Name: 使用哺乳动物细胞中的微球菌核酸酶进行染色质免疫沉淀测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习使用微球菌核酸酶进行染色质免疫沉淀测定，以识别蛋白质与DNA的相互作用，揭示基因转录调控的分子机制。该方法通过酶切消化提高实验可重复性，适用于哺乳动物细胞研究。

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本研究由基因泰克公司向希望之城支付的专利使用费支持。本工作未获得美国国立卫生研究院全部或部分支持。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>配制18.5%的多聚甲醛（PFA）溶液。在50 mL锥形塑料管中加入0.925 g PFA、4.8 mL水（整个实验过程中均使用超纯水）和35 µL 1 M KOH。盖紧管盖，将管子置于盛有约200 mL水的400–600 mL玻璃烧杯中，用微波炉加热。在水沸腾前取出管子，涡旋振荡以溶解PFA。待PFA冷却至室温后，置于冰上保存。 
	注意：重复加热和混匀步骤，直至PFA完全溶解。在交联反应前（步骤2.1.3）立即配制PFA溶液。</li>
	<li>配制1.25 M甘氨酸溶液。将14.07 g甘氨酸溶于150 mL水中，经0.22 µm孔径滤膜过滤，4 °C保存。</li>
	<li>配制ChIP细胞裂解缓冲液。将378 mg PIPES、10.6 mL 2 M KCl和1.25 g支链辛基苯氧基聚（乙二醇）乙醇溶解于水中，在4 °C条件下用1 M KOH调节pH至8.0，并定容至250 mL。经0.22 µm孔径滤膜过滤后，4 °C保存。</li>
	<li>配制微球菌核酸酶（MNase）消化缓冲液。每1 mL溶液包含：0.1 mL 10× MNase消化缓冲液、10 µL 100× BSA溶液、10 µL 0.1 M二硫苏糖醇和0.88 mL水。</li>
	<li>配制1 M NaHCO3溶液。将4.2 g NaHCO3溶于50 mL水中，经0.22 µm孔径滤膜过滤，室温保存。</li>
	<li>配制10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。将5 g SDS溶于50 mL水中，室温保存。</li>
	<li>配制洗脱缓冲液。将15 µL 1 M NaHCO3、15 µL 10% SDS和120 µL水混合，得到一份样品所需的150 µL洗脱缓冲液。 
	注意：根据样品数量按比例增加各组分体积。</li>
	<li>配制3 M乙酸钠溶液（pH 5.2）。将24.6 g无水乙酸钠溶于水中，用乙酸调节pH至5.2，并定容至100 mL。经0.22 µm孔径滤膜过滤后，室温保存。</li>
</ol>
2. 确定MNase消化条件
注意：在方案的第2步中，以VCaP人前列腺癌细胞为例进行说明。可使用任何哺乳动物细胞系；详见各步骤中的注释。
<ol>
	<li>交联染色质的制备
	<ol>
		<li>将 VCaP 细胞维持在含 10% 胎牛血清（FBS）的高糖 DMEM 培养基中，于 37 °C 的二氧化碳培养箱中培养。在六个 6 cm 培养皿中，每皿加入 4 mL 培养基并接种 4 × 106 个细胞，培养 3 天。 
		注意：应根据每种细胞系使用适当的培养基。每个 6 cm 或 10 cm 培养皿最多可接种 10 × 106 个细胞。对于悬浮细胞，应接种于 T25 培养瓶中。所需培养皿或培养瓶的数量取决于 MNase 消化实验中测试的剂量数量。若测试 4 个剂量，则准备 6 个培养皿或培养瓶。另见步骤 2.2。</li>
		<li>使用胰蛋白酶从一个培养皿中解离 VCaP 细胞并计数细胞，计算单个培养皿中的细胞数量。对于悬浮细胞，从一个培养瓶中取出少量细胞悬液进行计数。</li>
		<li>向含 4 mL 培养基的 6 cm 培养皿中加入 0.229 mL 的 18.5% 多聚甲醛（PFA），使终浓度为 1%。轻轻但充分地旋转培养皿或培养瓶，使 PFA 均匀分布。在室温下精确孵育 10 分钟。 
		注意：此步骤中染色质与蛋白质发生交联。由于 PFA 具有毒性，操作应在化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。</li>
		<li>10 分钟后，加入 0.47 mL 的 1.25 M 甘氨酸溶液，使终浓度为 125 mM。室温孵育 5 分钟。 
		注意：甘氨酸可中和过量的 PFA，从而终止进一步交联。</li>
		<li>吸除甲醛/甘氨酸/培养基。用 4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。对于悬浮细胞，将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，加入一个培养基体积的 PBS 并充分重悬。重复此步骤一次。由于废液中含有甲醛，应妥善处理。</li>
