Name: 枯草芽孢杆菌中细菌体和内膜的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习使用超分辨率结构光照明显微镜（3D-SIM）技术可视化枯草芽孢杆菌孢子中的萌发受体蛋白簇和内膜脂质结构域。该方法可实现对细菌体和内膜的高分辨率成像。

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作者感谢 Christiaan Zeelenberg 在 SIM 成像过程中的协助。JW 感谢中国国家留学基金管理委员会提供的博士生奖学金，并感谢 Irene Stellingwerf 在成像初期阶段提供的帮助。

1. B. subtillis&#160;孢子形成（时间：显微镜观察前 7 天）
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>将细菌培养物划线接种于Luria-Bertani肉汤（LB）琼脂平板（1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，1% NaCl，1% 琼脂）13，37 °C过夜培养以获得单菌落。使用 B. subtilis KGB80（PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan）菌株及其亲本背景菌株 B. subtilis PS4150（PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet），方法如前所述7。 
		注意：在萌发体可视化实验中，使用 ΔcotEΔgerE 背景的芽孢至关重要，以最大限度减少芽孢外膜层的自发荧光7。</li>
		<li>使用适当方法对所有培养基、试管、移液管及其他培养材料进行灭菌处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>清晨将单个菌落接种至5 mL LB培养基中，于螺旋盖试管中37 °C、200 rpm/min持续振荡培养，直至OD600达到0.3–0.4（约7小时）。</li>
		<li>配制500 mL MOPS培养基（pH 7.5），其中包含3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.4 μM H3BO3、30 nM CoCl2·6H2O、10 nM CuSO4·5H2O、10 nM ZnSO4·7H2O、1.32 mM K2HPO4、0.4 mM MgCl2·6H2O、0.276 mM K2SO4、0.01 mM FeSO4·7H2O、0.14 mM CaCl2·2H2O、80 mM MOPS、4 mM Tricine、0.1 mM MnCl2·2H2O、10 mM D-葡萄糖一水合物和10 mM NH4Cl。</li>
		<li>在螺旋盖试管中，用5 mL MOPS培养基对LB培养物进行10-1至10-7的系列稀释，每管5 mL，并于200 rpm/min、37 °C持续振荡培养过夜。 
		注意：此处进行的系列稀释旨在获得次日清晨处于早期对数生长期的稀释液。此步骤及下一步对于细胞适应MOPS缓冲生长培养基至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>选择OD600为0.3–0.4的MOPS稀释液之一，取0.2 mL培养物接种至预热（37 °C）的20 mL MOPS培养基中，装于250 mL锥形瓶，持续振荡培养至OD600达到0.3–0.4（约7小时）。</li>
		<li>将MOPS基础的芽孢形成培养基（250 mL）按1%（v/v）接种第3.1.1步的预培养物，并于1 L锥形瓶中37 °C持续振荡培养3天。若对PS4150芽孢进行FM4-64染色，则在达到营养生长OD600峰值（通常约为2）后1或2小时，向芽孢形成培养基中加入2 µg/mL FM4-64探针（见材料表），并在避光条件下继续培养使其形成芽孢5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第7天：芽孢收获
	<ol>
		<li>使用相差显微镜在100倍放大倍数下观察，区分相位明亮的芽孢与相位暗淡的细胞及可能的未成熟芽孢，以确定芽孢形成率（芽孢与营养细胞比例）。预期芽孢产率可达90%相位明亮。</li>
		<li>在圆底离心管中，4 °C、4,270 x g离心15分钟收集芽孢。在50 mL锥形离心管中，用40 mL无菌超纯一级去离子水洗涤芽孢沉淀2–3次（见材料表）。每次洗涤后均于4 °C、4,270 x g离心15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第7天： 芽孢纯化
