利用稀有密码子富集标记鉴定氨基酸过量生产菌株

该方法为获得氨基酸高产菌株提供了一种高效替代传统基于类似物的途径。该技术通过同时实现高准确性、高灵敏度和高通量，优于传统的类似物筛选方法。该方法为理解氨基酸高产能力以及稀有密码子的翻译机制提供了新的视角，并且理论上可应用于所有微生物。

本方案主要依赖于基本的分子实验操作，这些操作易于遵循，但可能需要多次尝试才能实现适当的筛选字符串严紧性选择。该技术的可视化演示可直观展示筛选系统的性能，用于鉴定氨基酸生产菌株。开始此操作时，将载体加入标记片段中，置于冰上，按1:1的摩尔比加入7.5微升的连接反应混合液，总体积为10微升。

在50摄氏度孵育一小时。将五微升连接产物转入50微升感受态细胞中，在42摄氏度处理30秒。在37摄氏度下，于含分解代谢抑制的超级优化肉汤培养基中复苏细胞一小时。

然后，将它们接种到LB琼脂培养基上，在37摄氏度下过夜培养。第二天，使用优选的商业试剂盒提取质粒。首先，用1微升含有野生型KanR的质粒转化50微升感受态细胞。

用含有KanR RC 29的质粒转化另一组感受态细胞，该质粒中所有亮氨酸密码子均被替换为稀有密码子CTA。按照文字方案中所述方法进行涂板并培养细胞。随后，将含有野生型筛选标记基因的稀有密码子富集衍生物单菌落分别转移至5毫升五倍稀释的LB培养基中，该培养基含有浓度为50微克/毫升的卡那霉素。

将样品置于摇床中，在37摄氏度、250 rpm条件下孵育。然后，在规定的时间点，将每种细胞培养物各200 µL以每组三个复孔的方式转移至96孔板中。使用酶标仪测定OD600。

将含有 KanR RC 29 标记基因的菌株分别接种于两组含有卡那霉素的 0.2 x LB 培养基（每组 5 毫升）中，其中一组额外添加 L-亮氨酸。向其中一份培养基中添加 L-亮氨酸，使其终浓度为 1 克/升。将样品置于 37 °C 摇床中，以 250 rpm 振荡培养，并在指定时间点测定各培养物的 OD600 值。

首先，将50微升用于诱变的亲本菌株与1微升携带野生型GFP或野生型PPG的质粒进行转化。按照文本方案中所述的方法对细胞培养物进行涂板并培养。随后，将单个菌落分别转移至5毫升适当稀释的LB培养基中。

将样品置于摇床中，在 37 °C、250 rpm 条件下振荡孵育。对于荧光标记，在指定时间点，将 200 µL 细胞培养物以三复孔转移至 96 孔透明底黑色板中。在荧光检测仪中测定 OD600，并计算荧光强度。

对于显色标记，检测细胞培养物的颜色变化。按照先前所述方法进行喂养实验，并在指定时间点测定荧光强度或显色情况。首先，将50微升突变细胞与1微升携带筛选标记KanR RC 29或筛选标记GFP RC或PPG RC的质粒进行转化。接着，将细胞培养物在4000 × g条件下离心5分钟。

进行筛选时，弃去上清液，向含有筛选标记的细胞中加入5毫升含卡那霉素的0.2× LB培养基。将样品在37°C摇床中培养过夜。次日，将过夜培养物接种至含卡那霉素的0.2× LB琼脂培养基平板上，于37°C培养12小时。

进行筛选时，将含有筛选标记的适量细胞接种到含有适当抗生素的LB琼脂培养基上。在37摄氏度下培养八小时。之后，用平板上的每个单菌落分别接种含有适当抗生素的LB液体培养基。

将样品置于摇床中，在 37 °C、250 rpm 条件下振荡培养。若使用 GFP RC，需测定 OD600 和荧光值，并计算荧光强度；若使用 PPG RC，则测定细胞培养物的颜色变化。

为了验证候选菌株的氨基酸生产效率，将各候选菌株分别接种于5毫升LB培养基中，制备种子培养物，并在37摄氏度、250 rpm条件下于摇床中过夜培养。次日，取1毫升菌液在4000 ×g离心2分钟，收集菌体细胞。弃去上清液，并用1毫升无菌水重悬菌体沉淀。

取200微升细胞悬液接种于含4%葡萄糖的20毫升M9培养基中，于250毫升摇瓶中在37摄氏度、250 rpm条件下振荡培养24小时。次日，取1毫升培养液在4000 × g离心5分钟。将200微升上清液转移至洁净的1.5毫升离心管中。

配制此处所示浓度的L-亮氨酸标准溶液。在通风橱中，向每份上清液和标准品中分别加入100 µL 1毫摩尔三乙胺和100 µL 1摩尔苯基异硫氰酸酯。轻轻混匀溶液，并在室温下孵育1小时。

然后，向同一试管中加入 400 µL 正己烷，涡旋混匀 10 秒。下层相含有氨基酸衍生物，用于 HPLC 分析。将下层相通过 0.2 µm 聚四氟乙烯膜过滤。

此后，取一微升样品在配备C18色谱柱的超高效液相色谱仪上进行分析，流速为每分钟0.42毫升，柱温为40摄氏度。使用二极管阵列检测器在254纳米波长下检测目标氨基酸，并通过标准曲线下的峰面积计算其浓度。在本研究中，通过使用富含稀有密码子的标记物，可同时实现高准确性、高灵敏度和高通量，从而鉴定氨基酸的过量生产菌株。

在筛选系统中，与携带野生型基因的菌株相比，应观察到携带稀有密码子富集的抗生素抗性基因的菌株其OD600显著下降。稀有密码子对蛋白质表达的抑制主要发生在营养匮乏条件下。在额外补充相应氨基酸后，携带稀有密码子富集的抗生素抗性基因的菌株其OD600显著上升。

在筛选系统中，表达稀有密码子富集基因的菌株，其荧光细胞数量和荧光强度显著低于表达野生型基因的菌株。补充相应的氨基酸可恢复稀有密码子富集基因的蛋白质表达。当使用紫色蛋白时，稀有密码子富集的 PPG 产生的颜色比野生型基因产生的颜色更浅。

未稀释的LB培养基可在不添加L-亮氨酸的情况下实现富含稀有密码子的PPG的缓慢表达，当细胞沉淀后，表达的紫色蛋白即变得可见。然而，这并不掩盖一个事实，即L-亮氨酸的添加能够增强富含稀有密码子的PPG的基因表达。基于稀有密码子的策略可从突变文库中鉴定出目标氨基酸的高产菌株，这些突变株产生目标氨基酸的量应高于亲本菌株。

在进行该实验操作时，重要的是调整稀有密码子的频率，以在含有野生型标记的细胞与富含稀有密码子的衍生物细胞之间实现明显的光密度（OD）或颜色差异。可对筛选获得的菌株进行转录组分析和基因组测序，以研究与氨基酸生成相关的机制。利用该技术，可高效鉴定氨基酸高产菌株，对其遗传信息的分析将有助于深入理解氨基酸过量产生的分子机制。

氨基酸衍生化可能有害。务必佩戴手套和防护服，并在通风橱中进行这些步骤。