Name: 利用斑马鱼胚胎对化合物毒性的快速评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 了解利用斑马鱼胚胎进行化合物毒性快速评价的方法。该技术可检测早期药物发现中的脱靶效应和细微毒性变化，为抗结核分枝杆菌等病原体的研究提供浓度筛选依据，适用于毒理学和药理学研究。

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本工作得到了Sigrid Juselius基金会（SP、MP）、芬兰文化基金会（AA、MH）、芬兰科学院（SP、MP）、Orion Farmos基金会（MH）、坦佩雷结核病基金会（SP、MH和MP）以及Jane和Aatos Erkko基金会（SP和MP）的资助。我们感谢意大利和法国的合作者Supuran教授和Winum教授，提供了用于抗结核和抗癌药物开发中安全性与毒性评价的碳酸酐酶抑制剂。我们感谢Aulikki Lehmus和Marianne Kuuslahti提供的技术协助。同时感谢Leena Mäkinen和Hannaleena Piippo在斑马鱼繁殖及胚胎收集方面给予的帮助。我们诚挚感谢Harlan Barker对稿件进行的审阅以及提出的宝贵意见。

坦佩雷大学的斑马鱼核心设施已获得国家动物实验委员会（ESAVI/7975/04.10.05/2016）颁发的设立许可。所有使用斑马鱼胚胎的实验均依照芬兰东部省行政机构、坦佩雷地区服务单位社会与卫生部门的协议编号 LSLH-2007-7254/Ym-23 进行。
1. 夜间斑马鱼交配箱的设置
<ol>
	<li>将2-5条成年雄性斑马鱼和3-5条成年雌性斑马鱼放入交配缸中过夜。（通过夜间自动的明暗循环在次日清晨诱导产卵）。</li>
	<li>设置多个交配组合，以获得足够的胚胎用于评估两种以上化合物的毒性。在进行毒性评估时，每个浓度至少需要20个胚胎23。</li>
	<li>为避免对动物造成操作应激，同一批个体在再次用于繁殖前应静养2周。</li>
</ol>
2. 胚胎收集及化学化合物暴露用培养板的制备
<ol>
	<li>使用细网筛在次日中午前收集胚胎，并将其转移至含有 E3 胚胎培养基 [5.0 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4 和 0.1% w/v 亚甲蓝] 的培养皿中。</li>
	<li>使用塑料巴斯德吸管去除杂质（例如食物残渣和固体废物）。在体视显微镜下检查每批胚胎，剔除未受精或已死亡的胚胎（表现为不透明外观）。</li>
	<li>将胚胎置于 28.5 °C 的培养箱中培养。次日上午在体视显微镜下检查胚胎，移除任何不健康或已死亡的胚胎，并更换为新鲜的 E3 培养基。 
	注意：&#160;斑马鱼胚胎在实验室条件下始终维持在 28.5 °C。&#160;</li>
	<li>将 1 个胚胎小心转移至含有足量 E3 培养基（以完全覆盖胚胎）的 24 孔板的每个孔中。</li>
</ol>
3. 化合物母液的配制及稀释后化合物的加样至孔板
<ol>
	<li>取出存放在 4 °C 的含有抑制剂化合物的小瓶。 
	注意：根据化合物的性质，储存温度可能有所不同。</li>
	<li>使用可精确称量数毫克（mg）化合物的分析天平称取化合物。</li>
	<li>根据化合物的溶解性，用适当的溶剂（例如 E3 水或二甲基亚砜（DMSO））为每种化合物配制至少 250 μL 的 100 mM 储存液。 
	注意：上述步骤可在实验开始前一天的合适时间完成，并于 4 °C 保存。</li>
	<li>使用 E3 水在 15 mL 离心管中对储存液进行系列稀释（例如 10 μM、20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、300 μM 和 500 μM）。 
	注意：系列稀释的浓度和稀释点数因化合物的毒性水平不同而异。</li>
	<li>从含有胚胎的 24 孔板中，使用巴斯德移液管和 1 mL 移液器，逐行吸出孔中的 E3 水（每孔含 1 dpf 胚胎）。</li>
	<li>将每种稀释液各 1 mL（从低浓度到高浓度依次进行）加入 24 孔板的各个孔中。</li>
	<li>从同一批胚胎中设置对照组，并加入相应体积的稀释液。</li>
	<li>用化合物名称和浓度标记 24 孔板，并将板置于 28.5 °C 恒温培养箱中孵育。</li>
</ol>
4. 使用体视显微镜对胚胎进行表型分析与成像
<ol>
	<li>在化学化合物暴露后24小时，于体视显微镜下观察胚胎的各项参数。
	<ol>
		<li>记录各项参数，如死亡率、孵化情况、心跳、卵黄囊利用情况、 swim bladder（鳔）发育、鱼体运动、心包水肿以及体形变化23。</li>
		<li>将暴露于各浓度化合物的幼鱼用金属探针转移至含有3%高分子量甲基纤维素的小培养皿中，侧向放置。 
		注意：3%甲基纤维素（高分子量）为一种黏稠液体，用于固定鱼体方向以便显微观察。在该液体中调整鱼体方位时需使用金属探针。</li>
		<li>使用连接相机的体视显微镜拍摄图像。自实验开始至结束，每日将图像保存于独立文件夹中。</li>
		<li>每日将所有观察结果记录于在线表格或纸质表格中。</li>
		<li>若化合物具有神经毒性，4至5天后幼鱼可能出现游泳模式异常，应通过拍摄表现出异常运动模式的幼鱼短片段视频（30秒至1分钟）记录此类变化。</li>
		<li>在化学化合物暴露5天后，记录导致一半胚胎死亡的浓度，用于计算每种化学物的半数最大致死浓度（LC50）。 
		注意：LC50是指在5天暴露期结束时导致50%胚胎死亡的化学物浓度。每种化合物各浓度毒性测试至少使用20个胚胎23。</li>
		<li>使用合适的软件绘制所有浓度下胚胎死亡率的剂量-反应曲线。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无潜在利益冲突。