	<ol>
		<li>芽孢纯化：将芽孢沉淀重悬于750 µL 20%非离子密度梯度介质中（见材料表），加至已装有800 µL 50%非离子密度梯度介质的无菌微量离心管中。21,500 x g离心60分钟。所得沉淀即为游离芽孢。将芽孢沉淀重悬于200 µL 20%非离子密度梯度介质中，加至微量离心管中含1 mL 50%非离子密度梯度介质的上层，21,500 x g离心15分钟。</li>
		<li>最终芽孢制备物的洗涤与保存：所得沉淀即为纯化的休眠芽孢。用1.5 mL无菌超纯一级水洗涤芽孢沉淀2–3次（见材料表），每次间隔于4 °C、9,560 x g离心15分钟。最后将沉淀重悬于无菌超纯一级水中，调节终浓度OD600 约为30。芽孢分装后可在-80 °C保存8周14。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脱壳
<ol>
	<li>将PS4150孢子在70 °C下用0.1 M NaCl/0.1 M NaOH/1%十二烷基硫酸钠（SDS）/0.1 M二硫苏糖醇（DTT）处理1小时。用无菌超纯一级水洗涤孢子10次15,16。通过此步骤可去除吸附在孢子外膜及外层的FM4-64探针。</li>
</ol>
3. 盖玻片和载玻片的准备11（时间：观察前1小时）
<ol>
	<li>将高精度盖玻片（参见材料表）在1 M HCl中于轻柔振荡的水浴中预清洗30分钟。用超纯一级水清洗盖玻片两次，并将其保存在100%（体积比）乙醇中。使用前使其干燥并检查透明度。用70%乙醇预清洗载玻片，干燥后检查其透明度再使用。</li>
</ol>
4. 在基因框架载玻片中取样荧光微球或孢子10（用时 15 分钟）
<ol>
	<li>将两片经70%乙醇清洗并风干的载玻片（见材料表）置于70 °C加热块上预热数秒，取65 μL灭菌的、保持在70 °C的2%琼脂糖溶液滴加于其中一片载玻片上，然后将另一片载玻片盖在上面，使琼脂糖均匀铺展于两片玻片之间。琼脂糖块约在5分钟内干燥。</li>
	<li>取下其中一片载玻片后，将琼脂糖块切割成1 × 1 cm的区域，加入0.4 μL样品（浓度约为108/mL的荧光微球或孢子），然后将盖玻片覆盖在琼脂糖块上并轻轻滑动，将琼脂糖块转移至高精度盖玻片上。</li>
	<li>将Gene Frame（1.5 × 1.6 cm2，65 µL）固定在已干燥的载玻片上，再将带有琼脂糖块的盖玻片放置于其上，确保完全覆盖框架的各个角落，从而完成用于显微镜观察的载玻片制备。</li>
</ol>
5. 成像11,17（时间：1 小时）
<ol>
	<li>在配备100倍油镜（数值孔径 = 1.49）、CCD相机和图像分析软件（见材料表）的结构照明显微镜上，采集孢子以及红、黄绿色羧基修饰荧光微球混合物的透射光和荧光图像（见材料表）。所有图像均在室温下采集，避免环境光干扰。成像前务必使用75%乙醇清洁100倍物镜和载玻片。</li>
	<li>聚焦于100 nm（直径）的荧光微球，并通过调节100倍物镜上的校正环优化点扩散函数（psf），直至获得对称的psf，从而最大限度减少图像模糊。点扩散函数（psf）是指成像系统对点光源或点状物体的响应，即系统的脉冲响应。</li>
	<li>选择一个包含约10个圆形荧光微球的视野。以561 nm和488 nm激发波长分别进行光栅聚焦调节，作为图像分析软件的引导参数。</li>
	<li>使用透射光对孢子进行聚焦，并以16×平均模式采集透射光图像，每幅图像曝光时间为200 ms。</li>
	<li>以“3D-SIM”照明模式采集孢子的3D-SIM原始荧光图像，相机设置为电子倍增（EM）增益读出模式，10 MHz，14位，EM增益设为175。使用561 nm激光（激光功率20%）激发PS4150孢子中的FM4-64探针，照射时间为400 ms。</li>
	<li>分别使用561 nm激光（激光功率30%）照射1秒以激发KGB80孢子中的GerKB-mCherry，以及488 nm激光（激光功率60%）照射3秒以激发GerD-GFP。Z轴层扫设置为从顶部到底部模式，步长0.2 µm，用于萌发体分析时采集7步，用于内膜（IM）分析时采集20步。 
	注意：上述激光参数的设定旨在确保直方图窗口的最大亮度值约为4,000。</li>
</ol>
6. 重建FM4-64染色的PS4150孢子的3D-SIM原始图像
<ol>
	<li>对FM4-64染色的PS4150孢子原始数据执行N-SIM切片重建。在N-SIM面板选项卡中点击Reconstruct Slice的Param按钮，以打开N-SIM切片重建窗口。</li>
