Name: 使用稀有的科顿富标记识别氨基酸过度生产者 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解利用稀有密码子富集标记筛选氨基酸高产菌株的高效方法。该技术同时实现准确性、灵敏度和高通量，优于传统毒性类似物筛选法，可广泛应用于微生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由国家自然科学基金（项目编号：21676026）和国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（项目编号：2017YFD0201400）和中国博士后科学基金（项目编号：2017M620643）提供资助。加州大学洛杉矶分校先进研究院（苏州）的工作获得了江苏省和苏州工业园区内部科研经费的支持。

1. 表达稀有密码子富集标记基因的质粒构建
<ol>
	<li>选择一个包含适量目标氨基酸常见密码子的标记基因。 
	注意：对于L-亮氨酸，使用含有29个亮氨酸密码子（其中27个为常见密码子）的卡那霉素抗性基因kanR来构建筛选系统13。对于筛选系统，则使用绿色荧光蛋白基因gfp（19个亮氨酸密码子中包含17个常见密码子）或紫色蛋白编码基因prancerpurple（ppg）（含有14个亮氨酸常见密码子）（补充表1）。</li>
	<li>将标记基因中的常见密码子替换为同义稀有密码子。对于L-亮氨酸，将其在kanR、gfp或ppg中的密码子替换为稀有密码子CTA，分别生成kanR-RCs、gfp-RC或ppg-RC13（补充表1）。 
	注意：标记基因中稀有密码子的频率将影响筛选或筛选系统的严格性。通常，增加稀有密码子的数量会提高筛选或筛选系统的严格性。为了获得适当的筛选或筛选强度，可设计一系列含有不同数量稀有密码子的标记基因，并比较其效果。</li>
	<li>使用GeneDesign14（http://54.235.254.95/gd/）等工具生成富含稀有密码子的标记基因的构建模块，用于基因合成。或者，可直接向商业基因合成服务公司订购这些标记基因。
	<ol>
		<li>在GeneDesign页面上，选择构建模块设计（恒定长度重叠）。</li>
		<li>将富含稀有密码子的标记基因序列粘贴到序列框中。</li>
		<li>定义组装寡核苷酸之间的重叠长度；请注意，默认的40 bp适用于大多数序列。 
		注意：有关其他参数设置的更多说明，请参阅在线手册。</li>
		<li>点击设计构建模块按钮，并订购页面上列出的寡核苷酸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过基于聚合酶链式反应（PCR）的精确合成方法合成经稀有密码子修饰的基因15。</li>
	<li>将富含稀有密码子的kanR-RC连接至载体pET-28a，gfp-RC连接至pSB1C3，ppg-RC连接至CPB-37-44116。 
	注意：pET-28a和pSB1C3质粒图谱可在SnapGene在线质粒数据库中获取（补充表1）；CPB-37-441质粒图谱可在ATUM显色蛋白网站上获取。
	<ol>
		<li>在冰上，将载体和标记基因片段以1:1的摩尔比加入7.5 μL的组装混合液中（见材料表），总体积为10 μL。将样品在50 °C孵育1小时。</li>
		<li>取5 μL组装产物转化至50 μL感受态细胞中（见材料表），42 °C热激30秒。</li>
		<li>在SOC（含分解代谢抑制的超级优化肉汤）培养基中37 °C恢复1小时，涂布于LB（溶菌肉汤）琼脂培养基上，37 °C过夜培养。</li>
		<li>挑取单菌落接种至LB培养基中，37 °C培养8小时。</li>
		<li>使用优选的商业化试剂盒提取质粒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 优化筛选条件
<ol>
	<li>将用于诱变的亲本菌株制备成感受态细胞17。</li>
	<li>取50 μL感受态细胞，加入1 μL携带野生型kanR的质粒进行转化；另取一组感受态细胞，用携带所有亮氨酸密码子被稀有密码子CTA替换的kanR-RC29质粒进行转化。</li>
	<li>加入950 μL SOC培养基，将样品在37 °C、250 rpm条件下振荡培养1小时。</li>
	<li>取100 μL菌液涂布于含有50 μg·mL-1卡那霉素的LB琼脂培养基上，37 °C培养约8小时，直至菌落出现。</li>
