Name: 人牙髓干细胞神经分化过程中的分离、繁殖及普利翁蛋白表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 了解人牙髓干细胞的高效分离与增殖方法，并探索神经分化过程中普利翁蛋白的表达机制。该方案成功率达90%，为再生医学研究提供可靠的细胞来源与实验基础。

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本工作由 &#34;Fondazione Varrone&#34; 和 Rieti 大学中心 &#34;Sabina Universitas&#34; 资助 Vincenzo Mattei。
图5（A，B）经出版商Taylor &amp;#38; Francis Ltd许可转载自：Prion蛋白-EGFR多分子复合物在人牙髓源性干细胞神经元分化过程中的作用。Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santilli F., Piccoli L., Sorice M., Mattei V. Prion. 2018年3月4日。Taylor &amp;#38; Francis Ltd.

本研究中使用的第三磨牙来自13至19岁、无药物或酒精使用史、非吸烟且口腔卫生状况良好的患者。在说明当日，于口腔科学与颌面医学系 &#34;萨皮恩扎&#34; 罗马大学，在伦理考量及伦理委员会批准的基础上，已从患者或其家长处获得知情同意。
1. 牙齿与牙髓提取
<ol>
	<li>准备用于保存或运输的适当培养基。
	<ol>
		<li>制备含L-谷氨酰胺的低糖浓度杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-L）（494.5 mL）。</li>
		<li>加入5 mL青霉素/链霉素（1%）和0.5 mL两性霉素B（0.1%）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从患者体内拔除第三磨牙，迅速用PBS冲洗，放入含有培养基的15 mL试管中，并在2小时内转移至实验室。</li>
	<li>在生物安全柜中，使用切割工具沿髓室顶平行且切向进行冠部切割，打开牙齿。</li>
	<li>用小型挖匙轻柔取出牙髓组织，并将其置于试管中。</li>
	<li>用PBS洗涤三次，在室温下以2,500 × g 离心10分钟。</li>
</ol>
2. 牙髓处理与干细胞释放
<ol>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于Hank's溶液中，并置于培养皿内。在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
	<li>IV型胶原酶溶液的配制。
	<ol>
		<li>准备0.8 mL DMEM-L。</li>
		<li>将1 mg IV型胶原酶溶于0.8 mL DMEM-L中，涡旋振荡数分钟。</li>
		<li>用DMEM-L定容至1 mL，终浓度为1 mg/mL。</li>
		<li>使用0.22 µm滤器过滤溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下以2,500 × g离心10分钟，去除Hank's溶液，并用一次性手术刀片将组织碎块切成约1 mm大小的小片。</li>
	<li>将组织碎块放入培养皿中，加入1 mL IV型胶原酶，在37 °C、5% CO2条件下孵育15分钟。</li>
	<li>培养基配制（500 mL）。
	<ol>
		<li>取445 mL含L-谷氨酰胺的DMEM-L。</li>
		<li>加入50 mL胎牛血清（FBS）（10%）。</li>
		<li>加入5 mL青霉素/链霉素溶液（1%）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下以2,500 × g离心10分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于培养基（步骤2.5）中，并在T25干细胞专用培养瓶中于37 °C、5% CO2条件下进行培养。</li>
</ol>
3. 干细胞培养与扩增
<ol>
	<li>每天观察培养情况，培养 3 天后，在培养瓶中观察不同的贴壁细胞克隆。</li>
	<li>每 3 天更换一次培养基。</li>
	<li>在培养 7 至 12 天之间，当贴壁细胞达到汇合状态时，使用 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下处理 3 分钟，或轻轻使用细胞刮刀使细胞脱落。</li>
	<li>加入 4 mL（比例 1:5）的培养基（步骤 2.5）以终止胰蛋白酶的作用。</li>
	<li>将细胞悬液在 259 x g 条件下离心 6 分钟，弃去上清液，并将细胞接种至 T25 培养瓶中进行传代。 
	注意：细胞每 3 天可达到汇合状态。</li>
	<li>将细胞传代培养至 21 或 28 天（约 6–8 代），以避免培养物中出现非干细胞样细胞。</li>
	<li>使用 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下处理 3 分钟或轻轻刮取使细胞脱落，将细胞悬液在 259 x g 条件下离心 6 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并对细胞进行流式细胞术分析（步骤 6）。</li>
</ol>
4. 通过siRNA瞬时沉默PrPC
<ol>
	<li>将hDPSCs以2 × 105 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基（步骤2.5），培养24 h。</li>
	<li>次日，配制siRNA PrP培养基（400 µL）。
	<ol>
		<li>向无菌试管中加入384 µL DMEM-L。</li>
		<li>向DMEM-L中每种siRNA PrP各加入1 µL，使终浓度为5 nM（共使用4种siRNA PrP，供应商已验证其基因沉默效率≥70%）。</li>
		<li>向DMEM-L中加入12 µL转染试剂。</li>
		<li>涡旋混匀后，室温孵育10 min，以形成转染复合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个样本中加入400 μL siRNA PrP培养基，于37 °C孵育6 h。</li>
	<li>不弃去siRNA PrP培养基，直接加入1.6 mL（体积比1:5）的培养基（步骤2.5）。</li>
	<li>将细胞于37 °C继续培养72 h。</li>