		<li>通过向 PBS 中加入 1/100 体积的 100× 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（PIC），配制含 PIC 的 PBS。吸除培养皿中的 PBS，每皿加入 1 mL 含 PIC 的 PBS。刮取细胞并将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。对于悬浮细胞，直接将悬液转移至 1.5 mL 离心管中即可。</li>
		<li>在室温下以 3,000 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。用移液器彻底去除 PBS。记录每管细胞数量，并将细胞沉淀保存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解与 MNase 消化 
	注意：以下步骤中的试剂用量基于每管含有 6 × 106 个细胞。根据细胞数量按比例调整试剂用量；当每管含有 2 × 106 个细胞时，使用 100 µL ChIP 细胞裂解缓冲液（步骤 2.2.1）、MNase 消化缓冲液（步骤 2.2.3）和 ChIP 稀释缓冲液（步骤 2.2.5），以及 10 µL 的 0.5 M EDTA（pH 8.0）（步骤 2.2.4）。
	<ol>
		<li>将步骤 2.1.7 制备的冻存细胞沉淀（VCaP 细胞，每管含 6 × 106 个细胞）置于冰上解冻。通过向 ChIP 细胞裂解缓冲液中加入 1/100 体积的 100× PIC，配制含 PIC 的缓冲液。加入 300 µL 含 PIC 的 ChIP 细胞裂解缓冲液，充分重悬沉淀。涡旋振荡 15 秒，冰上孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 9,000 × g 离心 3 分钟，彻底吸除上清液。将沉淀重悬于 300 µL MNase 消化缓冲液中。</li>
		<li>用 MNase 消化缓冲液将 MNase（2,000 凝胶单位/µL）稀释至 50 凝胶单位/µL。向悬液中分别加入 0、0.5、1、2、4 µL 的 50 凝胶单位/µL MNase，在 37 °C 下精确孵育 10 分钟，每 2.5 分钟轻轻颠倒混匀一次。 
		注意：表 1 显示了多种细胞系中 MNase 的最佳用量。</li>
		<li>加入 30 µL 的 0.5 M EDTA（pH 8.0）以终止 MNase 消化，短暂涡旋。冰上孵育 5 分钟。在 4 °C 下以 9,000 × g 离心 5 分钟，彻底吸除上清液。</li>
		<li>通过向 ChIP 稀释缓冲液中加入 1/100 体积的 100× PIC，配制含 PIC 的 ChIP 稀释缓冲液。将沉淀重悬于 300 µL 含 PIC 的 ChIP 稀释缓冲液中。</li>
		<li>使用配备微探头的超声仪在冰上对悬液进行超声处理。超声条件如下：振幅 2，处理时间 15 秒，脉冲开启 5 秒，脉冲关闭 30 秒。取 1 µL 悬液点样于载玻片，显微镜下观察。确保细胞结构几乎完全破碎。 
		注意：图 1A 展示了 VCaP 细胞悬液在超声处理前后的代表性显微照片。此步骤旨在通过破坏核膜将消化后的染色质释放至上清液中。功率设置应低于最大功率的 5%，可尝试以 30 秒以上间隔重复超声 5 秒共三次。若设备支持瓦特控制，建议将功率设为 5 W，总处理时间为 15 秒（如上所述），总能量达 70–75 J。检查细胞结构是否如上述被破坏。若未充分破碎，可再重复一次。上述条件已实际适用于所有测试的细胞系。</li>
		<li>在 4 °C 下以 9,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，保留 20 µL 消化后的染色质用于步骤 2.3。其余样品保存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转交联、DNA 纯化及消化染色质分析
	<ol>
		<li>向一个 1.5 mL 螺口管中加入 75 µL 水、4 µL 的 5 M NaCl 和 1 µL 蛋白酶 K。将步骤 2.2.7 中不同 MNase 消化条件下获得的 20 µL 消化染色质分别加入含有水、NaCl 和蛋白酶 K 的各管中。盖紧管盖，充分混匀，于 65 °C 过夜孵育。 
		注意：此步骤用于去除蛋白质与 DNA 之间的交联。</li>
		<li>每种条件准备两个 1.5 mL 微量离心管。向其中一个 1.5 mL 管中加入 100 µL 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）（PCI）。向另一管中加入 10 µL 的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 2 µL 糖原。 