	<li>在N-SIM切片重建窗口中设置重建参数。为获得理想的重建图像，请参照N-SIM仪器说明书的建议，在N-SIM切片重建窗口中点击相应控件，将照明调制对比度（IMC）设为自动，高分辨率噪声抑制（HRNS）设为1.00，离焦模糊抑制（OFBS）设为0.05，作为初始参数。</li>
	<li>在N-SIM切片重建窗口中点击Reconstruct Slice按钮以重建图像。通过重建后显示的快速傅里叶变换（FFT）图像和重建评分来评估重建图像的质量12。</li>
	<li>在N-SIM切片重建窗口中点击相应控件，将HRNS从0.10调节至5.00，OFBS从0.01调节至0.50，直至获得最佳参数设置。</li>
	<li>在N-SIM切片重建窗口中点击Apply按钮，以应用修改后的参数。点击Close按钮关闭窗口。</li>
	<li>激活FM4-64染色的PS4150孢子原始图像，然后在N-SIM Pad选项卡中点击Reconstruct Slice按钮，执行切片重建。保存重建后的图像。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>将KGB80萌发体的伪宽场图像进行转换
	<ol>
		<li>通过左键单击ImageJ插件SIMcheck中的Raw Data SI to Pseudo-Widefield功能12，将KGB80的3D-SIM原始图像转换为伪宽场图像。SIMcheck插件会从原始SIM数据中对图像进行平均处理，并生成一幅与传统宽场照明等效的图像，以便进行比较12。ImageJ软件相关信息请访问 https://imagej.net/Welcome。在每张倒置透射图像中随机选取约25个芽孢，用于后续在荧光伪宽场图像中对萌发体进行分析。</li>
		<li>从两张载玻片的14个视野中总共选取约350个（本示例中为346个）KGB80芽孢。两名研究人员应独立计数所选KGB80芽孢中GerD-GFP和GerKB-mCherry荧光焦点的数量。当对芽孢中是否存在独立的荧光萌发体焦点存在疑问时，研究人员可回溯查看3D-SIM原始图像以作判断。</li>
		<li>使用ImageJ分析每个GerD-GFP和GerKB-mCherry焦点的最大强度，以及每个KGB80芽孢三维图像的积分强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析KGB80萌发体的伪宽场图像
	<ol>
		<li>以7个Z轴层扫描图像的平均积分强度值作为KGB80芽孢的总积分信号强度。采用与实验组完全相同的成像参数对背景对照菌株PS4150进行成像，以确定背景强度水平。当KGB80单个芽孢中的荧光斑点明显区别于背景信号时，即可认定为萌发体焦点。</li>
		<li>使用Origin 9.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）以确定显著性，将P值&#60;0.05视为具有统计学显著性。采用Spearman等级相关系数18评估GerD-GFP与GerKB-mCherry焦点数量之间的相关性，以及积分信号强度测量值之间的相关性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li>
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<li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li>
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<li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores%3B+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972(2013).</li>
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<li>Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388(2018).</li>
<li>Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li>
<li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22One-Pot%22+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169(2018).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