	<li>挑取含有野生型kanR和富含亮氨酸稀有密码子的kanR-RC29的菌落，分别接种于5 mL五倍稀释的LB培养基（0.2x LB）中，培养基中含50 μg·mL-1卡那霉素。将样品在37 °C、250 rpm条件下振荡培养。 
	注：培养基对该筛选系统至关重要。其碳源和氮源含量应仅足以支持野生型基因表达抗生素抗性蛋白，而不足以支持稀有密码子修饰后的衍生基因表达。在此情况下，1x LB培养基中的L-亮氨酸浓度过高，无法完全抑制富含稀有密码子的kanR基因的蛋白表达。因此，使用稀释5倍的LB培养基可使野生型基因与富含稀有密码子基因之间的蛋白表达差异更加明显。</li>
	<li>在设定的时间点（例如8小时、16小时和24小时），将每种菌液各200 μL以三个重复加入96孔板中。使用酶标仪测定OD600（600 nm处的光密度）。 
	注：若无法检测到携带富含稀有密码子标记基因的菌株其OD600低于携带野生型标记基因菌株的OD600，可尝试增加标记基因中稀有密码子的数量，或使用更稀释的培养基。</li>
	<li>进行氨基酸补加实验，检测通过提高目标氨基酸浓度是否可恢复富含稀有密码子标记基因（例如kanR-RC29）的表达。 
	注：对于L-亮氨酸过量生产菌株的筛选，应使用L-亮氨酸进行补加。
	<ol>
		<li>将携带kanR-RC29标记基因的菌株分别接种于5 mL 0.2x LB培养基（含50 μg·mL-1卡那霉素）中，一组添加1 g·L-1 L-亮氨酸，另一组不添加。另取5 mL 0.2x LB培养基接种携带野生型kanR的菌株作为对照。将样品在37 °C、250 rpm条件下振荡培养。</li>
		<li>在设定的时间点（例如15小时、17小时、19小时和22小时）测定各菌液的OD600。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 优化筛选条件
<ol>
	<li>将50 μL用于诱变的亲本菌株与1 μL携带野生型gfp或野生型ppg的质粒（约50 ng·μL-1）共转化。同时，将亲本菌株与含有稀有密码子富集的标记基因衍生物的质粒进行转化。</li>
	<li>加入950 μL SOC培养基，于37 °C、250 rpm条件下在摇床中孵育1小时。</li>
	<li>取100 μL菌液涂布于含有适当抗生素的LB琼脂培养基上（携带带有cmR标记的gfp质粒时使用25 μg·mL-1氯霉素，携带带有kanR标记的ppg质粒时使用50 μg·mL-1卡那霉素），于37 °C过夜培养。</li>
	<li>分别挑取一株含有野生型gfp或ppg的单菌落，以及一株含有相应稀有密码子富集型衍生物的单菌落，各自接种至5 mL适当稀释的LB液体培养基中。于37 °C、250 rpm摇床中孵育。 
	注：对于携带亮氨酸稀有密码子富集型gfp-RC或ppg-RC的E. coli菌株，可使用未稀释的LB培养基（1x LB），以显著增强野生型与稀有密码子富集型标记基因表达水平之间的差异。此外，筛选标记基因的表达由诱导型启动子驱动。为获得更佳的区分效果，应在细胞进入对数生长期时开始诱导。</li>
	<li>对于荧光标记，于设定时间点（例如2 h、4 h和6 h）分别取200 μL菌液，每组设三个重复，加入96孔透明底黑色板中。测定OD600和荧光值，并计算荧光强度（荧光值与OD600的比值）。对于显色标记，测定菌液的颜色发育情况。 
	注：若携带gfp-RC的菌株其荧光强度低于携带野生型gfp的菌株时无法被检测到，或表达来自ppg-RC的紫色蛋白的细胞其颜色较来自野生型基因的更浅却无法分辨，可尝试增加标记基因中稀有密码子的数量，或使用更稀释的培养基。</li>
	<li>进行喂养实验（参见步骤2.7.1和2.7.2）。在设定时间点（例如12 h、18 h和24 h）测定荧光强度或颜色发育情况。</li>
</ol>
4. 鉴定氨基酸过量生产菌株
<ol>
	<li>取100 μL突变株培养物接种于5 mL LB培养基（2% v/v）中，在37 °C、250 rpm条件下振荡培养，直至OD600值达到0.4。</li>
	<li>将突变株制备成感受态细胞17。</li>
	<li>向50 μL突变株感受态细胞中加入1 μL质粒（~50 ng·μL-1），该质粒携带筛选标记kanR-RC29或报告标记gfp-RC或ppg-RC。随后加入950 μL SOC培养基，在37 °C振荡培养1小时。</li>