		注意：无需使用氯仿:异戊醇7。增加体积可能导致乙醇沉淀后 DNA 回收率降低8。</li>
		<li>短暂离心步骤 2.3.1 中含有消化染色质的管，加入 100 µL PCI。盖紧管盖，剧烈涡旋形成乳状液。在室温下以最高速度（例如 20,000 × g）离心 30 秒。</li>
		<li>小心吸取含 DNA 的上层相，加入步骤 2.3.2 中已准备好的含 PCI 的管中。剧烈涡旋，按步骤 2.3.3 的条件再次离心。 
		注意：若下层相发生污染，可再次离心，或先移除大部分下层相后再离心，并小心吸取上层相。</li>
		<li>按照步骤 2.3.4 所述小心吸取上层相，加入步骤 2.3.2 中已准备好的含醋酸钠和糖原的管中。加入 250 µL 乙醇。通过颠倒混匀，室温孵育 10 分钟。在 4 °C 下以最高速度（例如 20,000 × g）离心 30 分钟。 
		注意：溶液在室温下孵育不影响 DNA 回收率8,9。</li>
		<li>确认管底的沉淀物。小心吸除上清液，避免扰动沉淀，加入 500 µL 70% 乙醇。在 4 °C 下以最高速度（例如 20,000 × g）离心 5 分钟。</li>
		<li>彻底吸除上清液，在室温下干燥沉淀约 5 分钟。将沉淀溶解于 20 µL 的 10 mM Tris·HCl/1 mM EDTA（pH 8.0）（TE）中。使用紫外分光光度计测定 DNA 浓度。</li>
		<li>将 0.5 µg DNA 与上样染料混合，加样至 2% 琼脂糖凝胶中。在 TAE 缓冲液中以 100 V 电泳，直至紫色染料迁移至凝胶三分之二处，用 0.5 µg/mL 溴化乙锭染色 10 分钟，拍摄凝胶图像。 
		注意：详见 图 2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 染色质免疫沉淀
<ol>
	<li>消化染色质的制备
	<ol>
		<li>准备细胞。对于贴壁细胞，每处理组在2个培养皿（6 cm或10 cm）中接种2-10 × 106个细胞，并使细胞贴附于培养皿底部超过1天。对于悬浮细胞，每处理组接种于2个T25培养瓶中。按需处理细胞。</li>
		<li>从每组中取出一个培养皿或培养瓶，按步骤2.1.2所述方法计数细胞数量。按照步骤2.1.3–2.1.7所述方法制备交联染色质。</li>
		<li>按照步骤2.2.1–2.2.7所述方法裂解细胞沉淀并进行MNase消化。使用步骤2中确定的最佳量的MNase消化染色质。将消化后的染色质储存于-80 °C。</li>
		<li>取20 µL消化后的染色质进行交联逆转，并按步骤2.3.8所述方法纯化DNA。按照步骤2.3.7所述方法测定DNA浓度。将样品在2%琼脂糖凝胶中电泳，以检测消化后染色质的片段大小，如步骤2.3所述。 
		注意：该DNA浓度与步骤3.1.3中制备并储存的消化染色质相同。</li>
		<li>将步骤3.1.4中逆转交联的消化染色质样品用水稀释至10 ng/µL，并进行系列稀释，得到1、0.1和0.01 ng/µL的浓度。储存于-20 °C。 
		注意：这些样品用于实时PCR的标准品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫沉淀 
	注意：在本方案的步骤3.2–3.5中，测定VCaP细胞中三甲基化组蛋白H3赖氨酸4（H3K4me3）的占据情况。另见图3。
	<ol>
		<li>解冻步骤3.1.3中获得的消化染色质。所有样品均需保持在冰上。</li>
		<li>通过向缓冲液中加入1/100体积的100×蛋白酶抑制剂混合物（PIC），制备含PIC的ChIP稀释缓冲液。用含PIC的ChIP稀释缓冲液将消化染色质稀释至5 µg/500 µL。准备1,000 µL以上体积，用于以下两种免疫沉淀：(1) 使用非免疫性IgG（对照IgG）进行IP；(2) 使用H3K4me3抗体进行IP。</li>
		<li>取5 µL浓度为5 µg/500 µL的消化染色质加入1.5 mL螺口管中作为输入样品（相当于一次IP的1%）。将样品储存于-80 °C。</li>
		<li>取500 µL浓度为5 µg/500 µL的消化染色质加入1.5 mL螺口管中作为IP样品。向管中加入2 µg抗体。盖紧管盖，在4 °C下轻轻振荡孵育过夜，使用摇床平台进行温和混合。 
		注意：尽管最佳抗体用量应通过实验确定，但建议初次使用时每IP加入2 µg抗体。</li>
		<li>每IP加入30 µL ChIP级蛋白G磁珠。在4 °C下轻轻振荡孵育2小时，使用摇床平台进行温和混合。 
		注意：磁珠无需预先洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫复合物的洗涤与交联逆转
