Name: 使用免疫过氧化物酶和免疫荧光方法鉴定成年斑马鱼中的奥列辛和内他大麻素受体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习使用免疫过氧化物酶和免疫荧光技术鉴定成年斑马鱼中的奥列辛和内他大麻素受体分布。该方法有助于研究蛋白质在生理和病理条件下的表达变化。

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本研究由萨尼奥大学2015-2016年度校级研究基金（FRA）资助。

1. 免疫过氧化物酶实验方案
注意：斑马鱼由伊朗马什哈德费尔多西大学自然资源与环境学院渔业系Omid Safari教授提供10。
<ol>
	<li>组织解剖
	<ol>
		<li>将斑马鱼浸入冰水（5份冰/1份水，4 °C）中处死；持续放置至所有运动完全停止，以确保因缺氧而死亡。</li>
		<li>快速取出肠道和脑组织，采用以下解剖方法：
		<ol>
			<li>用纸巾擦干鱼体，将其矢状面朝下置于解剖垫上，固定眼窝腹侧部分及尾部肉质部分。</li>
			<li>对于肠道：切开皮肤，小心剥离鱼体侧面的皮肤及下方肌肉，直至内脏器官可见；从体腔中取出肠道并轻轻拉直。</li>
			<li>对于脑组织：使用剃刀片切下头部；用镊子去除颅骨腹侧的软组织；打开颅骨，移除脑腹侧的骨片；从脑背侧去除皮肤和颅骨骨片；取出脑组织。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织固定
	<ol>
		<li>将解剖所得组织浸入新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4，4 °C）中，在室温（RT）下固定3小时。
		<ol>
			<li>通过将1.755 g NaH2PO4H2O 和 4.575 g Na2HPO4 溶于450 mL去离子水（dH2O）中，配制0.1 M PB，并用1N NaOH调节pH至7.4。</li>
			<li>通过在加热板上搅拌，将4 g PFA溶于100 mL 0.1 M PB（pH 7.4）中配制4% PFA溶液。当温度达到60 °C时，加入2–4滴1N NaOH，获得澄清溶液。将4% PFA置于室温下，检测其pH值，并调节至7.4。 
			注意：组织固定时间超过4–6小时可能导致过度固定，从而掩盖抗原，限制抗体与表位的结合。固定时间应根据组织大小进行调整。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织包埋
	<ol>
		<li>将组织在0.1 M PB（pH 7.4）中浸洗5次，每次5分钟。</li>
		<li>依次将组织浸入70%酒精（6分钟）、80%酒精（6分钟）、95%酒精（5分钟）、95%酒精（5分钟）、100%酒精（1分钟）和100%酒精（1分钟）中进行脱水。</li>
		<li>将组织在100%酒精:二甲苯（1:1）中浸入10分钟，随后在二甲苯中浸入2次，每次5分钟，以透明化组织。</li>
		<li>将组织直接浸入56 °C的石蜡中，每次1小时，共两次，进行石蜡浸润。</li>
		<li>在室温（RT）下将组织包埋于石蜡块中，并在室温下保存，直至切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织切片
	<ol>
		<li>使用切片机将组织切成8 µm厚的冠状或矢状切片，并将切片交替收集到置于38 °C温水中的粘附性载玻片上。</li>
		<li>将带有切片的载玻片在37 °C下干燥过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片脱蜡与再水化
	<ol>
		<li>将切片浸入二甲苯中5分钟，随后再浸入二甲苯中3分钟，以脱蜡。</li>
		<li>依次将切片浸入100%酒精II（1分钟）、100%酒精I（1分钟）、95%酒精（1分钟）、75%酒精（1分钟）、50%酒精（1分钟），最后放入dH2O中（5分钟），以完成再水化。 
		注意：在开始反应前必须彻底脱蜡。若切片仍残留石蜡，需额外浸入二甲苯5分钟或更长时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原修复
	<ol>
		<li>将载玻片浸入柠檬酸盐缓冲液（0.01 M，pH 6.0）中，放入微波炉以最大功率加热5分钟，对切片进行处理。</li>
		<li>让切片自然冷却。</li>
		<li>重复一次5分钟最大功率微波加热循环，以完成抗原修复。
		<ol>
			<li>将2.10 g柠檬酸溶于100 mL dH2O，5.882 g柠檬酸钠溶于200 mL dH2O，分别配制溶液。按体积比1:4混合0.01 M柠檬酸钠与0.01 M柠檬酸，用0.1N HCl调节pH至6.0。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭内源性过氧化物酶
