利用斑马鱼胚胎对化合物毒性的快速评价

毒试程序将由我实验室的高级研究员阿肖克·阿斯帕瓦尔博士进行论证。我们的协议识别目标外效应，并检测在发现的早期阶段，在细胞培养或其他动物模型中可能遗漏的化学品的微妙毒性效应。我们技术的主要优点是:快速高效，需要量很少的化学，以及实验室的基本设施。

毒性筛查将有助于我们确定其对导致结核病的分枝杆菌效率的浓度，以及进一步临床前计算。这种方法利用对化学品的离目标效应的洞察，因此，这种方法可用于任何研究领域，其中化学品的毒性是最重要的。这种方法非常简单，任何人都可以进行，没有经验。

没有经验的人应该仔细计划实验，只使用一种化合物。这种方法提供化学物质的毒性作用，其形式是发展中的斑马鱼胚胎的表型变化，因此对被测试的化合物的安全性。首先，将两到五只成年雄性斑马鱼和三到五只成年雌性斑马鱼放入交配池过夜。

早晨，打开光线，因为繁殖是由自动黑暗和随后的光循环诱导的。为了避免处理对动物的压力，让动物休息两个星期，然后再使用相同的个体进行繁殖。第二天中午前，使用细网过滤器收集胚胎，并把它们转移到含有E3胚胎培养的培养皿上。

将培养皿放在立体显微镜下，检查每批胚胎。识别不透明的外观，并将其移除为未受精或死亡的胚胎。将胚胎在28.5摄氏度的孵化器中过夜。

第二天早上，在立体显微镜下检查胚胎，取出任何不健康或死亡的胚胎。小心地使用巴氏移液器将一个胚胎移植到24井板的每个井中。确保每个井包含足够的E3介质，以覆盖胚胎。

拿出储存在冰箱4摄氏度的含有抑制剂化合物的小瓶。使用分析平衡来称量适当量的化合物，并为 E3 介质或其他适当溶剂中的每种化合物准备 250 微升 100 毫摩尔库存溶液。然后，使用E3介质根据15毫升离心管的毒性水平对库存溶液进行连续稀释。

从每个包含一个 DPF 胚胎的井中，使用巴氏移液器和 1 毫升移液器一次去除 E3 水。立即将库存溶液中每个稀释剂的 1 毫升分配到 24 孔板的孔中，从较低位置开始，向更高浓度移动。对于控制组，加入 E3 水或其他相关溶剂。

用化合物的名称和浓度标记 24 个井板，并在培养箱中将板在 28.5 摄氏度。注意通过密封24个井板的两侧，在培养箱中不会蒸发油井中化学物质的稀释剂。在接触化合物24小时后，使用巴氏移液器将暴露在含有3%高分子量甲基纤维素的小培养皿中的每一浓度化合物中的幼虫转移。

用金属探头，侧身铺。将培养皿放在连接到相机的立体显微镜下。拍摄图像，每天将图像保存在单独的文件夹中，直到实验结束。

每天在联机表或打印的纸张上输入表中的所有观测值。对于神经毒性化合物暴露，四到五个DPF幼虫可能表现出异常的游泳模式。在这种情况下，通过捕获短短的 30 秒到 1 分钟幼虫视频来记录这些变化。

在接触化合物五天后，注意一半的胚胎死亡浓度，因为每种化学物质中的致命浓度为50。使用合适的程序，为所有浓度的胚胎死亡率构建一个曲线。在该协议中，毒性评估的关键部分是在一个实验中测试一种或多种化合物的不同浓度。

对于在幼虫中诱发任何表型缺陷的化合物，在接触该化学品后一至五天内每24小时记录一次缺陷。与控制相比，用βCA抑制剂处理的胚胎浓度为250微摩尔和125微摩尔，存在各种表型缺陷。例如，即使在第3天，未包扎的胚胎，弯曲的身体结构，未使用的蛋黄囊和心上水肿，并在治疗后五天内在幼虫中缺乏卵石囊。

在另一项研究中，用CA抑制剂治疗的胚胎显示没有卵石囊和游泳膀胱。实验确定了一种具有代表性的复合碳氢化物9，在500微摩尔的胚胎发育过程中，它诱导了最小或无表型变化。该化合物表现出高LC50浓度。

然而，在与对照组的比较中，发现300微摩尔的同一化合物在接触五天后在幼虫中具有神经毒性和诱发性厌食症。良好的胚胎质量对于化学品的毒性筛选非常重要。为了获得优质的胚胎，使用幼鸽成年斑马鱼进行繁殖。

通过进行相关的体外和体内实验，可以进一步描述安全产生的化合物。在抗管杆菌药物开发领域，该技术有助于在体内对斑马鱼胚胎中分枝杆菌的抑制进行进一步的实验。该协议涉及使用可能对人类有毒的化学品。

参与实验的人在处理化学品时应小心。