	<li>移除上清液，用2 mL PBS在室温下洗涤3次。</li>
	<li>加入2 mL神经元培养基，培养7天和/或14天（步骤5.1）。</li>
	<li>每3天更换一次神经元培养基。 
	注意：每次更换神经元培养基时，均需更换siRNA PrP溶液。</li>
	<li>培养结束后，用2 mL PBS在室温下洗涤3次，并通过Western Blot分析检测神经元表面抗原。</li>
</ol>
5. hDPSCs 的神经元诱导过程
<ol>
	<li>神经元培养基制备（500 mL）。
	<ol>
		<li>准备444.7 mL专为神经元细胞配制的基础培养基。</li>
		<li>向培养基中加入50 mL无血清添加剂（10%），用于支持胚胎和成体神经干细胞的长期存活。</li>
		<li>向培养基中加入200 µL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（终浓度40 ng/mL）和100 µL表皮生长因子（EGF）（终浓度20 ng/mL）。</li>
		<li>向培养基中加入5 mL青霉素/链霉素溶液（1%）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将hDPSCs接种于6孔板中（2 × 105 个细胞/mL），自牙髓分离起培养至多28天，并用2 mL神经元培养基进行诱导。</li>
	<li>每隔3天弃去上清液，用2 mL PBS在室温下洗涤3次，并更换2 mL神经元培养基。</li>
	<li>培养7天和/或14天后，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育3分钟，或用细胞刮轻轻刮下细胞。</li>
	<li>加入4 mL（1:5比例）培养基（步骤2.5）以终止胰蛋白酶作用。</li>
	<li>通过流式细胞术分析检测神经元表面抗原的表达（步骤6）或朊蛋白的表达（步骤7）。</li>
</ol>
6. 通过流式细胞术表征人牙髓干细胞
<ol>
	<li>选择间充质基质细胞（MSC）特异性或神经元表面抗原。</li>
	<li>将hDPSCs以2 × 105 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基（步骤2.5）。</li>
	<li>在牙髓分离后第28天或神经元诱导培养基培养14天后（步骤5.1），加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，37 °C孵育3分钟，或使用细胞刮轻轻刮下hDPSCs。</li>
	<li>加入4 mL（1:5比例）培养基（步骤2.5）以终止胰酶消化作用，随后在室温下以259 × g离心6分钟。再用2 mL PBS在室温下洗涤2次。</li>
	<li>用含4%多聚甲醛的PBS溶液在4 °C固定未经处理或经处理的hDPSCs，孵育10分钟。</li>
	<li>用含0.1%（v/v）非离子型表面活性剂的PBS溶液在室温下进一步透化hDPSCs，孵育10分钟。</li>
	<li>用含5%脱脂奶粉的PBS溶液1 mL在室温下封闭1小时。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤3次，随后在室温下与以下一抗共同孵育1小时：抗CD105单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗CD44单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗STRO-1单克隆抗体（1:100/5 ×&#160;105 个细胞）、抗CD90单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗CD73单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗β3-微管蛋白单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）、抗NFH单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）以及抗GAP43单克隆抗体（1:100/5 × 105 个细胞）。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤细胞3次，随后在室温下与PE标记的抗小鼠二抗（1:50/5 × 105 个细胞）或CY5标记的抗兔二抗（1:50/5 × 105 个细胞）共同孵育1小时。</li>
	<li>使用上述二抗作为设门依据以识别免疫阳性细胞（抗小鼠PE或抗兔CY5单克隆抗体），所有样本均采用流式细胞仪分析，并至少采集20,000个事件。</li>
</ol>
7. 通过流式细胞术分析评估 hDPSCs 中 PrPC 的表达
<ol>
	<li>将hDPSCs以2 x 105 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基（步骤2.5）。</li>
	<li>在牙髓分离后第21天和第28天，以及使用神经元培养基（步骤5.1）培养7天和/或14天后，用1 mL胰蛋白酶-EDTA消化液消化hDPSCs，并按步骤6.4所述方法终止胰酶作用。用4%多聚甲醛PBS溶液在4 °C固定10分钟。</li>
	<li>用含0.1% (v/v) 非离子型表面活性剂的PBS溶液在室温下透化处理10分钟。弃去上清液后，加入兔抗PrP单克隆抗体EP1802Y（1:50/5 x 105 个细胞），室温孵育1小时进行染色。随后加入Cy5标记的抗兔二抗（1:50/5 x 105 个细胞），室温继续孵育1小时。</li>
	<li>使用流式细胞仪分析所有样本，每个样本至少采集20,000个事件。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们重点关注 hDPSCs 的分离及其向神经元分化的方法学，并进一步评估了 PrPC 在该过程中的作用。目前已有多种方法可用于 hDPSCs 的分离及其向类神经元细胞的分化，且该过程包含多个关键步骤。hDPSCs 能够向多种谱系分化，包括软骨母细胞、脂肪细胞、成骨细胞以及神经元。在本文中，我们探讨了神经元分化的机制以及 PrPC 的存在情况。如上所述，这些细胞表达典型的间充质基质细胞特异性表面抗原，如 CD44、CD90、CD105、CD73 和 STRO-110,25,26。
在本方案中，若干关键步骤可能导致分离过程失败。第一个关键步骤是患者的选择27。根据我们的经验，供体年龄增大（>20岁）会逐渐降低干细胞的增殖和分化能力。在本实验中，我们选用13至19岁、无药物或酒精使用史、非吸烟且具备良...