&#160;本方案包含用于分析经 FM4-64 染色的 B. subtilis 孢子的标准 3D-SIM 流程，涵盖孢子形成、载玻片制备及成像过程。此外，本方案还描述了一种经 SIMcheck（ImageJ）辅助的改良 3D 成像流程，用于对带有荧光报告蛋白标记的 B. subtilis 孢子萌发体进行 SIM 显微成像。后一方法使我们能够以增强的对比度观察这一微弱的亚结构。通过结合两种成像方法，可在同一台 SIM 显微镜下对同一孢子中的不同亚结构进行可视化，从而增强我们对萌发机制的理解基础。需注意，该方法的横向分辨率为 ~100 nm，轴向分辨率为 ~200–250 nm，优于 Griffith7 所采用的微分干涉差（DIC）宽场显微成像方法。在萌发启动后对萌发体出现过程进行时间分辨分析将是下一步理想的研究方向。然而，尽管 SIM 显微镜原则上适用于活细胞成像，但由于萌发体信号较弱，在图像采集过程中样品会迅速发生漂白，因此目前尚无法实现此类时间分辨的 SIM 分析。为获得足够数量的孢子用于分析，必须确保孢子形成过程高效进行。研究人员需严格检测孢子形成效...

芽孢杆菌目（Bacillales）和梭菌目（Clostridiales）的孢子处于代谢静止状态，对严苛的去污处理具有极强的抗性，但除非其发生萌发，否则不会对人类造成有害影响1。在营养型萌发剂诱导的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）孢子萌发过程中，起始事件是萌发剂与其位于孢子内膜（IM）上的萌发剂受体（GRs）结合。随后，这些受体将信号传递给同样位于内膜的 SpoVA 通道蛋白。这导致通过 SpoVA 通道启动孢子核心中吡啶-2,6-二羧酸（吡啶二羧酸；DPA；占孢子核心干重的20%）与水的交换。随后，DPA 的释放触发皮层肽聚糖的水解活化，并进一步吸收水分2,3,4。这些事件导致外壳层受到机械应力，进而破裂，启动萌发生长，最终进入营养生长阶段。然而，孢子萌发过程的精确分子机制仍远未阐明。
关于孢子萌发的一个重要问题是围绕内膜（IM）萌发蛋白以及IM上的SpoVA通道蛋白的脂质的生物物理特性。这种主要处于静止状态的内膜脂双层是许多小分子（包括有毒化学防腐剂）的主要通透性屏障，其中一些物质的作用位点位于孢子核心或营养细胞的细胞质中5,6。内膜脂双层可能处于凝胶态，尽管内膜中仍存在相当比例的可移动脂质5。孢子的内膜还具有显著的扩张潜力5。因此，在萌发过程中，内膜的表面积在不合成新膜的情况下增加1.6倍，同时伴随该膜特有的低通透性和脂质不动性的丧失5,6。
尽管孢子中萌发蛋白的激活机制以及内膜脂质的组织结构在分子层面的细节是颇具吸引力的研究课题，但由于孢子体积微小， B. subtilis 孢子以及萌发相关蛋白的相对丰度较低，给显微镜分析带来了挑战。Griffiths 等人利用与萌发蛋白融合的荧光报告分子，提供了有力的落射荧光显微镜证据，表明在 B. subtilis 孢子中，支架蛋白GerD将GerA、B和K三种芽孢萌发受体（GR）的三个亚基（A、B和C）组织成簇7他们将这种萌发相关蛋白的聚集体称为“萌发体”（germinosome），并描述其结构为大小约300 nm的内膜蛋白焦点8孢子萌发启动后，荧光萌发体焦点最终转变为更大且弥散的荧光模式，伴随 &#62;75% 的孢子群体在用 L-缬氨酸萌发 1 小时后表现出该模式8请注意，上述论文使用了数十张连续荧光图像的平均图像，以增强统计效力并克服成像过程中观察到的荧光信号较弱的问题。利用经典显微技术对细菌芽孢中这些结构进行可视化已接近技术可行性的极限，该方法无法对单个芽孢中焦点的数量进行评估，也无法实现更精确的亚细胞定位。
本文展示了如何利用结构照明显微镜（Structured Illumination Microscopy, SIM）对枯草芽孢杆菌（B. subtilis）孢子中的萌发体（germinosome）及其内膜（IM）脂质结构域进行高分辨率成像与定量分析9。本实验方案还包括芽孢形成、载玻片制备以及利用SIMcheck（v1.0，ImageJ插件）和ImageJ进行图像分析的详细操作步骤10,11,12。