	<ol>
		<li>短暂离心步骤3.2.5中的管子。将管子放入含钕磁铁的聚乙烯架中静置1分钟。小心吸除上清液。</li>
		<li>每管加入0.5 mL低盐免疫复合物洗涤缓冲液。通过轻弹管壁或短暂涡旋使磁珠充分分散。在4 °C下轻轻振荡孵育5分钟。5分钟后，重复步骤3.3.1。</li>
		<li>每管加入0.5 mL高盐免疫复合物洗涤缓冲液。按步骤3.3.2的方法分散并洗涤磁珠。洗涤后，重复步骤3.3.1。</li>
		<li>每管加入0.5 mL LiCl免疫复合物洗涤缓冲液。按步骤3.3.2的方法分散并洗涤磁珠。洗涤后，重复步骤3.3.1。</li>
		<li>将管子置于磁力架中1分钟，彻底去除残留上清液。</li>
		<li>向管中加入150 µL洗脱缓冲液。涡旋振荡使磁珠完全分散。盖紧管盖，在65 °C下孵育30分钟，每隔5分钟颠倒混匀或涡旋一次，以确保磁珠充分分散。</li>
		<li>孵育期间，准备一个1.5 mL螺口管，加入6 µL 5 M NaCl和2 µL蛋白酶K。解冻步骤3.2.3中制备的1%输入样品。向该输入样品中加入150 µL洗脱缓冲液、6 µL 5 M NaCl和2 µL蛋白酶K。</li>
		<li>孵育结束后，短暂离心管子。将管子置于磁力架中1分钟，转移上清液至步骤3.3.7中已加入NaCl和蛋白酶K的螺口管中。</li>
		<li>盖紧所有IP和输入样品管的管盖，充分涡旋混匀。在65 °C下孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA纯化
	<ol>
		<li>按步骤2.3.2所述准备试管，加入150 µL PCI（而非100 µL）。在另一试管中加入12 µL 3 M乙酸钠（pH 5.2）和2 µL糖原。</li>
		<li>从孵育器中取出试管，短暂离心后加入150 µL PCI。</li>
		<li>剧烈涡旋试管以形成乳液。在室温下以最大速度（例如20,000 × g）离心30秒。</li>
		<li>小心转移140 µL上层液体至步骤3.4.1中已准备好的含PCI的试管中。重复步骤3.4.3。 
		注意：另见步骤2.3.4中的说明。</li>
		<li>小心转移120 µL上层液体至步骤3.4.1中已准备好的含乙酸钠和糖原的试管中。 
		注意：另见步骤2.3.4中的说明。</li>
		<li>加入300 µL乙醇。颠倒混匀，室温孵育10分钟。</li>
		<li>在4 °C下以最大速度（例如20,000 × g）离心30分钟。按步骤2.3.6所述方法洗涤沉淀。</li>
		<li>按步骤2.3.7所述方法干燥沉淀后，将沉淀溶解于50 µL TE缓冲液中。储存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用实时PCR检测DNA片段
	<ol>
		<li>解冻以下样品：(1) 使用对照IgG进行的IP样品，(2) 使用抗H3K4me3抗体进行的IP样品，(3) 1%输入样品。同时解冻步骤3.1.5中制备的4个浓度的标准品（共7个样品）。 
		注意：使用同一组标准品对输入和IP样品中的DNA量进行定量。</li>
		<li>配制8个样品的PCR工作液。混合40 µL 2×实时PCR超混合液、8 µL 4 µM正向引物、8 µL 4 µM反向引物和8 µL水。 
		注意：每个PCR反应体系包含5 µL 2×实时PCR超混合液、1 µL 4 µM正向引物、1 µL 4 µM反向引物和1 µL水。引物序列见表2。</li>
		<li>将8 µL PCR工作液分装至PCR板的一个孔中。加入2 µL来自步骤3.4.8的样品或来自步骤3.1.5的标准品。</li>
		<li>密封PCR板，并按以下条件运行PCR程序：1) 95 °C预变性3分钟；2) 95 °C变性10秒；3) 56 °C退火30秒；4) 72 °C延伸30秒并采集数据；重复步骤2)至4)共55个循环。循环结束后，测定PCR产物的熔解曲线并分析数据。 
		注意：图3的原始数据见表3。利用标准曲线计算样品的起始量（SQ）。将1%输入样品的SQ乘以100，将其调整为相当于一次IP的输入量，得到输入样品的校正SQ值（公式1）。将IP样品的SQ除以输入样品的校正SQ，得到%输入值（百分比输入法，公式2）。计算富集倍数时，将抗H3K4me3抗体IP样品的SQ除以对照IgG IP样品的SQ（富集倍数法，公式3）。 
		输入样品校正SQ = （1%输入样品SQ）× 100 （1） 
		H3K4me3的%输入 = 100 × （抗H3K4me3抗体IP样品SQ）/（输入样品校正SQ）（2） 
		H3K4me3的富集倍数 = （抗H3K4me3抗体IP样品SQ）/（对照IgG IP样品SQ）（3）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