	<li>筛选氨基酸高产菌株。
	<ol>
		<li>将菌液在4,000 × g条件下离心5分钟，弃上清，加入含50 μg·mL-1卡那霉素的5 mL 0.2× LB培养基，于37 °C振荡过夜培养。</li>
		<li>取过夜培养物适量（例如100 μL，根据菌液密度调整）涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的0.2× LB琼脂平板，37 °C培养12小时。 
		注：形成的菌落为潜在的目标氨基酸高产菌株，在本实验中即L-亮氨酸高产菌株。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对氨基酸高产菌株进行筛选。
	<ol>
		<li>将携带报告标记的适量菌液（例如100 μL，见步骤4.3）涂布于含相应抗生素的LB琼脂平板（使用gfp-RC时添加25 μg·mL-1氯霉素，使用ppg-RC时添加50 μg·mL-1卡那霉素），37 °C培养8小时。</li>
		<li>从平板上挑取单菌落，分别接种至含相应抗生素的LB液体培养基（参见步骤4.5.1），于37 °C、250 rpm条件下振荡培养。</li>
		<li>若使用gfp-RC，则测定OD600和荧光强度，并计算单位细胞的荧光强度；若使用ppg-RC，则观察菌液显色情况。注意，荧光强度高于亲本菌株或显色更深的菌株为候选氨基酸高产菌株，在本实验中即L-亮氨酸高产菌株。 
		注：当使用富含稀有密码子的荧光蛋白基因进行筛选时，荧光激活细胞分选技术也可用于鉴定单细胞水平的高产菌株。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>验证候选菌株的氨基酸生产能力。
	<ol>
		<li>将各候选菌株分别接种于5 mL LB培养基中，在37 °C、250 rpm条件下振荡过夜培养。</li>
		<li>取1 mL菌液在4,000 × g条件下离心2分钟，弃上清，用1 mL无菌水重悬菌体沉淀。</li>
		<li>取200 μL菌悬液接种至含4%葡萄糖的20 mL M9培养基中，在250 mL摇瓶中于37 °C、250 rpm条件下振荡培养24小时。</li>
		<li>取1 mL培养液在4,000 × g条件下离心5分钟，取200 μL上清转移至洁净的1.5 mL离心管中。同时配制L-亮氨酸标准溶液（HPLC级），浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5和1 g·L-1。</li>
		<li>向上清液及标准品中各加入100 μL 1 mM三乙胺和100 μL 1 M苯基异硫氰酸酯，轻轻混匀后室温孵育1小时18。 
		警告：三乙胺和苯基异硫氰酸酯可导致严重皮肤灼伤和眼部损伤，吸入有害。操作时应佩戴手套和口罩，尽可能在通风橱中进行。</li>
		<li>向同一试管中加入400 μL正己烷，涡旋振荡10秒。用0.2 μm聚四氟乙烯膜过滤下层含有氨基酸衍生物的水相。 
		警告：正己烷可引起皮肤刺激。操作时应佩戴手套和防护服。若接触皮肤，应立即用大量清水冲洗。</li>
		<li>将0.1 M醋酸钠溶液（pH 6.5）与乙腈按99.3:0.7的体积比混合，配制流动相A；以80% v/v乙腈水溶液作为流动相B。所有流动相均需经0.2 μm聚四氟乙烯膜过滤。 
		警告：乙腈吸入有害，可引起皮肤和眼睛刺激。操作时应佩戴手套和防护服，并在通风橱中进行。</li>
		<li>采用C18色谱柱的超高效液相色谱仪，按照表1中的洗脱程序，以0.42 mL·min-1流速和40 °C柱温进样1 μL样品。使用二极管阵列检测器在254 nm波长下检测目标氨基酸，并通过标准曲线法根据峰面积计算其浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间（分钟）</td>
			<td>流动相 A（%）</td>
			<td>流动相 B（%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>43</td>
			<td>57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.1</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：氨基酸定量的洗脱程序。