<table><tbody><tr><td>空气干燥的载玻片</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>630-2870</td><td></td></tr><tr><td>APO TIRF N20R8 100&amp;times;油镜物镜（NA=1.49）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;B. subtilis&lt;/em&gt; KGB80 (PS4150 &lt;em&gt;gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;B. subtilis &lt;/em&gt;PS4150 (PS832&lt;em&gt; &amp;Delta;gerE::spc, &amp;Delta;cotE::tet&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L 锥形瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z567868</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 锥形瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z723088</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 羧基修饰微球</td><td>Invitrogen, 0.1 &amp;mu;m</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz 非离子密度梯度介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/Welcome</td></tr><tr><td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD 相机</td><td>Andor Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3451PK</td><td></td></tr><tr><td>显微镜成像软件</td><td>Nikon, Japan</td><td>NIS-Element AR 4.51.01</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 超纯去离子水</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q IQ 7003</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti 显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>180 mL 聚丙烯螺口瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003800</td><td></td></tr><tr><td>精密盖玻片</td><td>Paul Marienfeld</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆底管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr><tr><td>50 mL 螺口管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr></tbody></table>

萌发体与内膜的可视化 枯草芽孢杆菌 孢子

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

孢子体积微小且萌发相关蛋白相对丰度较低，导致使用落射荧光显微镜对其进行显微分析存在困难。超分辨率三维结构光照明显微镜（3D-SIM）是一种有望克服该难题的工具，可揭示孢子萌发过程的分子细节。 枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) 孢子。本文描述了一种改良的SIMcheck（ImageJ）辅助三维成像流程，并结合荧光报告蛋白用于SIM显微镜观察 B. subtilis 孢子的萌发体，即萌发相关蛋白的簇状聚集体。我们还介绍了一种用于FM4-64染色的（标准）三维结构光照明显微成像（3D-SIM）操作流程。 B. subtilis 孢子膜。通过使用这些方法，我们获得了无与伦比的萌发体定位分辨率，并证明 &#62;80% B. subtilis 在定义的最小MOPS培养基上形成芽孢后获得的KGB80休眠芽孢中，存在一个或两个GerD-GFP和GerKB-mCherry焦点。在FM4-64染色芽孢的3D-SIM图像中也观察到明亮的焦点，提示内膜可能存在不同流动性的脂质结构域。进一步研究可采用膜染料与萌发体报告蛋白的双标记方法，以评估共定位情况，从而全面了解萌发体的组织结构。 芽孢杆菌属 内孢子膜中的萌发相关蛋白是可能的。

本方案介绍了一种用于细菌孢子的SIM显微镜成像流程。在成像前，孢子形成及载玻片制备步骤按照图1所示进行。随后，对弱荧光（荧光蛋白标记的萌发蛋白）和强荧光（脂溶性探针染色的内膜）孢子样本分别实施成像与分析，如下文所述。
定位萌发体在 B. subtilis 孢子
据Western blot分析，使用丰富孢子形成培养基制备的孢子中，GerD和GerKB的含量分别约为每孢子3,500个和700个分子19。KGB80菌株中的gerD-gfp和gerKB-mCherry基因均受其天然启动子调控。由于融合蛋白的相对丰度较低，成像时荧光信号较弱，导致SI...