体外 毒性试验利用培养细胞检测细胞存活率和形态学变化，可提供有关受试化合物诱导毒性的有限信息。利用斑马鱼胚胎进行化合物毒性筛选的优势在于，可在相关模式生物的胚胎发育过程中，快速检测化学物质诱导的表型改变。大约70%的人类蛋白质编码基因在斑马鱼基因组中具有直系同源基因25。调控信号转导和发育的遗传通路在人类与斑马鱼之间高度保守26，因此化学化合物在人体中很可能产生类似的毒性效应25。
斑马鱼处于毒理学研究的前沿，已被广泛用于检测水样中的毒素，并研究环境毒素的作用机制及其对动物的影响27。本文展示了利用发育中的斑马鱼胚胎在药物发现早期阶段评估潜在化合物毒性的方法。我们所采用的快速、多维度毒性评估体系基于以下两个方面：1）在5天的胚胎发育过程中，观察生物体表型的变化（包括孵化情况、耳石囊、心包水肿、卵黄囊利用、脊索发育、心跳、 swim bladder 发育及运动行为）；2）测定半...

药物研发是一个耗资巨大的过程。在单个化合物获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准之前，需筛选数千个化合物，成本超过10亿美元1。在临床前研发阶段，大部分成本用于动物实验2。为了控制成本，药物研发领域的研究人员需要替代模型来对化学化合物进行安全性筛选3。因此，在药物研发的早期阶段，若能采用一种可在合适模型中快速评估化合物安全性和毒性的方法，将极具优势。目前已有多种用于化学化合物毒性筛选的方案，涉及动物模型和细胞培养模型，但尚无一种经过验证且被广泛采用的统一方案4,5。现有的斑马鱼毒性检测方案在时长上各不相同，且多由个别研究人员根据自身实验需求自行设定毒性评估标准6,7,8,9,10,11,12。
近年来，斑马鱼已成为评估化学化合物在胚胎发育期间毒性的便捷模型6,7斑马鱼在评估化学化合物方面具有多种内在优势13即使是大规模实验也可行，因为一条雌性斑马鱼可产下200-300枚卵的卵团，且胚胎发育迅速。 ex&#160;体内，无需外部喂食，可维持长达一周，且身体透明。化合物可直接加入水中，根据化合物性质的不同，可透过卵的绒毛膜进入胚胎，孵化后则通过幼鱼的皮肤、鳃和口部吸收。实验无需大量化学化合物14 由于胚胎体积较小。发育中的斑马鱼胚胎表达了实现正常发育过程所需的大部分蛋白质。因此，斑马鱼胚胎是评估潜在药物是否干扰具有发育重要性的蛋白质或信号分子功能的敏感模型。斑马鱼的器官在受精后2-5天逐渐具备功能。15，在胚胎发育这一敏感时期具有毒性的化合物会诱导斑马鱼幼鱼出现表型缺陷。这些表型变化可通过简单显微镜观察即可检测，无需侵入性技术11斑马鱼胚胎由于相较于其他模型具有更高的生物学复杂性，被广泛应用于毒理学研究中 体外 利用细胞培养模型进行药物筛选16,17. &#160;作为一种脊椎动物，斑马鱼的遗传和生理构成与人类相似，因此化学化合物在斑马鱼与人类之间的毒性表现也相似8,18,19,20,21,22因此，斑马鱼在药物发现早期阶段评估化合物毒性和安全性方面是一种有价值的工具。
本文详细描述了一名研究人员使用受精后1-5天（dpf）的斑马鱼胚胎评估碳酸酐酶（CA）抑制剂化合物安全性和毒性的方法。该方案包括将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的化学抑制剂化合物中，并观察胚胎发育过程中的死亡率和表型变化。在化学化合物暴露结束后，确定该化合物的LC50剂量。该方法可由单人高效完成1-5种测试化合物的筛选，耗时约8-10小时，具体时间取决于操作者对该方法的熟练程度（图1）。评估化合物毒性的各个步骤如图2所示。评估CA抑制剂的毒性共需8天，包括：设置交配对（第1天）；从繁殖缸中收集胚胎，并进行清洗后转移至28.5 °C培养箱中（第2天）；将胚胎分配至24孔板的各孔中，并加入稀释后的CA抑制剂化合物（第3天）；对幼鱼进行表型分析和成像（第4-8天）；以及确定LC50剂量（第8天）。&#160;该方法快速高效，所需化学化合物用量少，且仅需实验室基本设备。