	<ol>
		<li>用耐溶剂笔在载玻片上标记组织区域。</li>
		<li>用Tris缓冲盐水（TBS）（0.1 M，pH 7.3）冲洗切片3次，每次5分钟。
		<ol>
			<li>将12.1 g Trizma碱和9 g NaCl溶于950 mL dH2O中，用0.1N HCl调节pH至7.3，配制0.1 M TBS。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将切片浸入0.75% H2O2溶液中，室温下处理5分钟，以封闭内源性过氧化物酶活性。
		<ol>
			<li>将5 mL 30% H2O2溶于195 mL dH2O中，配制0.75% H2O2溶液。 
			注意：内源性酶可能与免疫组化试剂发生反应，导致假阳性结果。此外，高度血管化的组织表达大量内源性过氧化物酶，可能导致强烈的非特异性染色和高背景。使用0.75% H2O2处理可有效淬灭内源性过氧化物酶，显著降低非特异性背景。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭非特异性结合位点及组织通透化
	<ol>
		<li>在室温下，用含正常兔血清（NRS）的TBS/0.4% Triton（TBS-T）封闭缓冲液孵育组织切片30分钟，以封闭非特异性结合位点。
		<ol>
			<li>将0.4 mL Triton X-100溶于100 mL TBS中，配制0.4% Triton溶液。</li>
			<li>将1%正常血清溶于含0.4% Triton X-100的TBS中（1 mL正常血清 + 8.2 mL TBS + 0.8 mL 0.48 Triton X-100），配制TBS-T封闭缓冲液。 
			注意：根据二抗的宿主动物选择相应种属的正常血清（例如，使用山羊抗兔二抗时，应使用正常山羊血清）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织与一抗孵育
	<ol>
		<li>在湿润盒中，室温下将切片与用TBS-T稀释的一抗溶液共同孵育过夜。使用以下一抗对切片进行染色：
		<ol>
			<li>抗OX-2R山羊抗体，1:200稀释，识别蛋白的C末端。</li>
			<li>抗OX-A山羊抗体，1:200稀释 [orexin-A (C-19)]，识别蛋白的C末端。 
			注意：确保一抗能与目标生物分子发生反应。通过基因序列比对确定一抗所识别的生物分子表位。例如，OX-A表位于人OX-A（O43612）的第50–100个氨基酸之间，而OX-2R表位位于人OX-2R蛋白C末端最后约50个氨基酸附近。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织与二抗孵育
	<ol>
		<li>用0.1 M TBS（pH 7.3）冲洗切片3次，每次5分钟。</li>
		<li>在室温下，用生物素标记的二抗（兔抗山羊IgG (H+L)）与切片孵育1.5小时，二抗用TBS-T按1:100稀释。 
		注意：需测试不同浓度的一抗和二抗，以确定最佳稀释比例，从而降低背景信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过氧化物酶反应
	<ol>
		<li>用0.1 M TBS（pH 7.3）冲洗切片3次，每次5分钟。</li>
		<li>将切片与亲和素-生物素复合物（ABC）孵育1小时。
		<ol>
			<li>在5 mL TBS中加入两滴组分A，再加入两滴组分B，配制ABC溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用0.1 M TBS（pH 7.3）冲洗切片3次，每次5分钟。</li>
		<li>用显色底物3,3’-二氨基联苯胺-4（DAB）处理切片。
		<ol>
			<li>将一滴（约30 µL）DAB显色浓缩液加入1 mL DAB稀释液中，充分混匀后使用。 
			注意：ABC溶液需至少提前30分钟配制，并在4 °C下保存，以确保亲和素与生物素稳定结合。DAB工作液需现配现用，加至组织切片后显色至颜色合适为止。当显色反应将表位位点转化为棕褐色，且信号强度适合成像时，进入下一步。DAB显色时间可能从几秒到10分钟不等；对于OX-A和OX-2R，1–2分钟即可。DAB具有致癌性，操作时需谨慎。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织脱水与封片
	<ol>
		<li>用0.1 M TBS（pH 7.3）冲洗所有切片3次，每次5分钟，以终止DAB反应。</li>