尽管超声处理常用于获得片段化的染色质，但确定可重复的实验条件往往耗时且繁琐。在本实验方案中，我们采用MNase消化法，因为酶消化更易于实现条件的可重复性。MNase消化后需进行短暂的超声处理（见步骤2.2），以破坏细胞膜并释放已消化的染色质。因此，本方案中的超声功率应尽可能低。我们对所使用的所有细胞均采用相同的超声条件（见图1和Table 1），以实现细胞膜的完全破裂。
使用MNase消化染色质是本实验方案中的关键步骤，因此我们投入了大量精力优化细胞内染色质消化的条件。消化活性取决于酶量、底物（染色质）量以及孵育时间。此外，由于不同细胞的倍性存在差异，必须针对每种细胞类型确定MNase消化的最佳条件。一旦确定，无论细胞接受何种处理，均可采用相同的消化条件。在每次实验中，我们都会检测染色质的消化模式，以确保其适用于ChIP实验，如图2A第5泳道所示。
某些因素会影响染色质免疫沉...

哺乳动物细胞中的基因表达受到严密且动态的调控，其中转录是关键步骤之一。基因转录主要由转录因子和组蛋白进行调控。转录因子是一类能够结合特定DNA序列并控制基因转录的蛋白质，它们通过促进或抑制RNA聚合酶II（PolII）的招募，从而启动以基因组DNA为模板的mRNA合成1。组蛋白尾部残基的乙酰化和甲基化等组蛋白修饰，可通过改变染色质结构对基因转录产生正向或负向影响2。由于基因表达的改变会影响细胞状态，因此研究转录调控的分子机制至关重要。
迄今为止，已有多种方法可用于研究基因转录的调控机制。电泳迁移率变动分析（EMSA），也称为凝胶迁移分析，用于分析蛋白质与DNA之间的相互作用3。将目标细胞的核提取物与放射性同位素（例如32P）标记的DNA探针孵育后，在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。其自显影图像显示，DNA-蛋白质复合物在凝胶中的迁移速度比游离探针更慢。当存在针对该蛋白质的抗体时，DNA-蛋白质-抗体三元复合物在凝胶中的迁移速度比DNA-蛋白质复合物更慢。这种发生“上移”的条带可揭示DNA与蛋白质之间的特异性结合。然而，EMSA仅能检测无细胞体系中的特定DNA-蛋白质相互作用，因此尚不清楚该相互作用是否在活细胞中调控转录过程。为研究细胞内基因表达的调控，发展了瞬时报告基因检测法，通常称为荧光素酶报告基因检测。通常将目的基因上游的基因组区域插入报告基因质粒中，瞬时转染细胞后检测报告基因的活性。通过构建多种缺失突变体，可鉴定出参与基因调控的关键区域。尽管报告基因检测是识别调控转录的转录因子及其结合DNA序列的有效工具，但该方法存在一个主要缺陷：报告基因质粒不含染色质结构，无法真实反映体内的转录机制。此外，该系统也无法检测组蛋白修饰的变化。
染色质免疫沉淀（ChIP）方法的建立基于Jackson和Chalkley的报道，即使用甲醛进行“全细胞”固定可保持染色质结构4,5。此后，许多相关技术相继被开发并不断改进6。在ChIP实验中，细胞经甲醛固定以交联DNA与蛋白质，随后对染色质进行片段化，并利用特异性抗体进行免疫沉淀。免疫复合物经洗涤后，纯化其中的DNA。通过针对基因组特定区域设计的引物进行PCR扩增，可揭示目标蛋白在基因组中的结合情况。
尽管染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于鉴定蛋白质（如转录因子和修饰组蛋白）与DNA相互作用的强大工具，但在实际操作中该方法存在一些困难，例如染色质片段化步骤。超声处理（Sonication）已被广泛用于染色质剪切；然而，要确定可重复的实验条件较为繁琐。微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease, MNase）处理是染色质剪切的另一种替代方法。MNase是一种内切-外切核酸酶，能够消化双链、单链、环状和线性DNA及RNA。相对而言，确定最佳染色质片段化的实验条件较为简便，包括染色质和酶的用量、温度以及孵育时间等参数。我们对现有方案进行了改进和简化，建立了一种直接且可重复的方法。本文提供了在哺乳动物细胞中使用MNase进行ChIP检测的实验方案。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>2x iQ SYBR Green supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1706862</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>50 bp DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Research Product International</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>支链辛基苯氧基聚乙氧基乙醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>I8896</td><td>IGEPAL CA-630</td></tr><tr><td>ChIP级蛋白G磁珠</td><td>Cell signaling technology</td><td>9006S</td><td></td></tr><tr><td>染色质免疫沉淀（ChIP）稀释缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-153</td><td>缓冲液成分：0.01% SDS，1.1% Triton X-100，1.2 mM EDTA，16.7 mM Tris-HCl，pH 8.1，167 mM NaCl。</td></tr><tr><td>紫色凝胶上样染料（6x）</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0724</td><td>电泳级</td></tr><tr><td>糖原</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1767</td><td>19–22 mg/mL</td></tr><tr><td>Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（无EDTA，100x）</td><td>Thermo Scientific</td><td>78445</td><td></td></tr><tr><td>高盐免疫复合物洗涤缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-155</td><td>缓冲液成分：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 8.1，500 mM NaCl。</td></tr><tr><td>H3K4me3组蛋白抗体（pAb）</td><td>Active Motif</td><td>39915</td><td></td></tr><tr><td>LiCl免疫复合物洗涤缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-156</td><td>缓冲液成分：0.25 M LiCl，1% IGEPAL CA630，1%脱氧胆酸钠，1 mM EDTA，10 mM Tris，pH 8.1。</td></tr><tr><td>低盐免疫复合物洗涤缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-154</td><td>缓冲液成分：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 8.1，150 mM NaCl。</td></tr><tr><td>Magna GrIP磁力架（8孔）</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-400</td><td>任何可兼容1.5 mL离心管的磁力分离架均可使用。</td></tr><tr><td>微球菌核酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>附带10x缓冲液（500 mM Tris-HCl，50 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，25 &amp;deg;C时pH 7.9）和100x BSA（10 mg/mL）</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker</td><td>3506-01</td><td></td></tr><tr><td>正常兔IgG</td><td>Millipore Sigma</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Millipore Sigma</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>实时PCR系统</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96, C1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA聚合酶II CTD磷酸化Ser5抗体</td><td>Active Motif</td><td>39749</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>100155</td><td>电泳级</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>配备微探头的超声破碎仪</td><td>QSONICA</td><td>Q700</td><td>任何可兼容1.5 mL离心管的超声破碎仪均可使用。</td></tr><tr><td>UltraPure苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1, v/v）</td><td>Thermo Scientific</td><td>15593031</td><td>pH 8.05</td></tr></tbody></table>