<table><tbody><tr><td>24孔板</td><td>Nunc</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td></tr><tr><td>天平（秤）</td><td>KERN</td><td>PLJ3000-2CM</td><td></td></tr><tr><td>天平（电子秤）</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB104-S/PH</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>JT.Baker</td><td>RS421910024</td><td></td></tr><tr><td>解剖探针</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17-467-604&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich，德国</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon管</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>高分子量甲基纤维素</td><td>Sigma Aldrich，德国</td><td>M0262&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>斑马鱼幼虫培养箱</td><td>特玛克斯</td><td>B8000</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>默克</td><td>1.04936.0500</td><td></td></tr><tr><td>甲基蓝</td><td>Sigma Aldrich，德国</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich，德国</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Starlab</td><td>S1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>石蜡组织包埋剂 IM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>8331</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>101R20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>移液器（1 mL 和 200 &amp;mu;L</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4641230N, 4641210N&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜/相机</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>11569914</td><td></td></tr><tr><td>斑马鱼AB品系</td><td>ZIRC&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp; ZL1&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

利用斑马鱼胚胎快速评估化学化合物的毒性

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

斑马鱼是一种广泛用于基于疾病和表型的药物发现的脊椎动物模式生物。斑马鱼繁殖力强，胚胎透明且体外发育迅速。因此，斑马鱼胚胎也可用于对珍贵且仅能获得微量的药物进行快速毒性评估。本文介绍了一种利用受精后1至5天的胚胎高效筛选化学化合物毒性的方法。通过体视显微镜观察胚胎，以研究不同浓度化合物暴露所引起的表型缺陷，并测定化合物的半数致死浓度（LC50）。本研究仅需3–6 mg的抑制剂化合物，整个实验由一名研究人员在具备基本设施的实验室中约8–10小时内即可完成。该方案适用于在药物发现早期阶段检测任何化合物是否存在不可耐受的毒性或脱靶效应，并可发现可能在细胞培养或其他动物模型中被忽略的细微毒性作用。该方法可减少药物研发过程中的程序延迟和成本。

评估毒性的关键部分是在单次实验中测试一种或多种化合物的不同浓度。首先，选择待评估毒性的化合物、每种化合物需测试的浓度数量，并据此制作图表图3）。我们为每种化合物使用了不同的颜色来对样品进行分类（图3）。使用耐溶剂的标记笔在培养板的底部或侧边进行标记非常重要，可避免后续样品混淆。如果化合物在不同浓度抑制剂处理下诱导幼鱼出现任何表型缺陷，应在1至5 dpf期间每24小时记录一次缺陷情况。图4AB，C，D）。在已知 CA IX 抑制剂浓度处理下的胚胎 500 μM 在暴露于该化合物的1-5天内未表现出任何明显的表型变化图4B). 图 4C 和 图 4D 显示经β-CA抑制剂处理后出现多种表型...

