,8,9,10。总体而言，AMP对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌具有较广的宿主特异性，且必须提供强有力的免疫应答，因为昆虫缺乏适应性免疫反应10。Gloverin 是一种对细菌和真菌具有活性的抗菌肽，可抑制外膜的形成6,11。Moricin 通过穿透细胞膜并形成孔道，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌发挥抗菌作用9,11。Cecropin 对细菌和真菌具有活性，其作用机制与 moricin 类似，均可使细胞膜通透化9,10。Gallerimycin 是一种具有抗真菌特性的类防御素肽9。有趣的是，研究发现 cecropin 与 gallerimycin 联合使用对 E. coli 具有协同抗菌活性10。
由于G. mellonella幼虫使用简便，常被用作评估细菌致病性的感染模型。尤其是一些研究发现，在G. mellonella中获得的数据与小鼠实验数据具有相关性，这进一步支持了该替代宿主模型的有效性。研究发现，在小鼠感染模型中致病性最强的单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）血清型，经系统性感染后也会导致G. mellonella更高的死亡率。此外，毒力较弱的血清型在G. mellonella模型中也表现出较低的毒力12。类似的结果也见于人类致病性真菌白色念珠菌（Candida albicans）。通过系统性感染并随后监测幼虫存活率，可评估不同C. albicans菌株的毒力。在小鼠中无毒力的菌株在G. mellonella中同样无毒或毒力降低，而对小鼠具有毒力的菌株也会导致幼虫高死亡率13。此外，G. mellonella模型还可用于鉴定铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的III型分泌系统致病因子14。
由于大多数涉及G. mellonella的研究主要集中在利用全身感染模型分析毒力因子，因此我们特别希望提供一种适用于口服灌胃模型中肠道共生菌分析的方法。在此模型中，可对每只幼虫施加明确剂量的细菌，不仅能够观察幼虫的死亡率，还能分析先天免疫反应的不同标志物，以维持肠道稳态。
我们的方法通过结合细菌应用与RNA表达分析，有助于提升G. mellonella作为替代模型的使用价值。该方法不仅在细菌致病性研究中具有重要意义，尤其在纳入口服给药后的免疫应答分析时，而不仅限于系统性感染后死亡率的观察。此外，由于本方法在活体生物中提供了肠道屏障，相较于细胞培养具有更复杂的生理条件，因此可用于分析细菌非致病性共生菌的免疫原性特性。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA 标准分子量标记&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>1-溴-3-氯丙烷（BCP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>2x Mangomix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25033</td><td>菌落 PCR</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210 261</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>蜂蜡</td><td>Mixed-Store.de</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸出液肉汤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>CloneJET PCR 克隆试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1232</td><td>用于 16S 片段的克隆载体</td></tr><tr><td>玉米粗粉</td><td>Osterm&amp;uuml;hle Naturkost GmbH</td><td>306</td><td>有机种植</td></tr><tr><td>Difco LB 琼脂，Miller 型（Luria-Bertani）</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB 肉汤，Miller 型（Luria-Bertani）</td><td>Becton Dickinson</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>DNA-free DNA 去除试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>244510</td><td>&amp;nbsp;DNA 酶消化</td></tr><tr><td>干酵母</td><td>Rapunzel</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>有机种植</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W252506</td><td></td></tr><tr><td>蜂蜜</td><td>Osterm&amp;uuml;hle Naturkost GmbH</td><td>487</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>20842.330</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 仪器 II</td><td>Roche Molecular Systems</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 96 孔白色多孔板</td><td>Roche Molecular Systems</td><td>4729692001</td><td></td></tr><tr><td>带数字显示的手动微量注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>DMP</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine+ U-100 胰岛素注射器 0.3 x 8 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>324826</td><td>口服给药</td></tr><tr><td>未上釉研钵</td><td>VWR</td><td>410-9327&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>Oxoid 厌氧培养袋&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AN0025A</td><td>RNA 质量与数量</td></tr><tr><td>PCR 条形管</td><td>Biozym</td><td>710970</td><td></td></tr><tr><td>未上釉研杵，研磨面</td><td>VWR</td><td>410-9324&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F553S</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>Biomers</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>PureYield 质粒小提系统</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFast SYBR Green PCR 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>204056</td><td>用于细菌拷贝数测定的 qPCR</td></tr><tr><td>QuantiFast SYBR Green RT-PCR 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>204156</td><td>用于基因表达检测的 qRT-PCR</td></tr><tr><td>QuantiTect 反转录试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsHS DNA 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>质粒和 cDNA 样品定量</td></tr><tr><td>Qubit 荧光仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td>质粒和 cDNA 样品定量</td></tr><tr><td>RNase-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7153</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Sucofin</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>TRI 试剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>称量舟</td><td>VWR</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr><td>小麦粉</td><td>Osterm&amp;uuml;hle Naturkost GmbH</td><td>6462</td><td>有机种植</td></tr></tbody></table>