使用微球菌核酸酶在哺乳动物细胞中进行染色质免疫沉淀实验

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

为了在生物体中表达细胞表型，活细胞会相应地执行基因表达，而转录程序在基因表达中起着核心作用。细胞的转录机制及其染色质修饰蛋白协同调控转录过程。为了在分子水平上分析转录调控，已有多种实验方法可供使用，例如电泳迁移率变动实验、瞬时报告基因实验以及染色质免疫沉淀（ChIP）实验。本文详细描述了一种经过改进的ChIP实验方法，因其在直接展示组蛋白修饰以及细胞内蛋白质与DNA相互作用方面具有优势。成功进行ChIP实验的关键步骤之一是染色质剪切。尽管超声处理常用于染色质剪切，但难以确定可重复的实验条件。我们采用微球菌核酸酶（MNase）进行酶解消化，而非超声剪切，以获得更可重复的结果。本文提供了一种使用MNase的简便ChIP实验方案。

染色质消化是ChIP实验中的重要步骤之一。我们使用MNase消化染色质，以获得核小体寡聚体的混合物。在MNase消化过程中，MNase能够穿过核膜并消化染色质，但消化后的染色质无法穿过核膜，仍保留在细胞核内。为了将消化后的染色质从细胞核中释放出来，需要进行短暂的超声处理。图1A展示了VCaP细胞悬液在超声处理前后的显微照片。未经超声处理时，细胞结构保持完整，表明染色质仍存在于细胞核中。短暂的超声处理可破坏细胞结构，通过显微照片观察细胞状态有助于确定合适的短暂超声条件。我们还展示了在293T细胞（图1B）、人B细胞急性淋巴细胞白血病细胞系REH细胞（图1C）以及人前列腺癌细胞系LNCaP（图1D）中进行短暂超声的其他示例。
图2A显示了在VCaP细胞中使用不同量的MNase处理后染色质的片...

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究基因调控分子机制的有力工具。然而，该方法在通过机械剪切获得可重复的染色质片段化方面存在困难。在此，我们提供一种利用酶解消化的ChIP检测的改进方案。