斑马鱼胚胎可用于评估化学化合物的毒性。其胚胎体外发育，对化学物质敏感，能够检测出细微的表型变化。该实验仅需少量化合物，可直接加入含有胚胎的培养板中，使检测系统高效且经济。

斑马鱼是一种广泛用于基于疾病和表型的药物发现研究的脊椎动物模式生物。斑马鱼繁殖力强，可产生大量后代，具有……

毒性测试流程将由我实验室的高级研究员 Ashok Aspatwar 博士进行演示。我们的方案能够在药物发现的早期阶段识别脱靶效应，并检测化学物质的细微毒性作用，而这些作用可能在细胞培养或其他动物模型中被遗漏。本技术的主要优势在于：快速高效，所需化学品用量极少，且仅需实验室的基本设施。毒性筛选将有助于我们确定该物质抗结核分枝杆菌的有效研究浓度，并为后续的临床前计算提供依据。该方法利用了对化学物质脱靶效应的深入理解，因此可应用于任何将化学物质毒性作为首要考量的研究领域。此方法非常简单，无需 prior 经验即可由任何人操作。无经验的人员应仔细规划实验，并仅使用一种化合物。该方法通过观察斑马鱼胚胎发育过程中的表型变化，提供所测试化学物质的毒性效应，从而评估其安全性。实验开始时，将2至5条成年雄性斑马鱼和3至5条成年雌性斑马鱼放入交配缸中过夜。早晨开启光源，因为繁殖由自动的黑暗和随后的光照周期诱导。为避免对动物造成操作应激，同一批个体在用于繁殖前需静置休息两周。次日中午之前，使用细网筛收集胚胎，并将其转移至含有 E3 胚胎培养基的培养皿中。将培养皿置于体视显微镜下，检查每批胚胎。辨识出不透明的胚胎，并将其移除，这些为未受精或已死亡的胚胎。将胚胎置于28.5°C的培养箱中过夜培养。第二天早上，在体视显微镜下观察胚胎，并移除任何不健康或已死亡的胚胎。使用巴斯德吸管小心地将一个胚胎转移至24孔板的每个孔中。确保每个孔中含有足够的E3培养基以浸没胚胎。从冰箱中取出存放在4摄氏度的抑制剂化合物小瓶。使用分析天平称取适量化合物，并在E3培养基或其它合适的溶剂中为每种化合物配制250微升的100毫摩尔/升储备液。然后，根据化合物在15毫升离心管中的毒性水平，用E3培养基对储备液进行系列稀释。从每个含有一个受精后天数（DPF）胚胎的孔中，使用巴斯德吸管和1毫升移液器逐行移除E3水。立即将每种储备溶液的稀释液各1毫升，从低浓度到高浓度依次加入24孔板的各孔中。对于对照组，加入E3水或其它相应的溶剂。用化合物名称及其浓度标记24孔板，并将培养板置于28.5摄氏度的培养箱中。注意通过密封24孔板边缘防止孔内化学试剂的稀释液在培养箱中蒸发。暴露于化学化合物24小时后，使用巴斯德吸管将暴露于各浓度化合物的幼虫转移至含有3%高分子量甲基纤维素的小型培养皿中。使用金属探针，将其侧向放置。将培养皿置于连接相机的体视显微镜下。拍摄图像，并在实验结束前每天将图像保存至单独的文件夹中。每天将所有观察结果记录在表格中，可以使用在线表格或打印的纸质表格。对于神经毒性化合物暴露实验，四至五天的斑马鱼幼鱼可能会出现异常的游动模式。若出现此情况，应通过拍摄一段30秒至1分钟的幼鱼视频来记录这些变化。经过五天的化学物质暴露后，记录每种化学物质的半数致死浓度（LC50），即半数胚胎死亡时的浓度。使用合适的程序，针对所有浓度绘制胚胎死亡率的曲线。在本实验方案中，毒性评估的关键部分是在单次实验中测试一种或多种化学化合物的不同浓度。对于在幼虫中诱导出任何表型缺陷的化合物，需在暴露于化学物质后1至5天内，每隔24小时记录一次缺陷情况。与对照组相比，在250微摩尔和125微摩尔浓度下用β-CA抑制剂处理的胚胎表现出多种表型缺陷。例如，至第3天仍未孵化的胚胎、身体结构弯曲、卵黄囊未被吸收、心包水肿，以及处理后5天幼虫中耳石囊缺失。在另一项研究中，经碳酸酐酶抑制剂处理的胚胎表现出耳石囊和鱼鳔的缺失。实验鉴定出一种代表性化合物——碳酸酐酶9，该化合物在500微摩尔浓度下对胚胎发育过程中的表型影响极小或无明显改变。该化合物表现出较高的LC50浓度。然而，与对照组相比，该化合物在300微摩尔浓度下表现出神经毒性，并在暴露五天后诱导幼虫出现共济失调。高质量的胚胎对于化学物质的毒性筛选至关重要。为获得高质量的胚胎，应选用年轻的成年斑马鱼进行繁殖。筛选出安全的化合物后，可通过开展相关的体外和体内实验进一步表征其特性。在抗结核药物研发领域，该技术有助于建立在斑马鱼胚胎中抑制海洋分枝杆菌的体内实验。本方案涉及使用的化学品可能对人体具有毒性。参与实验的人员在处理化学品时应采取适当的防护措施。

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