间充质干细胞已从多种组织中分离获得，包括骨髓、脐带血、人牙髓、脂肪组织和血液1,2,3,4,5,6。据多位研究人员报道，人牙髓干细胞（hDPSCs）具有贴壁生长特性，并呈现典型的成纤维细胞样形态。这类细胞属于高度异质性的群体，含有不同的克隆，且在增殖能力和分化潜能方面存在差异7,8。hDPSCs表达间充质干细胞特异性标志物（如CD44、CD90、CD73、CD105、STRO-1），不表达某些造血系标志物（如CD14和CD19），并具备体外多向分化潜能9,10,11。
多位研究人员已证实，通过不同的实验方案，这些细胞能够分化为类神经元细胞，方案中包括添加NGF、bFGF、EGF，并&#160;与&#160;特定培养基及补充物联合使用7,12。此外，在神经元分化过程中涉及多种蛋白质，其中多篇文献表明，细胞型朊蛋白（PrPC）在胚胎干细胞和成体干细胞中均发挥重要作用，并呈现显著表达13,14。PrPC是一种具有多效性的分子，可在细胞内执行多种功能，包括铜代谢、凋亡调控以及抗氧化应激能力15,16,17,18,19,20,21,22。
在我们之前的研究23中，探讨了PrPC在hDPSCs神经元分化过程中的作用。事实上，hDPSCs会过早表达PrPC，而在神经元分化后，可观察到其表达进一步增加。其他研究者曾假设PrPC可能在干细胞的神经元分化过程中发挥作用。确实，PrPC能够驱动人胚胎干细胞分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞24。本研究的目的是强调从牙髓中获取干细胞的方法、其分化过程以及PrPC在神经元分化期间所起的作用。