<ol><li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTatsumi%2C+N+%22Corynebacterium+glutamicum%3A+biology+and+biotechnology%22">Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology</a>. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).</li>
<li>Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTonouchi%2C+N+%22Amino+Acid+Fermentation%22">Amino Acid Fermentation</a>. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).</li>
<li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li>
<li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Progress%22%5BJournal%5D)">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li>
<li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids%3A+a+focus+on+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li>
<li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+metabolisms%2C+and+applications+of+L-proline+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li>
<li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+but+not+the+same%3A+the+causes+and+consequences+of+codon+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li>
<li>Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino%E2%80%90acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li>
<li>Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%2B+and+Rel%E2%88%92+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616(2018).</li>
<li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign%3A+rapid%2C+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li>
<li>Xiong, A. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li>
<li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li>
<li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li>
<li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li>
<li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharging+tRNAs%3A+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li>
<li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li>
<li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli%3A+an+analysis+of+three+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li>
<li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li>
<li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G%E2%80%A2+U+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507(2014).</li>
<li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li>
<li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+on+codon+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li>
<li>Huo, Y. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346(2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

标记基因中稀有密码子的数量以及选择或筛选培养基对于抑制稀有密码子修饰标记基因的蛋白表达至关重要。如果无法检测到野生型标记基因与其衍生基因之间蛋白表达的显著差异，则增加稀有密码子数量或使用营养受限培养基可能放大这种差异。然而，如果抑制效应过强，即使额外补充相应的氨基酸，蛋白表达也可能无法恢复。此时，应减少标记基因中的稀有密码子数量，以部分缓解压力。另一种精细调节选择或筛选严格性的方法是调整富含稀有密码子的标记基因的拷贝数和表达水平。通常，降低标记基因的拷贝数和表达水平可增强氨基酸过量生产菌株与初始菌株之间的区分度。因此，应使用含有低拷贝数复制起点（如 p15A 或 pSC101）以及弱启动子的载体。若标记基因由可诱导启动子驱动，则建议采用低强度诱导。
基于稀有密码子的氨基酸高产菌株筛选或选择策略，是对常用“密码子优化”策略的一种反向应用，后者旨在促进外源蛋白的表达。在密码子优化过程中，目标基因中的稀有密码子被宿主中对应的同义常见密码子所取代，从而使来自其他生物体的基因能够比含有大量稀有密码子的外源基因更快速地翻译成蛋白质19。因此，可以...