		<li>依次将切片浸入50%酒精（2分钟）、75%酒精（2分钟）、95%酒精（2分钟）、100%酒精I（2分钟）、100%酒精II（2分钟）中进行脱水。</li>
		<li>将切片浸入二甲苯中2次，每次10分钟，以透明化切片。</li>
		<li>使用DPX（邻苯二甲酸二丁酯-二甲苯）封片剂进行封片：在载玻片上滴加两滴封片剂，缓慢加盖盖玻片。 
		注意：由于脱水过程中酒精浓度逐步升高，酒精会渗透组织并取代水分，因此需精确控制脱水时间，避免过度脱水。脱水后需进行二甲苯处理，以透明组织并去除残留酒精。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照设置
	<ol>
		<li>重复步骤1.1–1.12，省略一抗，或以TBS替代一抗或二抗IgG（阴性对照）。</li>
		<li>重复步骤1.1–1.12，将每种一抗预先与过量对应肽段（100 mg肽段/1 mL稀释抗血清）孵育进行封闭。</li>
		<li>重复步骤1.1–1.12，使用其他组织作为阳性对照（如小鼠组织）。 
		注意：所有缓冲液均需在使用前新鲜配制。每一步操作中，需用移液器或滤纸小心吸除多余液体，但始终确保切片保持湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集与分析
	<ol>
		<li>使用配备数字相机的显微镜，在恒定光照条件下以相同放大倍数采集数字图像。</li>
		<li>使用图像分析软件（见材料表）对染色强度进行半定量分析。
		<ol>
			<li>打开以.lif或.tiff格式保存的图像，评估OX-A或OX2-R阳性指数。</li>
			<li>点击测量下的按钮，选择手动计数。通过鼠标点击阳性细胞并在屏幕上标记，直接计数染色细胞轮廓数量。</li>
			<li>选择一个感兴趣区域（ROI）（3 × 103 μm2），用于量化免疫信号密度（光密度，OD）。</li>
			<li>在分析图像内确定信号最强（强阳性）和最弱（阴性）的像素值，将无染色细胞区域的组织部分设为背景值（即零值）。</li>
			<li>在吸光度对数尺度上评估OD值。在数字图像分析中，DAB像素强度范围从最暗（0值）到最亮（255值）。</li>
			<li>通过绘制以下公式直方图确定OD值：log10(255/I)，其中“I”为程序给出的像素强度值，并已减去背景值。 
			注意：永久且稳定的免疫过氧化物酶反应可在任意时间使用明场显微镜进行分析。为避免相邻切片中同一细胞被重复计数，应在交替切片上进行标记细胞计数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫荧光实验方案
<ol>
	<li>组织解剖
	<ol>
		<li>按照第1.1节所述方法处死并解剖动物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织固定
	<ol>
		<li>将肠道和脑组织浸入4%多聚甲醛（PFA）中，在4 °C下固定3小时。
		<ol>
			<li>按第1.2.1节所述方法配制PB缓冲液和4% PFA。 
			注意：固定时间取决于组织大小。固定超过4–6小时可能导致过度固定，从而掩盖抗原表位，限制抗体与抗原的结合。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织包埋
	<ol>
		<li>用0.1 M PB缓冲液（pH 7.4）将组织漂洗3次，每次5分钟。</li>
		<li>进行冷冻保护：将组织转移至含20%蔗糖的PB缓冲液（0.1 M，pH 7.4）中，于4 °C下过夜。随后将组织转移至含30%蔗糖的0.1 M PB缓冲液（pH 7.4）中，再于4 °C下保存一个晚上。</li>
		<li>将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中。操作时准备一个盛有液氮的小杜瓦瓶，取铝箔剪成两半制成小皿。将含有组织并充满OCT包埋剂的小皿浸入液氮中，直至OCT完全冷却凝固。包埋后的组织可于-80 °C保存，待切片时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织切片
	<ol>
		<li>将冷冻组织块转移至-20 °C的恒冷切片机中，切成10 μm厚的冠状面或矢状面切片。</li>
		<li>将切片以交替连续的方式收集到适用于免疫组织化学的防脱玻片上，并于-20 °C保存备用。 
		注意：玻片应存放于-20 °C至4 °C之间，置于避光的玻片盒或玻片册中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭非特异性结合位点及组织通透化
	<ol>
		<li>使用耐溶剂笔在玻片上标记出组织区域。</li>