<table><tbody><tr><td>两性霉素B溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>用于补充细胞培养基，是一种来自链霉菌的多烯类抗真菌抗生素</td></tr><tr><td>抗B3微管蛋白抗体</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>#4466</td><td>六种β-微管蛋白亚型之一，在胎儿期和出生后发育过程中高度表达，在周围神经系统中保持高水平</td></tr><tr><td>抗CD105抗体&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611314</td><td>内皮糖蛋白（CD105）是人血管内皮的主要糖蛋白，为I型整合膜蛋白，具有大的胞外区、疏水性跨膜区和短的胞质尾部</td></tr><tr><td>抗CD44抗体</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体</td></tr><tr><td>抗CD73抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>13160</td><td>CD73是一种70 kDa的糖基磷脂酰肌醇锚定型膜结合糖蛋白，可催化胞外核苷单磷酸水解为具有生物活性的核苷</td></tr><tr><td>抗CD90抗体</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体</td></tr><tr><td>抗GAP43抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>#8945</td><td>是神经系统特异性的生长相关蛋白，存在于生长锥及高可塑性区域</td></tr><tr><td>抗小鼠PE抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>用于流式细胞术或FACS分析的抗体</td></tr><tr><td>抗NFH抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>#2836</td><td>可检测内源性总神经丝重链蛋白（Neurofilament-H）水平的抗体</td></tr><tr><td>抗PrP单克隆抗体EP1802Y&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>兔单克隆抗体[EP1802Y]，靶向朊病毒蛋白PrP</td></tr><tr><td>抗兔CY5抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>用于流式细胞术或FACS分析的抗体</td></tr><tr><td>抗STRO-1抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>针对间充质干细胞的阳性细胞标志物抗体</td></tr><tr><td>B27无血清培养基添加剂 CTS</td><td>Gibco by life technologies</td><td>A14867-01</td><td>B-27&amp;nbsp;可用于支持从多能干细胞（PSCs）诱导人神经干细胞（hNSCs）、hNSCs的扩增、hNSCs的分化，以及在培养中维持成熟分化的神经元</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td><td>配备蓝色激光（488 nm）和红色激光（640 nm）的流式细胞仪</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 软件&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>用于控制BD Accuri C6流式细胞仪系统，以获取数据、生成统计结果并分析实验数据</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>碱性成纤维细胞生长因子&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CL30R离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11210908</td><td>用于基于密度分离流体、气体或液体的设备</td></tr><tr><td>CO2培养箱 3541</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>确保细胞培养的最佳且可重复的生长条件</td></tr><tr><td>IV型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>胶原酶是一种蛋白酶，可切割胶原中高频出现的Pro-X-Glyc-Pro序列中中性氨基酸（X）与甘氨酸之间的肽键</td></tr><tr><td>一次性手术刀&amp;nbsp;</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td>用于切割组织</td></tr><tr><td>DMEM-L</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td>含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的低糖杜氏改良伊格尔培养基</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15</td><td>表皮生长因子&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10270-106</td><td>胎牛血清（FBS）是一种常用的培养基添加剂，因其在细胞培养中具有多种功能而广受欢迎。FBS可提供营养物质、生长和贴附因子，并通过难以在无血清培养基（SFM）系统中复制的机制保护细胞免受氧化损伤和凋亡</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0.2 µm，500 mL 瓶顶过滤器</td><td>Sarstedt</td><td>831,823,101</td><td>用于溶液过滤的装置</td></tr><tr><td>Flexitube GeneSolution for PRNP</td><td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td>针对Entrez基因5621的4种siRNA。靶序列N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&amp;nbsp; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&amp;nbsp; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&amp;nbsp; N.4&amp;nbsp; CAGTGACTATGAGGACCGTTA</td></tr><tr><td>1× Hank's溶液</td><td>Gibco by life technologies</td><td>240200083</td><td>Hanks&amp;prime;平衡盐溶液的主要功能是维持pH和渗透压平衡，同时为细胞提供水分和必需的无机离子</td></tr><tr><td>HiPerFect转染试剂&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>HiPerFect转染试剂是一种阳离子与中性脂质的独特混合物，可有效促进siRNA进入细胞并在细胞内高效释放，即使使用低浓度siRNA也能实现高效的基因沉默</td></tr><tr><td>Neurobasal A&amp;nbsp;</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10888022</td><td>Neurobasal-A培养基是一种基础培养基，专为纯化的出生后及成年脑神经元的长期维持和成熟而设计&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>多聚甲醛已用于染色过程中细胞和组织切片的固定</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D&amp;nbsp;</td><td>用于补充细胞培养基以控制细菌污染</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;（PBS）</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004LX10&amp;nbsp;</td><td>PBS是一种用于哺乳动物细胞处理和培养的平衡盐溶液。PBS可用于灌注、洗涤和稀释哺乳动物细胞。磷酸盐缓冲系统可维持生理pH范围</td></tr><tr><td>6孔细胞培养板，Cell+，F型</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>贴壁细胞的生长表面</td></tr><tr><td>组织培养瓶 T-25，Cell+，带通气盖</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>T-25组织培养瓶，聚苯乙烯材质，适用于敏感贴壁细胞（如原代细胞）的Cell+生长表面，斜颈设计，带通气盖，黄色，无菌，无热原，无细胞毒性，10个/袋</td></tr><tr><td>曲拉通X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>一种广泛使用的非离子型表面活性剂，用于在温和非变性条件下回收膜组分</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D&amp;nbsp;</td><td>胰蛋白酶可在赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的羧基端侧切割肽键。胰蛋白酶用于将贴壁细胞从培养表面解离下来</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td>15 mL离心管，120 mm × 17 mm，聚丙烯材质</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 Compact</td><td>Steril</td><td>ST-003009000</td><td>为环境和操作人员提供全面保护</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 &amp;ndash; 倒置&amp;nbsp;显微镜</td><td>Zeiss</td><td>3849000962</td><td>ZEISS Axio Vert.A1提供独特的入门级价格，支持所有对比技术，包括明场、相差、PlasDIC、VAREL、改进型霍夫曼调制对比（iHMC）、微分干涉差（DIC）和荧光。采用LED照明，适用于荧光标记细胞的温和成像。Axio Vert.A1采用符合人体工程学的设计，适用于常规工作，且体积紧凑，可置于组织培养超净台内。</td></tr></tbody></table>

