使用微球菌核酸酶在哺乳动物细胞中进行染色质免疫沉淀实验

在本实验方案中，我们可以鉴定蛋白质与DNA之间的相互作用，揭示基因的转录调控机制，从而有助于理解细胞内的分子作用机制。我们对已有的实验方案进行了改进，建立了一种更为简便且清晰的检测流程。

您只需严格按照第一步的方案操作，即可成功完成该检测。为制备交联染色质，在通风橱中，向一个六厘米培养皿中加入四毫升 1% VCaP 细胞培养基和 0.229 毫升 18.5% PFA。轻轻摇晃培养皿，使 PFA 均匀分布。

在室温下准确孵育10分钟。然后，向培养皿中加入0.47毫升1.25摩尔的甘氨酸溶液，在室温下再孵育5分钟，以终止进一步的交联反应。按照文稿中的步骤洗涤细胞后，刮取细胞并将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。

将含有细胞悬液的离心管在室温下以3,000 × g离心5分钟，以收集细胞沉淀。使用移液器彻底去除PBS。记录每管的细胞数量，并将细胞沉淀保存于-80摄氏度。

进行细胞裂解时，首先将储存的 VCaP 细胞沉淀物置于冰上融化。向每管中加入 300 微升预先配制的 ChIP 细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物 PIC），并充分重悬细胞沉淀。涡旋振荡管子 15 秒，然后将悬液置于冰上孵育 10 分钟。

在4°C、9,000 × g条件下离心3分钟。完全移除上清液，加入300 µL MNase消化缓冲液重悬沉淀。在1.5 mL离心管中用MNase消化缓冲液稀释MNase，使其浓度为每微升50个凝胶单位。

将稀释后的MNase加入悬液中，在37摄氏度下准确孵育10分钟。每2分30秒轻轻颠倒混匀一次。为终止MNase消化反应，加入30微升pH为8的0.5摩尔EDTA，并短暂涡旋振荡。

冰上孵育5分钟后，在4°C条件下以9,000 × g离心5分钟。完全去除上清液，并将沉淀重悬于300 µL预先配制的ChIP稀释缓冲液中，缓冲液中需添加PIC。随后，在配备微探头的超声破碎仪上，将超声条件设置为振幅2，处理时间15秒，脉冲开启5秒，脉冲关闭30秒。

将悬浮液在冰上进行超声处理。吸取一微升悬浮液，点样到载玻片上。在显微镜下观察，以确认细胞结构几乎已被破坏。

在4°C条件下，以9,000 × g离心10分钟，然后将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。取20微升消化后的染色质样品置于1.5毫升螺旋盖管中用于后续处理，其余样品储存于-80°C。首先，在每个1.5毫升螺旋盖管中加入75微升水、4微升5摩尔的氯化钠和1微升蛋白酶K。为去除蛋白质与DNA之间的交联，将每种MNase消化条件下的20微升消化后染色质加入螺旋盖管中。

盖紧管盖，充分混匀，并在65摄氏度下孵育过夜。次日早晨，将离心管在2,000至3,000 ×g下离心数秒后，加入100 µL PCI试剂。剧烈涡旋振荡以形成乳状液。

将离心管在室温下以最大速度再次离心30秒。然后，每种条件准备两个1.5毫升的微量离心管。向其中一个管中加入100微升PCI。

在另一支离心管中加入10微升pH值为5.2的3摩尔醋酸钠溶液和2微升糖原。从离心机中取出的离心管中，小心吸取含有DNA的上清液，并将其加入含有PCI的离心管中。剧烈涡旋振荡，然后在室温下以最大转速离心30秒。