目前氨基酸的生产主要依赖发酵工艺。然而，大多数氨基酸生产菌株的滴度和产量仍低于全球价值数十亿美元的氨基酸市场不断增长的需求1,2。获得高性能的氨基酸过量生产菌株对于提升氨基酸产业水平至关重要。
传统策略通过氨基酸与其类似物在蛋白质合成中的竞争作用来鉴定氨基酸过量生产菌株3,4。这些类似物能够负载到识别相应氨基酸的tRNA上，从而抑制肽链的延伸，导致生长停滞或细胞死亡5。抵抗类似物胁迫的一种方式是提高细胞内氨基酸的浓度。富集的氨基酸将与类似物竞争有限的tRNA，确保功能蛋白的正确合成。因此，能够在类似物存在下存活的菌株可被筛选出来，并很可能为相应氨基酸的过量生产者。
尽管基于类似物的筛选策略在选育亮氨酸（L-leucine）等氨基酸的高产菌株方面已被证明是成功的6，但该策略存在严重缺陷。一个主要问题是突变过程中或自发突变导致的类似物抗性。具有抗性的菌株可通过阻断、外排或降解类似物的方式逃逸筛选5。另一个问题是类似物对其他细胞过程产生的毒性副作用7。因此，能够在类似物筛选中存活的菌株未必是目标氨基酸的高产菌株，而真正所需的高产菌株可能因这些不利的副作用而被错误淘汰。
在此，提出一种基于密码子偏好性规律的新策略，以实现对氨基酸过量生产菌株的准确快速鉴定。大多数氨基酸由多个不同的核苷酸密码子编码&#160;宿主生物以不同方式偏好的三联体8,9某些密码子在编码序列中很少被使用，被称为稀有密码子。这些密码子翻译为氨基酸依赖于携带相应氨基酸的同源tRNA。然而，识别稀有密码子的tRNA通常比识别常见密码子的tRNA丰度低得多。10,11因此，这些稀有tRNA在与其他同工受体竞争游离氨基酸时，捕获氨基酸的可能性较低；当氨基酸含量受限时，富含稀有密码子的序列的翻译开始减缓，甚至可能终止。10理论上，如果由于过量表达或额外补充相应的氨基酸，导致同义的普通tRNA在充电后出现氨基酸过剩，则这些翻译可能被恢复。12如果富含稀有密码子的基因编码一种筛选或选择标记，则可轻松识别出具有相应表型的菌株，这些菌株很可能为目标氨基酸的过量生产者。
上述策略可用于建立筛选和鉴定氨基酸高产菌株的选择与筛选系统。选择系统采用抗生素抗性基因（如 kanR）作为标记，而筛选系统则采用编码荧光蛋白（如绿色荧光蛋白 [GFP]）或显色蛋白（如 PrancerPurple）的基因。在这两个系统中，标记基因均通过将目标氨基酸的常见密码子替换为其同义的稀有密码子，且替换数量经过明确定义。在突变文库中，携带富含稀有密码子标记基因的菌株可在适当条件下进行选择或筛选，从而快速识别出目标氨基酸的高产菌株。该工作流程首先构建富含稀有密码子的标记基因系统，随后优化实验条件，最终实现氨基酸高产菌株的鉴定与验证。这种无需依赖类似物的策略基于蛋白质翻译的基本原理，并已在实践中被证实可准确、快速地鉴定氨基酸高产菌株。理论上，该策略可直接应用于具有稀有密码子的氨基酸以及所有微生物。总之，当特定氨基酸缺乏合适类似物，或假阳性率较高成为主要问题时，基于稀有密码子的策略可作为传统类似物依赖方法的一种高效替代方案。以下实验方案以亮氨酸的稀有密码子为例，演示该策略在鉴定大肠杆菌（Escherichia coli）L-亮氨酸高产菌株中的应用。

<table><tbody><tr><td>乙腈</td><td>Thermo</td><td>51101</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure HiPure 质粒小提试剂盒</td><td>Transgen</td><td>EM111-01</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure 快速凝胶回收试剂盒</td><td>Transgen</td><td>EG101-01</td><td></td></tr><tr><td>Gibson 组装预混液</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Thermo</td><td>H3061</td><td></td></tr><tr><td>苯基异硫氰酸酯</td><td>Sigma</td><td>P1034</td><td></td></tr><tr><td>PrancerPurple CPB-37-441</td><td>ATUM</td><td>CPB-37-441</td><td></td></tr><tr><td>TransStar FastPfu Fly DNA 聚合酶</td><td>Transgen</td><td>AP231-01</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>超高效液相色谱仪</td><td>Agilent</td><td>1290 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>野生型 &lt;em&gt;C. glutamicum&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>13032</td><td></td></tr><tr><td>XL10-Gold&lt;em&gt; E. coli&lt;/em&gt; 感受态细胞</td><td>Agilent</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 色谱柱</td><td>Agilent</td><td>959759-902K</td><td></td></tr></tbody></table>