人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白表达

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

与胚胎干细胞操作相关的生物伦理问题阻碍了医学研究领域的进展。因此，从脂肪组织、脐带、骨髓和血液等不同组织中获取成体干细胞显得尤为重要。在诸多可能的来源中，牙髓尤其具有吸引力，因其获取过程符合生物伦理要求。事实上，人牙髓干细胞（hDPSCs）是一类成体干细胞，能够分化为类神经元细胞，且可从健康患者（13–19岁）的第三磨牙中获得。具体而言，使用挖匙取出牙髓组织，将其切成小片，用IV型胶原酶处理后接种于培养瓶中进行培养。为诱导神经元分化，采用EGF/bFGF对hDPSCs刺激处理两周。此前，我们已证明在分化过程中，hDPSCs中细胞型朊蛋白（PrPC）的含量增加。流式细胞分析显示PrPC在早期即有表达，并在神经元分化后进一步升高。通过siRNA介导的PrPC敲除可阻断EGF/bFGF诱导的神经元分化。本文中，我们展示了通过多种简便步骤优化hDPSCs的分离、纯化及体外培养方法后，获得了更高效率的细胞克隆，并实现了间充质干细胞（MSCs）的大规模扩增。我们还表明，按照本方案所述方法获得的hDPSCs是研究MSCs神经元分化过程及其后续细胞与分子机制的优良实验模型。

从智齿牙髓中分离和纯化人牙髓干细胞（hDPSCs）的过程较为复杂，微小的操作差异可能导致失败的结果。本文采用Arthur等.12的实验方案，并进行了多项优化。代表性实验流程见图1。
hDPSCs 代表一群具有不同克隆以及增殖和分化能力差异的异质性细胞7,8在牙髓分离并接种微小牙髓组织片段后，我们观察到细胞簇在周边区域扩展。 图2 显示牙髓组织分离后1天（左图）、4天（中图）和7天（右图）的小细胞簇。通常情况下，这些细胞簇持续生长，约在7至12天之间达到汇合状态。
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本文介绍了一种人牙髓干细胞的分离与扩增方案，旨在评估朊蛋白在神经元分化过程中的表达情况。