一种利用galleria mellonella口服给药模型研究共生菌诱导的先天免疫反应

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

研究共生细菌对宿主免疫系统的免疫原性潜力，是探讨肠道宿主-微生物相互作用的一个关键组成部分。已有充分证据表明，不同的共生菌在刺激宿主肠道免疫系统方面具有不同的能力。这类研究通常涉及脊椎动物，尤其是啮齿类动物。由于涉及脊椎动物的实验引发的伦理问题日益受到关注，因此迫切需要开发无脊椎动物替代模型。
本文提供了一种利用共生性非致病菌通过口服途径在Galleria mellonella中进行给药的模型，并评估这些共生菌对G. mellonella免疫系统免疫原性潜力的可能方法。我们证明，G. mellonella是一种有用的无脊椎动物替代模型，可用于分析具有不同免疫原性潜力的共生菌，例如Bacteroides vulgatus和Escherichia coli。有趣的是，这些细菌对幼虫无杀伤效应，这一点与哺乳动物相似。G. mellonella的免疫反应与脊椎动物的先天免疫反应相似，包括对细菌的识别以及抗菌分子的产生。我们提出，G. mellonella能够恢复先前的微生物群平衡，这一点在健康的哺乳动物个体中已有明确报道。尽管G. mellonella与脊椎动物在先天免疫反应方面具有可比性，但G. mellonella并不具备适应性免疫系统。由于先天免疫系统中所研究的组分在进化上是保守的，该模型可用于细菌免疫原性特征的初步筛选和初步分析。

G. mellonella 血淋巴感染模型被广泛用于分析多种病原体的毒力因子。大多数检测包括对幼虫死亡率的分析，这是一种相对简便的方法。然而，该方法无法对整体免疫应答得出结论，也难以将 G. mellonella 的免疫反应结果与脊椎动物的免疫机制相联系。另一方面，G. mellonella 口服给药模型由于难以获得精确的感染剂量，目前极少用于幼虫的口服感染或定植研究9。此外，关于 G. mellonella 对非致病菌（尤其是哺乳动物肠道共生菌）的先天免疫应答，目前所知甚少。
与病原体不同，共生微生物会对宿主构成挑战并触发免疫反应，但宿主免疫系统能够维持免疫稳态。 G. mellonella 能够清除最初灌胃给予的细菌载量，直至最终无法再检测到细菌（图2)...

本文提供了一种利用大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫进行口服给药的详细实验方案，以及如何表征其诱导的先天免疫反应。通过本方案，即使缺乏实际操作经验的研究人员也能够掌握大蜡螟（G. mellonella）强制喂食技术。