		<li>用0.1 M PB缓冲液（pH 7.4）将切片漂洗3次，每次5分钟。</li>
		<li>在室温下用含1%正常驴血清的通透缓冲液PB-Triton X-100 0.3%（PB-T）孵育切片30分钟，以实现细胞膜通透并封闭非特异性结合位点。
		<ol>
			<li>将0.3 mL Triton X-100溶于100 mL 0.1 M PB缓冲液（pH 7.4）中，配制0.3% Triton X-100溶液。</li>
			<li>将1%正常驴血清溶于含0.3% Triton X-100的PB缓冲液中，配制封闭液。 
			注意：通透和封闭缓冲液中所用血清的动物种属需与二抗的宿主相匹配。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗混合液孵育
	<ol>
		<li>用0.1 M PB缓冲液（pH 7.4）将切片漂洗3次，每次5分钟。
		<ol>
			<li>将切片置于湿盒中，在室温下与稀释于PB-T中的混合一抗溶液共同孵育过夜。可使用以下一抗组合：OX-2R山羊抗体（1:100稀释）与CB1R兔抗体（1:100稀释），或OX-A山羊抗体（1:100稀释）与CB1R兔抗体（1:100稀释）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗混合液孵育
	<ol>
		<li>用0.1 M PB缓冲液（pH 7.4）将切片漂洗3次，每次5分钟。</li>
		<li>在室温下孵育2小时，使用以下两种二抗混合液之一：1）驴抗兔Alexa Fluor 488标记二抗与驴抗山羊Alexa Fluor 594标记二抗，按1:100比例稀释于PB-T中；或2）驴抗山羊Alexa Fluor 488标记二抗与驴抗兔Alexa Fluor 594标记二抗，按1:100比例稀释于PB-T中。 
		注意：应使用同一动物宿主来源的二抗。正常血清必须与二抗同源（例如，若使用驴源二抗，则应使用驴正常血清）。将一抗和二抗用含去垢剂的封闭缓冲液稀释，以增强细胞通透性并降低背景信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织封片
	<ol>
		<li>用0.1 M PB缓冲液（pH 7.4）将切片漂洗3次，每次5分钟。</li>
		<li>用核染料DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）对切片进行复染：将1.5 µL DAPI（1 mg/mL）溶于3 mL PB缓冲液中配制染色液。</li>
		<li>使用封片介质覆盖盖玻片（参见材料表）。该水性封片介质可长期稳定组织样本及荧光染色。荧光样本应避光保存于4 °C。为延长荧光染料寿命，建议使用抗淬灭封片介质。 
		注意：应选择性能优良的封片介质。封片剂的重要参数之一是折射率（nD），应接近1.5（玻璃的折射率）。此处使用的封片介质特别适用于酶和脂质检测样本（即不能用梯度酒精脱水的样本）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照实验
	<ol>
		<li>重复步骤2.1–2.8，省略一抗或二抗，或在特定步骤中用PB缓冲液替代一抗或二抗血清（阴性对照）。</li>
		<li>重复步骤2.1–2.8，将每种一抗与过量对应的肽段（100 mg肽段/1 mL稀释抗血清）预先吸附处理。</li>
		<li>在小鼠脑切片上重复步骤2.1–2.8（阳性对照）。 
		注意：所有缓冲液应在使用前新鲜配制。每一步操作中均需小心用移液器或滤纸吸除切片周围的多余液体，但始终确保切片保持湿润。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集
	<ol>
		<li>使用配备x-y-z电动载物台、数字相机以及图像采集与分析软件（如NIS-Elements C）的共聚焦显微镜观察和分析免疫染色切片。使用5×、20×或40×物镜获取数字图像。</li>
		<li>以低倍镜（10×或20×物镜）在各可用通道中分别采集每张切片的图像，拼接成低倍全景图，以全面展示整个区域，便于定位和记录OX-2R/CB1R的解剖共表达情况。在分析前对荧光图像进行最大对比度归一化并叠加。</li>
		<li>对感兴趣区域连续采集Z轴堆栈图像。使用Z轴电动显微镜，分别对每个通道（红、绿、蓝）以1–1.8 µm的焦距步长采集六个焦平面（Z-step）的图像，以覆盖OX-2R/CB1R共表达呈现为黄色点状结构的组织体积。</li>
		<li>使用图像去卷积软件进行去卷积处理，设置十次迭代，将连续的Z轴图像合并为单张最大投影图像。</li>
		<li>使用Adobe Photoshop 6.01（Adobe Systems, San Jose, CA）调整显微图像的亮度和对比度。 