与胚胎干细胞操作相关的生物伦理问题阻碍了医学研究领域的进展。因此，这非常……

从牙髓中获取干细胞的标准方法效率较低，这取决于多种可变因素。我们的方案使得从经过处理的牙齿中成功分离干细胞的比例达到90%。主要优势在于可在数周内获得大量细胞。这使我们能够将该细胞用于再生医学，并建立生物样本库，为其他科学家提供这一有用的工具。牙齿的切开手术将由Constantino Santacroce博士进行。随后，我实验室的博士生Stefano Martellucci（本文的第一作者）将演示该实验方案。首先，从患者口中拔除第三磨牙，用PBS快速冲洗，放入含有培养基的15毫升试管中，并在两小时内转移至实验室。在生物安全柜中，使用切割工具通过冠部切割法沿髓室顶平行且相切地切开牙齿。用小型挖匙轻柔地取出牙髓组织，置于试管中。然后，用 PBS 洗涤三次，在室温下以 2,500 × g 离心 10 分钟。离心后，弃去上清液。将沉淀重悬于 Hank's 溶液中，然后将样品转移至培养皿。在室温下以2,500 × g离心10分钟，去除Hank's溶液。然后用一次性手术刀将牙髓组织切成约1毫米厚的片状，并加入1毫升IV型胶原酶。接着在室温下以2,500 × g离心10分钟。移去上清液，并将沉淀物重悬于培养基中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，于专用于干细胞的T25培养瓶中进行培养。在孵育期间，每隔三天更换一次培养基。当贴壁细胞达到汇合状态时，向细胞中加入1毫升胰蛋白酶-EDTA溶液以使细胞脱离，于37摄氏度孵育3分钟。随后，按1:5比例加入4毫升培养基以终止胰蛋白酶作用，将细胞悬液以259 ×g离心6分钟。弃去上清液。然后，将细胞放入T25培养瓶中进行扩增。接着，在37摄氏度条件下用1毫升胰蛋白酶-EDTA消化3分钟以解离细胞。将细胞悬液在259 × g离心6分钟。弃去上清液，随后对细胞进行流式细胞分析检测。为执行瞬时朊蛋白沉默步骤，首先将人牙髓干细胞以每孔2毫升培养基接种于6孔板中，培养24小时。然后，向每个样品中加入400 µL的小干扰RNA PrP培养基，在37 °C条件下孵育6小时。不弃去siRNA PrP培养基，按1:5比例加入1.6毫升培养基，将细胞置于37摄氏度条件下培养72小时。孵育结束后，移除上清液，并在室温下用2毫升PBS洗涤细胞三次。随后加入2毫升神经元培养基，将细胞置于37摄氏度培养箱中继续培养7至14天。孵育结束后，在室温下用两毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，随后进行蛋白质印迹分析，以检测神经元表面抗原。为进行神经元诱导，将200万个人大牙髓干细胞接种于六孔板中，自牙髓分离后培养最多28天。每三天更换一次培养上清液。在室温下用两毫升磷酸盐缓冲液洗涤三次，更换两毫升神经元培养基。培养7至14天后，在37摄氏度条件下用一毫升胰蛋白酶-EDTA消化三分钟以解离细胞。然后按1:5的比例加入四毫升培养基以终止胰蛋白酶作用。为通过流式细胞术表征人牙髓干细胞，将每毫升200万个细胞接种于六孔板中，每孔加入2毫升培养基进行培养。