利用稀有密码子富集标记鉴定氨基酸过量生产菌株

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

为了满足日益增长的氨基酸市场需求，需要高性能的生产菌株。传统上，氨基酸过量生产菌株的筛选依赖于氨基酸与其类似物之间的竞争作用。然而，这种基于类似物的方法准确性较低，且适用于特定氨基酸的类似物种类有限。本文提出一种替代策略，利用富含稀有密码子的标记基因，实现对氨基酸过量生产菌株的高准确性、高灵敏度和高通量筛选。该策略基于蛋白质翻译过程中存在的密码子使用偏好现象：根据密码子在编码DNA中的出现频率，可分为常见密码子和稀有密码子。稀有密码子的翻译依赖于其对应的稀有转运RNA（tRNA），而在氨基酸缺乏条件下，这些tRNA无法被相应的氨基酸完全荷载。理论上，当目标氨基酸在荷载同义的常见tRNA后仍有富余时，稀有tRNA便可被有效荷载，从而恢复因稀有密码子导致的翻译延迟。基于这一原理，通过在抗生素抗性基因或编码荧光蛋白、显色蛋白的基因中，将目标氨基酸的常见密码子替换为其同义的稀有密码子，构建出用于筛选氨基酸过量生产菌株的选择或筛选系统。我们证明，引入稀有密码子可显著抑制蛋白表达，且蛋白表达水平与相应氨基酸浓度呈正相关。利用该系统，可从突变文库中高效筛选出多种氨基酸的过量生产菌株。这种基于稀有密码子的策略仅需单个修饰基因，且与其它方法相比，宿主菌更难以逃逸筛选压力。该方法为获得氨基酸过量生产菌株提供了一种新的有效途径。

在筛选系统中，与携带野生型抗生素抗性基因的菌株相比，携带富含稀有密码子的抗生素抗性基因的菌株在适宜培养基中培养时，其OD600应出现显著下降（图1a）。在相同条件下，随着抗生素抗性基因中稀有密码子数量的增加，细胞OD600的下降变得更加明显（图1a）。需要注意的是，稀有密码子对蛋白表达的抑制主要发生在营养匮乏条件下。因此，如果LB培养基未被适当稀释，则与携带野生型基因的菌株相比，携带富含稀有密码子标记基因的菌株不会表现出明显的细胞OD600下降（图1b）。在额外补充相应氨基酸后，携带富含稀有密码子抗生素抗性基因的菌株的OD600将显著升高，并接近携带野生型基因菌株的水平（图1c）。
<p class="jove_content" fo:kee...