		注意：可在观察过程中执行去卷积步骤，以进一步降低背景信号。应尽量减少玻片暴露于光照的时间，防止荧光淬灭。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>对交替切取的10 μm厚切片（每组n = 5只动物）进行OX-2R/CB1R共表达的定量分析，覆盖每只动物的全部感兴趣区域。</li>
		<li>采用半自动图像分析系统，将OX-2R/CB1R共表达量化为黄色阳性点状结构的数量。Imagins软件可提供更高细节水平，并输出不同荧光探针重叠区域的定量数据。</li>
		<li>使用双通道信号强度的阈值工具进行点状结构计数。打开.liff、.tiff或.jpg图像文件，选择图像–阈值，选择自动设置或手动方法，调节阈值直至所有染色点状结构均被选中。分析图像中不含任何免疫标记物区域的像素强度分布，以确定背景阈值。每个图像应单独确定其背景阈值。程序随后将像素强度基线设定为背景值，从而去除背景信号。</li>
		<li>选择分析–测量，设定需测量的参数（点状结构强度的最小值、最大值和平均值；免疫标记点状结构的数量/密度）。</li>
		<li>在每张切片的4个Z轴堆栈中沿组织体积计数黄色点状结构，使用最佳焦平面之上或之下的堆栈图像。排除失焦区域的数据。 
		注意：应在交替切片上进行标记细胞计数，以避免相邻切片中同一细胞被重复计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

样品制备
样本制备是免疫组织化学（IHC）中的第一个关键步骤。可靠的实验方案有助于维持细胞形态、组织结构以及抗原性。该步骤需要正确进行组织采集、固定、和切片22，23。固定的目的在于保存组织，并减少组织酶或微生物的作用。特别是，固定步骤可保存细胞组分和生物大分子，防止自溶以及细胞成分（如抗原和酶）的移位，稳定细胞物质以抵抗后续操作的不利影响，并有助于免疫染色4，7，24。
在切片前，组织需经过制备和保存处理，可通过石蜡包埋（免疫过氧化物酶法）或冷冻保存（在冷冻介质中冷冻，用于多种免疫荧光方法）。保存方法与固定类型相关7。固定和保存后...

免疫组织化学（IHC）是一种成熟的经典技术，通过抗原-抗体相互作用来识别细胞或组织中的成分（抗原）1,2。该技术可用于确定目标生物分子在组织内的定位与分布。IHC利用免疫反应和化学反应来检测组织切片中的抗原3。用于可视化抗原-抗体反应的主要标记物包括荧光染料（免疫荧光）和酶-底物显色反应（免疫过氧化物酶），二者均与抗体偶联4。通过显微镜观察，可确定标记组织的定位，该定位大致对应于目标抗原在组织中的实际位置。
检测蛋白质的荧光或显色反应有两种方法：直接检测法和间接检测法。直接检测法使用直接标记的特异性一抗；间接检测法中的一抗未偶联标记物，而由二抗携带标记物5,6,7。间接检测法具有若干优势，主要是信号放大效应。此外，与其他分子和细胞技术不同，免疫荧光技术能够可视化细胞和组织内差异表达的两种或多种蛋白质的分布、定位及共表达情况7。检测方法的选择取决于具体的实验条件。
迄今为止，免疫组织化学（IHC）作为基础研究中一种强大且必不可少的工具，被广泛用于研究从人类到无脊椎动物等生物组织中生物标志物的分布与定位，以及不同蛋白质的总体表达谱8,9,10,11。该技术有助于展示大量正常与病变动物器官及不同类型组织中的蛋白质表达图谱，揭示生理或病理变化所诱导的表达上调或下调的可能性。IHC 是一种高度敏感的技术，需要精确操作并正确选择方法，以获得最佳结果12。首先，多种因素如固定方式、交叉反应性、抗原修复以及抗体的敏感性等，均可能导致假阳性或假阴性信号13。抗体的选择是 IHC 中最关键的步骤之一，其选择取决于抗原的特异性及其对目标蛋白和实验物种的亲和力7。
近期，我们优化了免疫组织化学技术，用于检测成年斑马鱼组织中食欲素/下丘脑分泌素（orexin/hypocretin）系统和内源性大麻素系统（endocannabinoid system）的成员。我们主要针对固定、采用两种不同方法的组织包埋、切片与贴片（这些步骤可能影响显微镜分析时的分辨率和细节呈现），以及封闭（以防止假阳性并降低背景信号）等环节进行了优化。14其他重要特性包括抗体的特异性与选择性，以及各个免疫组化（IHC）方案的可重复性。确保抗体特异性的关键在于使用阴性对照（包括不加一抗或已知不表达目标蛋白的组织）以及阳性对照（包括已知表达目标蛋白的组织）。15选择用于免疫组化（IHC）的抗体时，需依据其物种特异性（即与目标抗原发生反应的可能性）以及所采用的抗原-抗体结合检测系统。4,5,6,7对于免疫过氧化物酶染色，反应产物的颜色由所选用的沉淀型显色底物决定，通常为二氨基联苯胺（呈棕色）16另一方面， i免疫荧光利用与荧光染料偶联的抗体来检测冰冻组织切片中的蛋白质表达，相较于显色检测系统，可更便捷地实现多种蛋白质的分析。5,7.
