萌发体与内膜的可视化 枯草芽孢杆菌 孢子

超分辨率结构光照明显微技术（3D-SIM）是一种用于可视化孢子膜中萌发受体簇荧光报告蛋白的创新技术。通过这些操作步骤，可实现对萌发体定位及孢子内膜脂质结构域前所未有的高分辨率成像。本技术将由本实验室的博士研究生 Juan Wen 和理学硕士研究生 Raymond Pasman 演示。

开始实验前，将高精度盖玻片置于1 M盐酸中，在轻微振荡的水浴中清洗30分钟，随后用超纯一级水洗涤两次，每次5分钟。第二次水洗后，将盖玻片放入100%乙醇中约3分钟，然后干燥并检查其透明度。接着，用70%乙醇清洁玻璃载玻片1分钟，待载玻片干燥后检查其透明度。

进行荧光微球和孢子成像时，首先将两张载玻片置于70摄氏度的加热块上预热数秒，然后在其中一张载玻片上加入65微升70摄氏度的灭菌2%琼脂糖液滴。将另一张载玻片盖在上面，使琼脂糖在两张载玻片之间铺展。五分钟后，取下其中一张载玻片，并将干燥的琼脂糖切成1厘米×1厘米的区域。

在 0.4 微升无菌超纯一级水中加入 1×10⁸ 个荧光微球或孢子，加入琼脂糖中，然后将高精度盖玻片置于样品区域上，通过盖玻片将样品区域从载玻片转移至盖玻片表面。接着，将一个 65 微升、1.5 厘米×1.6 厘米的 Gene Frame 固定在干燥的载玻片上，再将盖玻片放置于框架上，确保框架的各个角落完全闭合。进行样品成像时，将载玻片置于配备 100 倍油镜的结构照明显微镜上，并聚焦于 100 纳米荧光微球。

调节100倍物镜上的校正环，直至获得对称的点扩散函数，以最大限度减少图像模糊，并选择一个包含约10个圆形荧光微球的视野。针对指定的激发波长（本例中为561纳米和488纳米）应用光栅聚焦校正，作为图像分析软件的参考，然后使用透射光对孢子进行聚焦。以16次平均模式采集透射光图像，每次图像曝光时间为20毫秒。

然后，使用3D-SIM照明模式，通过三维结构照明显微镜采集孢子的原始荧光图像。进行切片重建时，单击结构化照明面板选项卡上的“Param”按钮，打开N-SIM切片重建窗口。根据提示的操作说明，单击相应的控制选项，将照明调制对比度设为自动，高分辨率噪声抑制设为1，离焦模糊抑制设为0.05，作为初始参数。

然后，单击“重建切片”以重建图像，并通过重建后显示的快速傅里叶变换图像和重建评分来评估重建图像的质量。将高分辨率噪声参数从 0.1 调整至 5，离焦模糊抑制参数从 0.01 调整至 0.5，直至获得最佳参数设置。随后，单击“应用”以保存更改。

单击“关闭”以关闭窗口。打开FM4-64染色的PS4150孢子原始图像，然后单击“重建切片”以执行切片重建，并保存重建后的图像。

为了将KGB80 geminosome的3D-SIM原始图像转换为伪宽场图像，左键单击ImageJ SIMcheck插件，选择Raw Data SI和Pseudo Widefield。在每张倒置透射图像中随机选择约25个孢子，用于后续在荧光伪宽场图像中进行germinosome分析，直至总共选择约350个孢子。然后，使用ImageJ评估每组孢子表达的每个荧光信号的最大强度，以及每个3D孢子图像的积分强度。

为了分析KGB80萌发体的伪宽场图像，使用七个图像层的平均整合强度值作为KGB80孢子的整合信号强度。然后，在相同成像条件下对PS4150背景菌株进行成像以确定背景强度，当KGB80单个孢子中的荧光点明显区别于背景时，将其视为萌发体焦点。在此代表性实验中，GerD-GFP荧光孢子的两个焦点出现在不同的层中，而在合并的Z3层中共观察到三个GerD-GFP焦点。

此处观察到一个孢子中仅有一个 GerD-GFP 聚焦点。总体而言，约有 40% 至 50% 的孢子分别含有两个或一个 GerD-GFP 和 GerKB-mCherry 聚簇。尽管不同群体间 GerD-GFP 支架蛋白的积分强度存在差异，但 GerKB-mCherry 的积分强度在不同群体中基本相同。

当孢子具有多个焦点时，GerD-GFP 和 GerKB-mCherry 焦点的最大荧光强度 tends to 减小，且所有亮斑的最大荧光强度（视为萌发体焦点）高于 PS4150 孢子的最大自发荧光。值得注意的是，在完整和去壳的 PS4150 孢子中均出现类似萌发体焦点的较亮 FM4-64 斑点，提示这些较亮的 FM4-64 斑点可能参与了内膜中萌发体蛋白的聚集。将孢子加入琼脂糖并将琼脂糖置入框架时，需对这些微量材料进行持续而谨慎的液体操作。

将KGB80萌发体的3D-SIM原始图像转换为伪宽场图像并对其进行解释，需要具备芽孢生物学方面的专业知识。我们的结构照明显微成像方法可应用于不同细菌或其他带状材料中低丰度蛋白或弱荧光报告分子的成像。现在可利用双标记方法研究萌发体的结构，以评估芽孢杆菌萌发相关蛋白与特定膜结构域之间的共定位情况。