本研究提出了一种替代传统基于毒性类似物方法的新策略，通过使用稀有密码子富集的标记物，同时实现氨基酸高产菌株鉴定的准确性、灵敏度和高通量。

为了满足日益增长的氨基酸市场需求，需要高性能的生产菌株。氨基酸过量生产菌株通常……

该方法为获得氨基酸高产菌株提供了一种高效替代传统基于类似物的途径。该技术通过同时实现高准确性、高灵敏度和高通量，优于传统的类似物筛选方法。该方法为理解氨基酸高产能力以及稀有密码子的翻译机制提供了新的视角，并且理论上可应用于所有微生物。本方案主要依赖于基本的分子实验操作，这些操作易于遵循，但可能需要多次尝试才能实现适当的筛选字符串严紧性选择。该技术的可视化演示可直观展示筛选系统的性能，用于鉴定氨基酸生产菌株。开始此操作时，将载体加入标记片段中，置于冰上，按1:1的摩尔比加入7.5微升的连接反应混合液，总体积为10微升。在50摄氏度孵育一小时。将五微升连接产物转入50微升感受态细胞中，在42摄氏度处理30秒。在37摄氏度下，于含分解代谢抑制的超级优化肉汤培养基中复苏细胞一小时。然后，将它们接种到LB琼脂培养基上，在37摄氏度下过夜培养。第二天，使用优选的商业试剂盒提取质粒。首先，用1微升含有野生型KanR的质粒转化50微升感受态细胞。用含有KanR RC 29的质粒转化另一组感受态细胞，该质粒中所有亮氨酸密码子均被替换为稀有密码子CTA。按照文字方案中所述方法进行涂板并培养细胞。随后，将含有野生型筛选标记基因的稀有密码子富集衍生物单菌落分别转移至5毫升五倍稀释的LB培养基中，该培养基含有浓度为50微克/毫升的卡那霉素。将样品置于摇床中，在37摄氏度、250 rpm条件下孵育。然后，在规定的时间点，将每种细胞培养物各200 µL以每组三个复孔的方式转移至96孔板中。使用酶标仪测定OD600。将含有 KanR RC 29 标记基因的菌株分别接种于两组含有卡那霉素的 0.2 x LB 培养基（每组 5 毫升）中，其中一组额外添加 L-亮氨酸。向其中一份培养基中添加 L-亮氨酸，使其终浓度为 1 克/升。将样品置于 37 °C 摇床中，以 250 rpm 振荡培养，并在指定时间点测定各培养物的 OD600 值。首先，将50微升用于诱变的亲本菌株与1微升携带野生型GFP或野生型PPG的质粒进行转化。按照文本方案中所述的方法对细胞培养物进行涂板并培养。随后，将单个菌落分别转移至5毫升适当稀释的LB培养基中。将样品置于摇床中，在 37 °C、250 rpm 条件下振荡孵育。对于荧光标记，在指定时间点，将 200 µL 细胞培养物以三复孔转移至 96 孔透明底黑色板中。在荧光检测仪中测定 OD600，并计算荧光强度。对于显色标记，检测细胞培养物的颜色变化。按照先前所述方法进行喂养实验，并在指定时间点测定荧光强度或显色情况。首先，将50微升突变细胞与1微升携带筛选标记KanR RC 29或筛选标记GFP RC或PPG RC的质粒进行转化。接着，将细胞培养物在4000 × g条件下离心5分钟。进行筛选时，弃去上清液，向含有筛选标记的细胞中加入5毫升含卡那霉素的0.2× LB培养基。将样品在37°C摇床中培养过夜。次日，将过夜培养物接种至含卡那霉素的0.2× LB琼脂培养基平板上，于37°C培养12小时。进行筛选时，将含有筛选标记的适量细胞接种到含有适当抗生素的LB琼脂培养基上。在37摄氏度下培养八小时。之后，用平板上的每个单菌落分别接种含有适当抗生素的LB液体培养基。将样品置于摇床中，在 37 °C、250 rpm 条件下振荡培养。若使用 GFP RC，需测定 OD600 和荧光值，并计算荧光强度；若使用 PPG RC，则测定细胞培养物的颜色变化。为了验证候选菌株的氨基酸生产效率，将各候选菌株分别接种于5毫升LB培养基中，制备种子培养物，并在37摄氏度、250 rpm条件下于摇床中过夜培养。次日，取1毫升菌液在4000 ×g离心2分钟，收集菌体细胞。弃去上清液，并用1毫升无菌水重悬菌体沉淀。取200微升细胞悬液接种于含4%葡萄糖的20毫升M9培养基中，于250毫升摇瓶中在37摄氏度、250 rpm条件下振荡培养24小时。次日，取1毫升培养液在4000 × g离心5分钟。将200微升上清液转移至洁净的1.5毫升离心管中。配制此处所示浓度的L-亮氨酸标准溶液。在通风橱中，向每份上清液和标准品中分别加入100 µL 1毫摩尔三乙胺和100 µL 1摩尔苯基异硫氰酸酯。轻轻混匀溶液，并在室温下孵育1小时。然后，向同一试管中加入 400 µL 正己烷，涡旋混匀 10 秒。下层相含有氨基酸衍生物，用于 HPLC 分析。将下层相通过 0.2 µm 聚四氟乙烯膜过滤。此后，取一微升样品在配备C18色谱柱的超高效液相色谱仪上进行分析，流速为每分钟0.42毫升，柱温为40摄氏度。使用二极管阵列检测器在254纳米波长下检测目标氨基酸，并通过标准曲线下的峰面积计算其浓度。在本研究中，通过使用富含稀有密码子的标记物，可同时实现高准确性、高灵敏度和高通量，从而鉴定氨基酸的过量生产菌株。在筛选系统中，与携带野生型基因的菌株相比，应观察到携带稀有密码子富集的抗生素抗性基因的菌株其OD600显著下降。稀有密码子对蛋白质表达的抑制主要发生在营养匮乏条件下。在额外补充相应氨基酸后，携带稀有密码子富集的抗生素抗性基因的菌株其OD600显著上升。在筛选系统中，表达稀有密码子富集基因的菌株，其荧光细胞数量和荧光强度显著低于表达野生型基因的菌株。补充相应的氨基酸可恢复稀有密码子富集基因的蛋白质表达。当使用紫色蛋白时，稀有密码子富集的 PPG 产生的颜色比野生型基因产生的颜色更浅。未稀释的LB培养基可在不添加L-亮氨酸的情况下实现富含稀有密码子的PPG的缓慢表达，当细胞沉淀后，表达的紫色蛋白即变得可见。然而，这并不掩盖一个事实，即L-亮氨酸的添加能够增强富含稀有密码子的PPG的基因表达。基于稀有密码子的策略可从突变文库中鉴定出目标氨基酸的高产菌株，这些突变株产生目标氨基酸的量应高于亲本菌株。在进行该实验操作时，重要的是调整稀有密码子的频率，以在含有野生型标记的细胞与富含稀有密码子的衍生物细胞之间实现明显的光密度（OD）或颜色差异。可对筛选获得的菌株进行转录组分析和基因组测序，以研究与氨基酸生成相关的机制。利用该技术，可高效鉴定氨基酸高产菌株，对其遗传信息的分析将有助于深入理解氨基酸过量产生的分子机制。氨基酸衍生化可能有害。务必佩戴手套和防护服，并在通风橱中进行这些步骤。