Bacillus subtilis 芽孢的萌发受体蛋白在内膜中聚集形成“萌发体”。本文介绍了一种利用超分辨率显微镜和荧光报告蛋白来可视化萌发体的实验方案。该方案还可鉴定出优先被膜染料 FM4-64 染色的芽孢内膜结构域。

孢子体积微小且萌发相关蛋白的相对丰度较低，导致在使用落射荧光显微镜进行观察时面临困难……

超分辨率结构光照明显微技术（3D-SIM）是一种用于可视化孢子膜中萌发受体簇荧光报告蛋白的创新技术。通过这些操作步骤，可实现对萌发体定位及孢子内膜脂质结构域前所未有的高分辨率成像。本技术将由本实验室的博士研究生 Juan Wen 和理学硕士研究生 Raymond Pasman 演示。开始实验前，将高精度盖玻片置于1 M盐酸中，在轻微振荡的水浴中清洗30分钟，随后用超纯一级水洗涤两次，每次5分钟。第二次水洗后，将盖玻片放入100%乙醇中约3分钟，然后干燥并检查其透明度。接着，用70%乙醇清洁玻璃载玻片1分钟，待载玻片干燥后检查其透明度。进行荧光微球和孢子成像时，首先将两张载玻片置于70摄氏度的加热块上预热数秒，然后在其中一张载玻片上加入65微升70摄氏度的灭菌2%琼脂糖液滴。将另一张载玻片盖在上面，使琼脂糖在两张载玻片之间铺展。五分钟后，取下其中一张载玻片，并将干燥的琼脂糖切成1厘米×1厘米的区域。在 0.4 微升无菌超纯一级水中加入 1×10⁸ 个荧光微球或孢子，加入琼脂糖中，然后将高精度盖玻片置于样品区域上，通过盖玻片将样品区域从载玻片转移至盖玻片表面。接着，将一个 65 微升、1.5 厘米×1.6 厘米的 Gene Frame 固定在干燥的载玻片上，再将盖玻片放置于框架上，确保框架的各个角落完全闭合。进行样品成像时，将载玻片置于配备 100 倍油镜的结构照明显微镜上，并聚焦于 100 纳米荧光微球。调节100倍物镜上的校正环，直至获得对称的点扩散函数，以最大限度减少图像模糊，并选择一个包含约10个圆形荧光微球的视野。针对指定的激发波长（本例中为561纳米和488纳米）应用光栅聚焦校正，作为图像分析软件的参考，然后使用透射光对孢子进行聚焦。以16次平均模式采集透射光图像，每次图像曝光时间为20毫秒。然后，使用3D-SIM照明模式，通过三维结构照明显微镜采集孢子的原始荧光图像。进行切片重建时，单击结构化照明面板选项卡上的“Param”按钮，打开N-SIM切片重建窗口。根据提示的操作说明，单击相应的控制选项，将照明调制对比度设为自动，高分辨率噪声抑制设为1，离焦模糊抑制设为0.05，作为初始参数。然后，单击“重建切片”以重建图像，并通过重建后显示的快速傅里叶变换图像和重建评分来评估重建图像的质量。将高分辨率噪声参数从 0.1 调整至 5，离焦模糊抑制参数从 0.01 调整至 0.5，直至获得最佳参数设置。随后，单击“应用”以保存更改。单击“关闭”以关闭窗口。打开FM4-64染色的PS4150孢子原始图像，然后单击“重建切片”以执行切片重建，并保存重建后的图像。为了将KGB80 geminosome的3D-SIM原始图像转换为伪宽场图像，左键单击ImageJ SIMcheck插件，选择Raw Data SI和Pseudo Widefield。在每张倒置透射图像中随机选择约25个孢子，用于后续在荧光伪宽场图像中进行germinosome分析，直至总共选择约350个孢子。然后，使用ImageJ评估每组孢子表达的每个荧光信号的最大强度，以及每个3D孢子图像的积分强度。为了分析KGB80萌发体的伪宽场图像，使用七个图像层的平均整合强度值作为KGB80孢子的整合信号强度。然后，在相同成像条件下对PS4150背景菌株进行成像以确定背景强度，当KGB80单个孢子中的荧光点明显区别于背景时，将其视为萌发体焦点。在此代表性实验中，GerD-GFP荧光孢子的两个焦点出现在不同的层中，而在合并的Z3层中共观察到三个GerD-GFP焦点。此处观察到一个孢子中仅有一个 GerD-GFP 聚焦点。总体而言，约有 40% 至 50% 的孢子分别含有两个或一个 GerD-GFP 和 GerKB-mCherry 聚簇。尽管不同群体间 GerD-GFP 支架蛋白的积分强度存在差异，但 GerKB-mCherry 的积分强度在不同群体中基本相同。当孢子具有多个焦点时，GerD-GFP 和 GerKB-mCherry 焦点的最大荧光强度 tends to 减小，且所有亮斑的最大荧光强度（视为萌发体焦点）高于 PS4150 孢子的最大自发荧光。值得注意的是，在完整和去壳的 PS4150 孢子中均出现类似萌发体焦点的较亮 FM4-64 斑点，提示这些较亮的 FM4-64 斑点可能参与了内膜中萌发体蛋白的聚集。将孢子加入琼脂糖并将琼脂糖置入框架时，需对这些微量材料进行持续而谨慎的液体操作。将KGB80萌发体的3D-SIM原始图像转换为伪宽场图像并对其进行解释，需要具备芽孢生物学方面的专业知识。我们的结构照明显微成像方法可应用于不同细菌或其他带状材料中低丰度蛋白或弱荧光报告分子的成像。现在可利用双标记方法研究萌发体的结构，以评估芽孢杆菌萌发相关蛋白与特定膜结构域之间的共定位情况。