在免疫过氧化物酶技术中，二抗与生物素（一种能够招募显色报告分子的连接分子）结合，形成[亲和素-生物素复合物（ABC）]，从而放大染色信号。在ABC报告系统中，过氧化物酶与3,3’-二氨基联苯胺（DAB）反应，在酶与二抗结合的部位产生深棕色沉淀，该结果可通过普通光学显微镜进行观察分析。由于亲和素对生物素具有高亲和力，ABC染色法反应迅速且效果理想，仅需少量二抗即可在初级抗体反应位点实现高效检测。这种显色检测方法可对信号进行光密度分析，根据棕色信号强度与蛋白质表达水平之间的相关性，提供半定量数据18。
利用免疫荧光技术，由于不同的荧光染料能够在特定波长发射光信号，因此可实现多种蛋白质的同步检测，但需谨慎选择荧光染料以尽量减少光谱重叠5。此外，使用来自不同宿主物种的一抗可最大限度地避免交叉反应带来的问题。在此情况下，每种特异性识别宿主物种的二抗仅识别一种类型的一抗。荧光报告分子是一类小分子有机化合物，包括商品化衍生物，例如Alexa Fluor染料。
许多动物模型被用于研究特定的生理和病理状态。迄今为止，已明确许多代谢通路在进化过程中是保守的。因此，在斑马鱼等模式生物中开展免疫组织化学（IHC）研究，有助于深入了解病理性和非病理性状态的发生机制及其维持过程17。本报告旨在介绍可在成年斑马鱼组织上实施的IHC实验方案，并用于获取外周和中枢水平OXA、OX-2R及CB1R分布与定位的详细图像。同时，本文还报道了两种主要的间接IHC方法在成年斑马鱼外周和中枢组织中的应用方案。文中描述了间接法，该方法可在二抗偶联荧光染料（免疫荧光法）或酶标记物（免疫过氧化物酶法）时实现信号放大。显色检测和荧光检测方法各有优缺点。本方案重点报道了免疫组织化学技术，主要是免疫荧光法，在成年斑马鱼这一广泛用于研究多种生理和病理条件下进化保守系统的动物模型中的应用。

<table><tbody><tr><td>抗CB1抗体</td><td>Abcam</td><td>ab23703</td><td></td></tr><tr><td>抗OX-2R抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8074</td><td></td></tr><tr><td>抗OXA抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc8070</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex</td><td>Merck</td><td>1,085,620,050</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的兔抗山羊二抗</td><td>Vector Lab</td><td>BA-5000</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Biosystem</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Leica Biosystem</td><td>DFC320</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜用数码相机</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊Alexa Fluor 488标记二抗</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊Alexa Fluor 594标记二抗</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔Alexa Fluor 488标记二抗</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔Alexa Fluor 594标记二抗</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR</td><td>20,821,330</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片包埋剂</td><td>Leica Biosystem</td><td>FSC 22 Frozen Section Media</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20,252,290</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>Vector