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用稀有的科顿富标记识别氨基酸过度生产者

表型相关的遗传关联通常在功能层面上仍不明确。本方法旨在通过分析对转录的SNP呈杂合状态的细胞，评估表型相关遗传标记对基因表达的影响。该技术利用MALDI-TOF质谱法精确测量等位基因特异性的引物延伸产物，实现定量分析。...

一种等位基因特异性基因表达检测法，用于验证遗传关联的功能基础

聚合酶链式反应（PCR）结合高分辨率熔解分析（HRMA）被证明是一种快速高效鉴定斑马鱼基因型的方法。...

利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

我们介绍一种利用高通量测序对蛋白质的全面单点饱和突变文库进行功能评估的实验方案。该方法的关键在于使用正交引物对实现文库构建和测序的多重扩增。文中提供了以临床相关剂量的氨苄西林筛选TEM-1...

一种利用高通量测序对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案

本文介绍了一种易于使用的无细胞表达方案，可将非天然氨基酸类似物特异性地掺入蛋白质中，并包含下游分析方法，适用于医学、药物学、结构和功能研究。...

利用无细胞蛋白表达系统在模型蛋白中实现非天然氨基酸的残基特异性插入 大肠杆菌 无细胞转录-翻译系统

本文介绍了一种从金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

一种基于串联液相色谱-质谱法的代谢物分析方法 金黄色葡萄球菌

合成生物学可通过共翻译插入非经典氨基酸，实现具有前所未有特性的蛋白质的工程化。本文介绍了如何通过选择性压力整合（SPI）在E.

通过非天然氨基酸的选择性压力整合及质谱与荧光蛋白分析技术构建“金色”荧光蛋白

氨基酸水平的信噪比分析可确定特定氨基酸位点遗传变异的普遍程度，该值已相对于特定人群的背景遗传变异进行标准化。这有助于识别变异 "热点"...

利用氨基酸水平的遗传变异信噪比分析确定变异致病可能性

核糖体在翻译过程中以每密码子三个核苷酸的规律解码生成肽链。核糖体沿mRNA移动的过程通过核糖体谱型分析（ribosome...

从头合成 利用核糖体谱分析数据鉴定活跃翻译的开放阅读框

本方案描述了如何利用表达突变型L274G-甲硫氨酰tRNA合成酶（MetRS*）的小鼠品系，通过叠氮诺亮氨酸（ANL）对特定细胞类型的蛋白质进行标记，并详细说明了分离标记蛋白质所需的步骤。我们概述了在活体小鼠中使用ANL的两种给药途径：（1）饮水给药和（2）腹腔注射。...

利用突变型甲硫氨酸tRNA合成酶小鼠品系从复杂组织中进行细胞类型特异性蛋白质纯化与鉴定

本文所述方案提供了在用户友好的 UCSC 基因组浏览器上，利用 PhyloCSF...

一种用于微蛋白鉴定与序列分析的整合方法

本方案描述了进行酵母表面展示筛选实验的关键步骤，以富集能够结合目标抗原的蛋白质变体。...

利用酵母表面展示技术进行蛋白质工程

了解利用稀有密码子富集标记筛选氨基酸高产菌株的高效方法。该技术同时实现准确性、灵敏度和高通量，优于传统毒性类似物筛选法，可广泛应用于微生物学研究。

利用稀有密码子富集标记鉴定氨基酸过量生产菌株

探索更多视频