visualization-germinosomes-inner-membrane-bacillus-subtilis

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

枯草芽孢杆菌中细菌体和内膜的可视化

本方案提供了一种利用自动荧光延时显微镜随时间监测不同细菌单细胞行为的逐步操作流程。此外，我们还提供了显微镜图像分析的指导方法。...

活细胞成像 枯草芽孢杆菌 和 肺炎链球菌 使用自动延时显微镜技术

来源： Figueroa, D. M., et al. 抗菌肽定位表征中细菌球状体与原生质体的制备与可视化。J. Vis. Exp. (2018)本视频演示了从革兰氏阳性菌Bacillus...

从革兰氏阳性菌 Bacillus megaterium 制备原生质体

来源： 文，J.，帕斯曼， 等人， 芽孢体及内膜的可视化 枯草芽孢杆菌 孢子。 视频实验杂志...

细菌芽孢内膜中萌发蛋白的可视化

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检测细菌芽孢萌发过程中的皮层碎片

本方案阐述了评估监测活力参数和DNA修复过程在利用低气压等离子体处理后复苏Bacillus...

研究低压等离子体灭菌对存活率的不利影响 枯草芽孢杆菌 使用活细胞显微镜观察孢子

单细胞微流控分析 Bacillus subtilis

细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，旨在解析调控大型大分子机器功能的静态与动态过程。本文通过整合定量活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术，用于研究Legionella pneumophila...

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

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研究微孢子虫感染的 Caenorhabditis elegans 模型中的遗传免疫

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Bacillus subtilis 芽孢在流式细胞术中计数与标记分析的改进

本文详细介绍了在完整分离的Langendorff灌注小鼠心脏中进行跨膜电位（Vm）和细胞内钙瞬变（CaT）光学标测时的解剖操作、仪器设置及实验条件。...

小鼠心脏动作电位与钙瞬变的光学标测

学习使用超分辨率结构光照明显微镜（3D-SIM）技术可视化枯草芽孢杆菌孢子中的萌发受体蛋白簇和内膜脂质结构域。该方法可实现对细菌体和内膜的高分辨率成像。

萌发体与内膜的可视化枯草芽孢杆菌孢子

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