lab</td><td>SK4105</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica Biosystem</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica Biosystem</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4·H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>正常兔血清</td><td>Vector lab</td><td>S-5000</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Carlo Erba</td><td>46793801</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Analytical</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>VectaStain Elite ABC试剂盒</td><td>Vector lab</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>纯二甲苯</td><td>Carlo Erba</td><td>392603</td><td></td></tr></tbody></table>

利用免疫过氧化物酶法和免疫荧光法鉴定成年斑马鱼中的食欲素和内源性大麻素受体

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

免疫组织化学（IHC）是一种高灵敏度和高特异性的技术，用于通过标记抗体检测组织切片中的靶抗原。该技术包含多个步骤，每个步骤的优化对于获得最佳特异性信号至关重要。通过IHC可检测特定生物标志物的分布与定位，从而揭示其在进化过程中的保守性信息。此外，IHC有助于理解生物标志物在病理状态（如肥胖）下的表达与分布变化。IHC，尤其是免疫荧光技术，可用于成年斑马鱼，以研究系统发育上保守分子的结构与分布，但目前尚无标准化的IHC操作流程。食欲素（orexin）和内源性大麻素系统是两个在摄食调控及肥胖病理过程中高度保守的系统。本文报告了用于研究正常及饮食诱导肥胖（DIO）成年斑马鱼模型肠道与脑组织中食欲素肽（OXA）、食欲素受体（OX-2R）和大麻素受体（CB1R）定位与分布的实验方案。同时描述了免疫过氧化物酶法、双重免疫荧光法，以及试剂配制、组织固定、石蜡包埋、冷冻保护处理，还包括内源性活性阻断步骤和背景复染的前处理方法。所有参数均基于前期IHC实验获得，这些实验已证实免疫荧光技术有助于理解OXA、OX-2R和CB1R在成年斑马鱼组织中的分布、定位及其表达的保守性。最终获得的图像具有高度特异性的信号强度，证实斑马鱼是适用于在生理与病理条件下开展特定生物标志物分布、定位及进化保守性免疫组织化学研究的合适动物模型。本文所列方案推荐用于成年斑马鱼的免疫组织化学实验。

免疫过氧化物酶染色的代表性数据见图1和图2。对成年斑马鱼肠道中OX-A和OX-2R分布的免疫组织化学分析显示，OX-A与OX-2R在肠道中的定位部位不同，且在饮食诱导肥胖（DIO）斑马鱼的肠细胞中表达水平升高。OX-A在中肠和前肠细胞中呈现强烈的棕褐色染色（图1A，A1）。OX-A的免疫反应信号在肠道不同区段中清晰可见，从前肠向中肠方向逐渐减弱（图1B，B1）。阴性对照用于背景参考，并确认OX-A信号的特异性（图1E）。延长显色剂DAB的孵育时间导致背景强度增加（图1D）。在DIO组和对照饮食组斑马鱼肠道中OX-2R的免疫反应也观察到类似结果（图2）。在DIO成年斑马鱼中OX-A信...

本文介绍了利用免疫过氧化物酶法和双重免疫荧光法，在正常及饮食诱导肥胖（DIO）成年斑马鱼模型的肠道和脑组织中，对食欲素肽、食欲素受体以及内源性大麻素受体进行免疫组织化学表征与定位的实验方案。

免疫组织化学（IHC）是一种高灵敏度和高特异性的技术，用于检测组织切片中带有标记的靶抗原……