在牙髓分离后第28天或神经元培养基额外培养14天后，加入1毫升37摄氏度的胰蛋白酶-EDTA溶液，作用3分钟以使细胞脱落。随后，按1:5比例加入4毫升培养基以终止胰蛋白酶活性，并在室温下以259 × g离心6分钟。在4°C条件下，用300微升含4%多聚甲醛的PBS固定未处理或已处理的细胞，孵育10分钟。接着离心，弃去上清液，并在室温下用含1%非离子型表面活性剂的PBS对细胞进行透化处理，持续10分钟。然后再次离心，弃去上清液，再加入1毫升含5%脱脂奶粉的PBS，在室温下封闭1小时。用1毫升PBS洗涤三次，然后在室温下用抗CD105、抗CD44、抗STRO-1、抗CD90、抗CD73、抗beta-three-tubulin、抗NFH和抗GAP43单克隆抗体孵育细胞1小时。接着，以1毫升PBS为洗涤液，每隔6分钟离心一次，连续离心三次，随后在室温下用抗小鼠PE或抗兔CY5单克隆抗体再孵育1小时。使用二抗对免疫阳性细胞进行设门，所有样品均用流式细胞仪进行分析。将人牙髓干细胞以每毫升200万个细胞的密度接种于六孔板中，每孔加入2毫升培养基进行培养。在牙髓分离后21天和28天，或在神经元培养基中额外培养7至14天后，每孔加入1毫升37摄氏度的胰蛋白酶-EDTA溶液，作用3分钟以使细胞脱落。随后离心，弃去上清液，并在4摄氏度条件下用含4%多聚甲醛的PBS固定标本10分钟。接下来，离心，弃去上清液，然后在室温下用含1%非离子型表面活性剂的PBS溶液透化处理10分钟。去除上清液后，在室温下用兔抗PrP单克隆抗体孵育细胞1小时进行染色。最后，离心并弃去上清液，再在室温下与抗兔CY5单克隆抗体孵育额外1小时。使用流式细胞仪分析所有样品。在牙髓分离后，人牙髓干细胞簇在边缘区域扩增。通过EGF/bFGF诱导神经元分化前后，这些细胞的生长情况进行比较，结果显示细胞形态和神经突起生长发生了显著变化。未经处理的人类牙髓干细胞表达多种多能间充质基质细胞特异性表面抗原，如 CD44、CD90、CD105、CD73 和 STRO-1。在适当的神经元诱导刺激后，这些细胞表达特异性神经元标志物，如 βIII-微管蛋白、NFH 和 GAP43。未经处理或经处理的细胞均不表达造血细胞标志物，如 CD14 和 CD19。28天后，与相应的阴性对照相比，人牙髓干细胞中朊蛋白提前表达，并且在EGF/bFGF诱导的神经元分化过程后其表达水平进一步升高。Western blot分析显示，在EGF/bFGF刺激前通过小RNA（sRNA）沉默朊蛋白可影响人牙髓干细胞的神经元分化过程，抑制神经元标志物β-III微管蛋白和NHF的表达。最重要的是选择合适的酶以从牙髓组织中分离细胞。事实上，如果酶的作用过于强烈，细胞可能会受到损伤，其生长和分化能力也可能受到影响。牙髓干细胞是一种优秀的实验模型，可用于再生医学领域的体内和体外研究。由于PrP在牙髓干细胞的神经元分化过程中发挥关键作用，该标志物可能成为治疗神经退行性疾病的有效靶点。最重要的建议事项是患者的身体健康状况，例如不存在传染性疾病。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人牙髓干细胞神经分化过程中的分离、繁殖及普利翁蛋白表达