为了在生物体中表达细胞表型，活细胞会相应地执行基因表达，而转录程序在基因表达中起着核心作用。

在本实验方案中，我们可以鉴定蛋白质与DNA之间的相互作用，揭示基因的转录调控机制，从而有助于理解细胞内的分子作用机制。我们对已有的实验方案进行了改进，建立了一种更为简便且清晰的检测流程。您只需严格按照第一步的方案操作，即可成功完成该检测。为制备交联染色质，在通风橱中，向一个六厘米培养皿中加入四毫升 1% VCaP 细胞培养基和 0.229 毫升 18.5% PFA。轻轻摇晃培养皿，使 PFA 均匀分布。在室温下准确孵育10分钟。然后，向培养皿中加入0.47毫升1.25摩尔的甘氨酸溶液，在室温下再孵育5分钟，以终止进一步的交联反应。按照文稿中的步骤洗涤细胞后，刮取细胞并将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。将含有细胞悬液的离心管在室温下以3,000 × g离心5分钟，以收集细胞沉淀。使用移液器彻底去除PBS。记录每管的细胞数量，并将细胞沉淀保存于-80摄氏度。进行细胞裂解时，首先将储存的 VCaP 细胞沉淀物置于冰上融化。向每管中加入 300 微升预先配制的 ChIP 细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物 PIC），并充分重悬细胞沉淀。涡旋振荡管子 15 秒，然后将悬液置于冰上孵育 10 分钟。在4°C、9,000 × g条件下离心3分钟。完全移除上清液，加入300 µL MNase消化缓冲液重悬沉淀。在1.5 mL离心管中用MNase消化缓冲液稀释MNase，使其浓度为每微升50个凝胶单位。将稀释后的MNase加入悬液中，在37摄氏度下准确孵育10分钟。每2分30秒轻轻颠倒混匀一次。为终止MNase消化反应，加入30微升pH为8的0.5摩尔EDTA，并短暂涡旋振荡。冰上孵育5分钟后，在4°C条件下以9,000 × g离心5分钟。完全去除上清液，并将沉淀重悬于300 µL预先配制的ChIP稀释缓冲液中，缓冲液中需添加PIC。随后，在配备微探头的超声破碎仪上，将超声条件设置为振幅2，处理时间15秒，脉冲开启5秒，脉冲关闭30秒。将悬浮液在冰上进行超声处理。吸取一微升悬浮液，点样到载玻片上。在显微镜下观察，以确认细胞结构几乎已被破坏。在4°C条件下，以9,000 × g离心10分钟，然后将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。取20微升消化后的染色质样品置于1.5毫升螺旋盖管中用于后续处理，其余样品储存于-80°C。首先，在每个1.5毫升螺旋盖管中加入75微升水、4微升5摩尔的氯化钠和1微升蛋白酶K。为去除蛋白质与DNA之间的交联，将每种MNase消化条件下的20微升消化后染色质加入螺旋盖管中。盖紧管盖，充分混匀，并在65摄氏度下孵育过夜。次日早晨，将离心管在2,000至3,000 ×g下离心数秒后，加入100 µL PCI试剂。剧烈涡旋振荡以形成乳状液。将离心管在室温下以最大速度再次离心30秒。然后，每种条件准备两个1.5毫升的微量离心管。向其中一个管中加入100微升PCI。在另一支离心管中加入10微升pH值为5.2的3摩尔醋酸钠溶液和2微升糖原。从离心机中取出的离心管中，小心吸取含有DNA的上清液，并将其加入含有PCI的离心管中。剧烈涡旋振荡，然后在室温下以最大转速离心30秒。接着，将上层相转移至预先准备好的含有乙酸钠和糖原的离心管中。加入 250 µL 乙醇，通过倒置混匀。室温孵育 10 分钟。将离心管在4°C下以最大速度离心30分钟。确认管底有沉淀物。小心移除上清液，避免扰动沉淀，然后加入500 µL 70%乙醇。在4°C条件下，以最大速度离心5分钟。完全去除上清液，并在室温下干燥沉淀约5分钟。然后加入20 µL TE溶解沉淀。使用紫外分光光度计测量DNA浓度。在制备消化后的染色质后，将所有样品置于冰上解冻。加入1200微升含有PIC的制备好的ChIP稀释缓冲液，将消化后的染色质稀释至每500微升含5微克DNA的浓度。取5 µL稀释后的消化染色质加入1.5 mL螺口管中作为输入样品，将样品储存于-80 °C。取500 µL稀释后的消化染色质加入1.5 mL螺口管中作为免疫沉淀样品。向每根试管中加入两微克抗体，并盖紧管盖。将试管置于四摄氏度下，在摇动平台上轻轻混匀，过夜孵育。次日早晨，向每根试管中加入30微升ChIP级蛋白G磁珠。将试管再次于 4 摄氏度孵育 2 小时，同时轻柔混匀。随后，在 2,000 至 3,000 ×g 条件下短暂离心，将试管放入含有钕磁铁的聚乙烯架中静置 1 分钟。然后，小心吸取上清液弃去。接下来，向每根试管中加入 0.5 毫升低盐免疫复合物洗涤缓冲液。短暂涡旋振荡试管，以充分分散磁珠。将试管置于 4 摄氏度条件下，在摇动平台上轻柔混匀孵育 5 分钟。根据文章所述，依次用高盐免疫复合物和氯化锂免疫复合物重复洗涤步骤。彻底去除残留的上清液后，向离心管中加入150微升洗脱缓冲液。涡旋振荡离心管，使磁珠完全分散。盖上管盖，在65摄氏度下孵育30分钟。为充分分散珠子，每5分钟颠倒混匀一次。孵育期间，准备一个1.5毫升离心管，加入6 µL 5 M氯化钠和2 µL蛋白酶K。将先前在冰上制备的1%输入样本解冻。向输入样品中加入150微升洗脱缓冲液、6微升5摩尔的氯化钠以及2微升蛋白酶K。含有磁珠的离心管孵育后进行离心。将离心管置于磁力架上1分钟，然后将上清液转移至含有氯化钠和蛋白酶K的螺旋管中。交联细胞沉淀在超声处理前后的代表性显微照片显示出明显差异。如果不进行超声处理，细胞结构保持完整，表明染色质存在于细胞核内。短暂的超声处理可破坏细胞结构。从 VCaP 细胞中制备交联染色质，并用不同量的微球菌核酸酶（MNase）进行消化。不添加MNase时，出现分子量非常高的弥散条带。加入MNase后呈现出梯状条带，表明MNase消化了核小体间的连接区域。只有产生长度不超过900 bp染色质片段的条件才可视为适当的消化；而不适当的消化模式主要表现为过度消化，导致大量单核小体的生成。VCaP 细胞中染色质的消化模式表明染色质得到了适当的消化。H3K4me3 在雄激素受体转录起始位点（AR-TSS）上游约 0.5 千碱基和 1 千碱基处的占据率最高。然而，在 AR-TSS 上游 19 千碱基和 8 千碱基以及下游 12 千碱基的区域，H3K4me3 的占据率很低，表明这些区域可作为阴性对照区域。确定 MNase 消化条件最为重要。每次实验均需保持细胞数量、缓冲液体积和酶用量一致。每种细胞类型都必须确定其特定的消化条件。我们可以进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），以分析转录因子的全基因组结合情况，并结合染色质构象捕获技术，确定远端基因组位点之间的相互作用。该方法有助于揭示转录过程的分子机制。染色质免疫沉淀（ChIP）实验是研究转录调控的有力工具，但操作繁琐且重复性较差。我们的方法鼓励研究人员常规且简便地开展该检测。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用哺乳动物细胞中的微球菌核酸酶进行染色质免疫沉淀测定