目前，免疫组织化学技术被越来越频繁地用于鉴定特定分子标志物的存在及其在病理情况下的变化，从而为进行定量分析提供了可能。免疫组织化学，尤其是免疫荧光技术，已被应用于斑马鱼的幼体和成体动物模型，但关于适用于斑马鱼的优良标准免疫组织化学实验方案，目前所知仍较少。本文中，我们描述并图示了一种可用于研究成年斑马鱼中重要蛋白质进化保守性的实验方案。一种适用于成年斑马鱼的免疫组织化学良好方案，有助于揭示该动物模型在研究高度保守生物分子形态表达与分布方面的应用价值。该方法还可用于分析这些生物分子在与人类生理病理相关病理条件下可能发生的改变。本实验操作将由本实验室的博士研究生Lea Tunisi博士演示。开始此操作时，将制备好的冷冻组织块转移至-20 °C的冷冻切片机中。将组织块切成10 µm厚的冠状面或矢状面切片。然后，将组织切片以交替连续的方式收集到适用于免疫组织化学的粘附性玻片上，并在-20 °C保存，直至准备进行后续操作。首先，使用耐溶剂笔在载玻片上标记组织区域。用 0.1 摩尔磷酸缓冲液冲洗切片，每次 5 分钟，共冲洗三次。接着，将 0.3 毫升 Triton X-100 溶解于 100 毫升 0.1 摩尔磷酸缓冲液中，配制 0.3% Triton X-100 溶液。将 0.1% 正常驴血清溶解于含 0.3% Triton X-100 的磷酸缓冲液中，以配制封闭液。将切片与溶于含0.3% Triton X-100的通透缓冲液中的正常驴血清溶液在室温下孵育30分钟，以通透细胞膜并阻断非特异性结合位点。首先，用0.1摩尔磷酸缓冲液冲洗切片，每次5分钟，共冲洗三次。加入用PB-T稀释的一抗混合液，将切片置于湿盒中，在室温下孵育过夜。第二天，用 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液将切片冲洗三次，每次五分钟。将切片在室温下置于适当稀释于 PB-T 中的二抗混合液中孵育两小时。首先，用 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液将切片冲洗三次，每次五分钟。将1.5微升DAPI溶解于3毫升磷酸盐缓冲液中，以配制核染料DAPI。用该染料对切片进行复染。随后，使用封片剂对载玻片进行封片，以稳定组织和染色，便于长期保存和使用。荧光样品可在黑暗条件下于 4 摄氏度保存。重复免疫荧光实验步骤，省略一抗或二抗，或将一抗或二抗替换为磷酸盐缓冲液，以制备阴性对照。接着，重复免疫荧光实验步骤，将每种一抗与过量的相应肽段预先孵育以进行封闭。在小鼠脑切片上重复免疫荧光实验步骤，以制备阳性对照。使用配备X-Y-Z电动载物台、数码相机以及图像采集与分析软件的共聚焦显微镜，观察并分析免疫染色切片。采用5x、20x和40x物镜采集数字图像。在每种可用的通道中，以低倍镜拍摄每个切片的图像，以生成低倍镜下的拼接图。将荧光图像归一化至最大对比度并进行叠加。在目标区域内，通过六个焦平面连续采集Z轴图像堆栈，焦步距为1至1.8微米。每个通道需分别进行此采集。随后，使用成像去卷积软件，通过应用10次迭代对图像进行去卷积，并将连续的Z平面图像合并为单个最大投影图像。使用合适的图像编辑软件调整显微照片的亮度和对比度。对成年斑马鱼肠道中OX-A和OX-2R分布的免疫组织化学分析显示，OX-A与OX-2R在肠道中具有不同的定位区域，并且在DIO斑马鱼肠细胞中的表达水平升高。OX-A在中肠和前肠细胞中呈现强烈的棕褐色染色。OX-A的免疫反应信号在肠道不同区段中清晰可见，从前肠向中肠方向表达信号逐渐减弱。在DIO和对照饮食的斑马鱼肠道中，OX-2R免疫荧光表达结果相似。DIO成年斑马鱼中OX-A信号增强，同时伴随其他肠段中OX-2R的过表达。对免疫荧光图像的精确分析显示，与对照饮食斑马鱼相比，DIO成年斑马鱼肠道中OX-2R/CB1R的共定位增加。在不同的脑区也观察到类似的情况，例如端脑背侧、下丘脑、视顶盖、外侧丘和小叶弥散核。通过使用orexin-A和CB1R的双重免疫荧光染色观察到，下丘脑中orexin能神经元的共定位增加，同时伴有orexin-A荧光信号的增强。这些结果表明，双重免疫荧光技术有助于识别生理条件下保守的蛋白质表达、靶蛋白的共定位，以及它们在不同病理状态下的分布和/或表达变化。通过免疫荧光技术，我们可以更深入地了解生物分子的共分布与共表达情况、它们之间可能存在的相互作用，并能够直观观察这些分子在不同病理状态下的变化。此外，代谢酶或受体在神经解剖学上的分布特征，有助于进一步揭示蛋白质信号在组织中的作用机制。本技术研究采用成年斑马鱼模型，介绍了利用免疫荧光方法研究两种高度保守系统——食欲素系统和内源性大麻素系统——的技术流程。本研究首次采用此处所述的方案，在成年斑马鱼脑内研究食欲素-2受体与内源性大麻素-CB1受体的解剖分布及其共表达情况，目前尚未明确。我们推荐将此处描述的方案用于免疫组织化学实验，以检测成年斑马鱼脑内肽类受体的空间分布与组织结构，从而更深入地理解其功能。

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生物化学

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