一种利用Galleria mellonella口服给药模型研究共生菌诱导的先天免疫反应

研究共生细菌对宿主免疫系统的免疫原性潜力是研究肠道……的一个关键组成部分

本实验方案拓展了大蜡螟（G. mellonella）的应用范围，使其从系统性感染模型发展为可通过自然口服途径进行细菌接种的模型。大蜡螟幼虫适合作为啮齿类动物的替代模型，用于分析先天性微生物-宿主相互作用的多种特征，因其可用于研究人类致病菌。首先，将成年蛾产下的卵转移至含有蜡螟培养基的2升培养盒中，在30摄氏度、避光条件下培养。一到两周后，当观察到出现小型和微小的幼虫时，将含有幼虫的基质25克转移至新鲜基质中。在两周后根据幼虫大小进行同步化，将每组30至40只幼虫放入新的两升容器中，置于蜡螟基质上。再经过两周后，根据体重挑选用于实验的幼虫。仅使用体质量为180至200毫克的浅色、快速活动的幼虫。为强制喂食幼虫，使用带有钝头针头的胰岛素注射器进行口服接种，每只幼虫接种1×10⁷个细菌溶于10 µL DPBS的溶液。将注射器装入微量注射泵中。等待幼虫张开其口器后，小心地将注射器插入下颚之间并注入细菌。所有幼虫接种完成后，将动物置于37摄氏度避光环境中孵育1至24小时。处理幼虫时，使用乙醇清洁生物安全柜，并喷洒防止RNase污染的试剂。将活的幼虫在液氮中迅速冷冻。使用研钵和研杵，加入少量液氮，研磨每只冷冻的幼虫。当形成粉末状匀浆后，将匀浆转移至一次性称量舟中，并等待液氮完全挥发。当所有幼虫均被匀浆后，将粉末状匀浆物与1毫升TRIzol在2毫升离心管中混合。室温孵育混合物1小时。孵育结束后，通过离心收集匀浆物沉淀。将上清液转移至新离心管中。向上清液中加入200 µL 1-溴-3-氯丙烷（BCP），涡旋混匀，室温孵育5分钟，随后置于冰上孵育10分钟。第二次孵育结束后，离心加入BCP的反应液，将上层透明液体转移至新的2毫升离心管中。加入500微升异丙醇，通过混合并倒置离心管5分钟，使转移的上层液体中的RNA沉淀。随后通过离心收集沉淀的RNA。用500微升75%乙醇洗涤沉淀的RNA沉淀，室温下干燥5至10分钟。乙醇完全挥发后，向干燥的RNA沉淀中加入100微升无核酸酶水中的核糖核酸酶抑制剂，轻轻涡旋混匀，直至沉淀完全溶解。采用标准方法测定RNA的纯度和浓度，确保A260/A280比值约为2，A260/A230比值在2至2.2范围内。然后根据标准方案，使用五微克（5 µg）分离得到的RNA进行DNase消化和基因表达分析。G. mellonella能够清除初始灌胃给予的细菌负荷，直至无法检测到细菌。在24小时内，B. vulgatus和E. coli的16S基因拷贝数均显著减少。共生菌处理的G.mellonella幼虫可诱导多种先天免疫标志基因的RNA表达。例如，与经B.vulgatus处理的幼虫相比，经E.coli处理的幼虫中脂多糖识别分子——载脂多糖蛋白和血细胞素的表达水平普遍更高。此外，与B.vulgatus相比，强制喂食E.coli显著上调了活性氧和活性氮物质的产生，以及抗氧化相关的GST基因表达。此外，与 B.vulgatus 灌胃相比，施用 E.coli 后可更强烈地诱导微生物肽的差异表达。请务必使用健康、体色洁白且活动迅速的幼虫，在灌胃过程中保持耐心以避免对幼虫造成应激，并包含所有必要的对照组。G.mellonella 免疫标志物的激活可通过 RUS 或 GST 活性检测直接测定，而 ANPs 的丰度则可通过细菌生长抑制实验来确定。该技术可作为共生菌和致病菌的筛选工具，并可用于研究肠道共生微生物群和致病微生物群，而无需牺牲大量脊椎动物。在使用液氮、BCP 或 TRIzol 试剂时，务必穿戴适当的个人防护装备。

a-galleria-mellonella-oral-administration-model-to-study-commensal

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科研

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Immunology and Infection

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