接着，将上层相转移至预先准备好的含有乙酸钠和糖原的离心管中。加入 250 µL 乙醇，通过倒置混匀。室温孵育 10 分钟。

将离心管在4°C下以最大速度离心30分钟。确认管底有沉淀物。小心移除上清液，避免扰动沉淀，然后加入500 µL 70%乙醇。

在4°C条件下，以最大速度离心5分钟。完全去除上清液，并在室温下干燥沉淀约5分钟。然后加入20 µL TE溶解沉淀。

使用紫外分光光度计测量DNA浓度。在制备消化后的染色质后，将所有样品置于冰上解冻。加入1200微升含有PIC的制备好的ChIP稀释缓冲液，将消化后的染色质稀释至每500微升含5微克DNA的浓度。

取5 µL稀释后的消化染色质加入1.5 mL螺口管中作为输入样品，将样品储存于-80 °C。取500 µL稀释后的消化染色质加入1.5 mL螺口管中作为免疫沉淀样品。

向每根试管中加入两微克抗体，并盖紧管盖。将试管置于四摄氏度下，在摇动平台上轻轻混匀，过夜孵育。次日早晨，向每根试管中加入30微升ChIP级蛋白G磁珠。

将试管再次于 4 摄氏度孵育 2 小时，同时轻柔混匀。随后，在 2,000 至 3,000 ×g 条件下短暂离心，将试管放入含有钕磁铁的聚乙烯架中静置 1 分钟。然后，小心吸取上清液弃去。

接下来，向每根试管中加入 0.5 毫升低盐免疫复合物洗涤缓冲液。短暂涡旋振荡试管，以充分分散磁珠。将试管置于 4 摄氏度条件下，在摇动平台上轻柔混匀孵育 5 分钟。

根据文章所述，依次用高盐免疫复合物和氯化锂免疫复合物重复洗涤步骤。彻底去除残留的上清液后，向离心管中加入150微升洗脱缓冲液。涡旋振荡离心管，使磁珠完全分散。

盖上管盖，在65摄氏度下孵育30分钟。为充分分散珠子，每5分钟颠倒混匀一次。孵育期间，准备一个1.5毫升离心管，加入6 µL 5 M氯化钠和2 µL蛋白酶K。将先前在冰上制备的1%输入样本解冻。

向输入样品中加入150微升洗脱缓冲液、6微升5摩尔的氯化钠以及2微升蛋白酶K。含有磁珠的离心管孵育后进行离心。将离心管置于磁力架上1分钟，然后将上清液转移至含有氯化钠和蛋白酶K的螺旋管中。交联细胞沉淀在超声处理前后的代表性显微照片显示出明显差异。

如果不进行超声处理，细胞结构保持完整，表明染色质存在于细胞核内。短暂的超声处理可破坏细胞结构。从 VCaP 细胞中制备交联染色质，并用不同量的微球菌核酸酶（MNase）进行消化。

不添加MNase时，出现分子量非常高的弥散条带。加入MNase后呈现出梯状条带，表明MNase消化了核小体间的连接区域。只有产生长度不超过900 bp染色质片段的条件才可视为适当的消化；而不适当的消化模式主要表现为过度消化，导致大量单核小体的生成。

VCaP 细胞中染色质的消化模式表明染色质得到了适当的消化。H3K4me3 在雄激素受体转录起始位点（AR-TSS）上游约 0.5 千碱基和 1 千碱基处的占据率最高。然而，在 AR-TSS 上游 19 千碱基和 8 千碱基以及下游 12 千碱基的区域，H3K4me3 的占据率很低，表明这些区域可作为阴性对照区域。

确定 MNase 消化条件最为重要。每次实验均需保持细胞数量、缓冲液体积和酶用量一致。每种细胞类型都必须确定其特定的消化条件。

我们可以进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），以分析转录因子的全基因组结合情况，并结合染色质构象捕获技术，确定远端基因组位点之间的相互作用。该方法有助于揭示转录过程的分子机制。染色质免疫沉淀（ChIP）实验是研究转录调控的有力工具，但操作繁琐且重复性较差。

我们的方法鼓励研究人员常规且简便地开展该检测。