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

本视频展示了一种利用Transwell小室建立三叉神经元与原代牙髓细胞共培养的技术。在这种物理分离的条件下，从牙髓组织中获得的间充质细胞会分泌旁分泌信号分子，这些分子可通过小室的孔隙穿过，促进神经元向间充质细胞方向分化和迁移，从而建立共培养系统。...

建立牙髓细胞与三叉神经元的共培养体系以实现交互通讯

本视频展示了通过转染携带受四环素反应元件调控的神经发生转录因子基因的工程化慢病毒，诱导人多能干细胞分化为神经元，并随后用四环素衍生物和成熟培养基处理的过程。...

利用基因工程慢病毒实现人多能干细胞向神经元的分化

该实验通过模拟人类发育过程中所经历的类似检查点，获得端脑神经元。细胞首先被允许自发分化，随后暴露于促使其向神经谱系分化的因子中，再经过分离后接种至盖玻片上，以促进其终末分化与成熟。...

从人类多能干细胞诱导端脑谷氨酸能神经元的特化

本方案描述了对从人牙囊中提取的牙源性干细胞进行瞬时基因工程改造的方法。所采用的非病毒性修饰策略可为改进治疗用干细胞产品提供基础。...

人牙囊干细胞的分离、鉴定及基于微小RNA的遗传修饰

我们描述了牙髓（DP）原代细胞的分离、分散和接种，并在上层的transwell小室滤膜上共培养三叉神经节（TG）神经元。可通过免疫荧光或RNA/蛋白质分析来检测DP细胞的细胞反应。利用共聚焦显微镜进行神经元标志物的免疫荧光染色，可分析神经突的生长反应。...

一种共培养方法用于研究神经突起对牙髓旁分泌信号的反应性生长

本文提供了利用组织块培养法建立牙髓干细胞原代培养的逐步操作指南，并依据ICSCRT指南对这些细胞进行表征。通过本方案分离获得的细胞可被视为间充质干细胞，用于后续应用。...

牙髓干细胞的原代培养

本方案重点介绍通过酶消化法从牙髓中分离、培养和保存多能干细胞的方法。此外，还展示了这些细胞向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能，强调了操作过程中精确性和一致性的关键作用。...

从人类乳牙和恒牙中分离、培养及鉴定牙髓干细胞

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。...

人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

本方案描述了从猪皮下脂肪组织中分离猪脂肪源性干细胞（pADSC）并检测其多向分化潜能的方法。这种具有多向分化潜能的pADSC可用于阐明脂肪细胞分化过程，并研究其向中胚层间充质或其他外胚层和内胚层谱系细胞的转分化，以用于再生医学研究。...

从猪皮下脂肪组织中分离与分化脂肪源性干细胞

了解人牙髓干细胞的高效分离与增殖方法，并探索神经分化过程中普利翁蛋白的表达机制。该方案成功率达90%，为再生医学研究提供可靠的细胞来源与实验基础。

人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白表达

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