人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白的表达

从牙髓中获取干细胞的标准方法效率较低，这取决于多种可变因素。我们的方案使得在90%的病例中成功分离出经处理牙齿中的干细胞成为可能。主要优势在于可在数周内获得大量细胞。

这使我们能够将该细胞用于再生医学，并建立生物样本库，为其他科学家提供这一有用的工具。牙齿的切开操作将由Constantino Santacroce博士完成。随后，我实验室的博士生Stefano Martellucci（本文的第一作者）将演示该实验方案。

首先，从患者体内拔除第三磨牙，用 PBS 快速冲洗，放入含有培养基的 15 毫升试管中，并在两小时内转移至实验室。在生物安全柜中，使用切割工具通过冠部切割法沿髓室顶平行且相切地切开牙齿。用小型挖匙轻柔地取出牙髓组织，并将其置于试管中。

然后，用 PBS 洗涤三次，在室温下以 2,500 × g 离心 10 分钟。离心后，弃去上清液。将沉淀重悬于 Hank's 溶液中，然后将样品转移至培养皿中。

在室温下以2,500 × g离心10分钟，去除Hank's溶液。然后用一次性手术刀将牙髓组织切成约1毫米厚的片状，并加入1毫升IV型胶原酶。接着，在室温下以2,500 × g离心10分钟。

弃去上清液，并将沉淀重悬于培养基中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，于专用于干细胞的T25培养瓶中进行培养。培养期间，每三天更换一次培养基。

当贴壁细胞达到汇合状态时，向细胞中加入1毫升胰蛋白酶-EDTA溶液以使细胞脱离，于37摄氏度孵育3分钟。随后，按1:5比例加入4毫升培养基以终止胰蛋白酶作用，将细胞悬液以259 × g离心6分钟。弃去上清液。

然后，将细胞放入T25培养瓶中进行扩增。接着，在37摄氏度条件下用1毫升胰蛋白酶-EDTA消化3分钟以分离细胞。将细胞悬液在259 × g离心6分钟。

弃去上清液，随后对细胞进行流式细胞分析检测。为进行朊蛋白的瞬时沉默步骤，首先将人牙髓干细胞以每孔2毫升培养基接种于六孔板中，培养24小时。然后向每个样品中加入400微升的小干扰RNA PrP培养基，并在37摄氏度下孵育6小时。

不弃去siRNA PrP培养基，按1:5比例加入1.6毫升培养基，将细胞置于37摄氏度条件下培养72小时。孵育结束后，移除上清液，在室温下用2毫升PBS洗涤细胞三次。然后加入2毫升神经元培养基，将细胞置于37摄氏度培养箱中继续培养7至14天。

孵育结束后，在室温下用两毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，随后进行蛋白质印迹分析，以检测神经元表面抗原。为进行神经元诱导，将200万个入牙髓干细胞接种于6孔板中，自牙髓分离后培养至多28天。每三天更换一次培养上清液。

在室温下用两毫升磷酸盐缓冲液洗涤三次，更换两毫升神经元培养基。培养7至14天后，在37摄氏度条件下用一毫升胰蛋白酶-EDTA消化三分钟以解离细胞。然后加入四毫升培养基，按1:5比例稀释以终止胰蛋白酶作用。

为通过流式细胞术表征人牙髓干细胞，将每毫升200万个细胞接种于六孔板中，每孔加入2毫升培养基进行培养。在牙髓分离后第28天或神经元培养基额外培养14天后，加入1毫升37摄氏度的胰蛋白酶-EDTA溶液，作用3分钟以使细胞脱落。随后，按1:5比例加入4毫升培养基以终止胰蛋白酶活性，并在室温下以259 × g离心6分钟。

在4°C条件下，用300微升含4%多聚甲醛的PBS溶液固定未经处理或已处理的细胞，孵育10分钟。接着，离心，弃去上清液，并在室温下用含1%非离子型表面活性剂的PBS溶液对细胞进行透化处理，持续10分钟。然后再次离心，弃去上清液，并在1毫升PBS溶液中加入5%脱脂奶粉，在室温下封闭1小时。

用1毫升PBS洗涤三次，然后在室温下用抗CD105、抗CD44、抗STRO-1、抗CD90、抗CD73、抗-beta-three-tubulin、抗NFH和抗GAP43单克隆抗体孵育细胞1小时。接着，再次用1毫升PBS连续离心洗涤三次，每次间隔6分钟，随后在室温下加入抗小鼠PE或抗兔CY5单克隆抗体，继续孵育1小时。使用二抗对免疫阳性细胞进行设门，所有样品均用流式细胞仪进行分析。

在六孔板中，用2毫升培养基以每毫升200万个细胞的密度培养人牙髓干细胞。在牙髓分离后21天和28天，或在神经元培养基中额外培养7至14天后，加入1毫升37摄氏度的胰蛋白酶-EDTA溶液，作用3分钟以使细胞脱落。随后离心，弃去上清液，再用4%多聚甲醛PBS溶液在4摄氏度下固定标本10分钟。

接下来，离心，弃去上清液，然后在室温下用含1%非离子型表面活性剂的PBS溶液透化处理10分钟。去除上清液后，在室温下用兔抗PrP单克隆抗体孵育细胞1小时进行染色。最后，离心并弃去上清液，再在室温下与抗兔CY5单克隆抗体孵育1小时。

使用流式细胞仪分析所有样品。在牙髓分离后，人牙髓干细胞簇在边缘区域扩增。通过EGF/bFGF诱导神经元分化前后，这些细胞的生长情况对比显示，细胞形态和神经突起的生长发生了显著变化。

未经处理的人牙髓干细胞表达多种间充质基质细胞特异性表面抗原，如 CD44、CD90、CD105、CD73 和 STRO-1。在适当的神经元诱导刺激后，这些细胞表达特异性神经元标志物，如 βIII-微管蛋白、NFH 和 GAP43。未经处理或经处理的细胞均不表达造血细胞标志物，如 CD14 和 CD19。

28天后，与相应的阴性对照相比，人牙髓干细胞中朊蛋白提前表达，并且在EGF/bFGF诱导的神经元分化过程后其表达水平进一步升高。Western blot分析显示，在EGF/bFGF刺激前通过小干扰RNA（sRNA）沉默朊蛋白可抑制神经元标志物βIII微管蛋白和NHF的表达，从而影响人牙髓干细胞的神经元分化过程。最重要的是选择合适的酶以从牙髓组织中分离细胞。

事实上，如果酶的作用过于强烈，细胞可能会受到损伤，其生长和分化能力也可能受到影响。牙髓干细胞是一种优秀的实验模型，可用于再生医学领域的体内和体外研究。由于PrP在牙髓干细胞的神经元分化过程中发挥关键作用，该标志物可能成为治疗神经退行性疾病的有效靶点。

需要建议的最重要方面是患者的健康状况，例如不存在传染性疾病。