核小体ELISA（NU-ELISA）是一种灵敏且定量的方法，用于检测天然完整核小体制备物中翻译后修饰的全局模式。这些修饰包括组蛋白特定氨基酸残基上的甲基化、乙酰化和磷酸化，因此NU-ELISA可提供一种全局蛋白质组学检测手段，用于分析特定细胞类型的总体染色质修饰状态。...

通过ELISA检测天然完整核小体上的翻译后修饰

来源：Mendez, F. M. et al.，利用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀。J. Vis. Exp.

神经球细胞的天然染色质免疫沉淀

我们介绍一种使用原代T细胞进行染色质免疫沉淀的稳健方法。该方法基于标准流程，但采用了一套特定的条件和试剂，可提高对有限数量细胞的操作效率。尤为重要的是，本文详细描述了数据分析阶段的具体步骤。...

使用有限生物量进行高效的染色质免疫沉淀

通过将DNA损伤剂连接至三链形成寡核苷酸（TFO），可实现靶向的DNA损伤。利用经修饰的TFO，结合本文所述的染色质免疫沉淀分析和DNA超螺旋分析方法，可在人细胞中研究DNA损伤特异性蛋白结合及DNA拓扑结构的改变。...

研究结构蛋白HMGB1在螺旋扭曲、位点特异性DNA链间交联加工中作用的工具

本研究介绍了一种利用成熟小鼠T细胞系进行染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方案。该方案适用于研究特定组蛋白修饰在特定启动子区域或全基因组范围内的分布情况。...

小鼠T细胞系中的染色质免疫沉淀（ChIP）

表观遗传机制在胶质瘤中经常发生改变。染色质免疫沉淀可用于研究胶质瘤中由组蛋白修饰变化引起的遗传改变后果，这些修饰调控染色质结构和基因转录。本方案描述了对小鼠脑肿瘤神经球进行的天然染色质免疫沉淀实验。...

使用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀

该方法通过特异性序列捕获交联的染色质，进而进行蛋白质组学分析，从而在特定靶位点鉴定新的DNA相互作用蛋白。该方法无需预先了解潜在的结合蛋白，也无需对细胞进行修饰。该技术最初为酵母开发，现已适用于哺乳动物细胞。...

染色质相关蛋白杂交捕获技术在哺乳动物细胞蛋白质组学中的应用优化

本文介绍了一种高效染色质免疫沉淀（ChIP）后接高通量DNA测序（ChIP-seq）的实验方案，适用于从小鼠分离的棕色脂肪组织（BAT）样本。该方案可用于全基因组范围内组蛋白修饰的定位分析，以及非组蛋白目标蛋白的全基因组定位研究。 体内.

小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

精确测定蛋白质在整个基因组上的结合位点对于理解基因调控至关重要。本文描述了一种 基因组定位方法，该方法对染色质免疫沉淀获得的DNA进行外切酶消化处理（ChIP-exo），随后进行高通量测序。该方法可在哺乳类神经元中以接近单碱基对分辨率和高信噪比检测蛋白质-DNA相互作用。...

利用染色质免疫沉淀-外切酶技术（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中进行蛋白质-DNA相互作用的高分辨率作图

CUT&amp;#38;RUN 及其变体可用于确定蛋白质在染色质上的占据情况。本实验方案描述了如何利用单细胞 uliCUT&amp;#38;RUN...

使用超低输入量靶向切割与核酸酶释放技术进行染色质上单细胞因子定位

本文介绍了一种利用全基因组染色体构象捕获方法Micro-C-XL，以核小体分辨率绘制三维基因组结构的实验方案。...

利用 Micro-C-XL 绘制哺乳动物三维基因组相互作用

学习使用微球菌核酸酶进行染色质免疫沉淀测定，以识别蛋白质与DNA的相互作用，揭示基因转录调控的分子机制。该方法通过酶切消化提高实验可重复性，适用于哺乳动物细胞研究。

使用微球菌核酸酶在哺乳动物细胞中进行染色质免疫沉淀实验

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