离子交换色谱 (IEX) 与多角度光散射 (ALS) 相结合, 用于蛋白质分离和表征

该协议介绍了离子交换MAL，一种蛋白质质量控制和表征、质量控制的新方法，对于生命科学研究和药物产品开发成果的一致性和完整性至关重要。离子交换 MALS 确定蛋白质纯度、寡聚状态、同质性、身份、构象、结构、翻译后修改等特性。测量是无损的，是在近生理缓冲条件下进行溶液测量的。

这种方法准确地确定蛋白质或肽的摩尔质量、寡聚状态和结合程度，例如糖蛋白。它也可用于膜蛋白。IEX 通过表面电荷分离大分子。

Anion 交换、AIEX 和阳离子交换、CIEX 矩阵分别负和正充电变体绑定。IEX-MALS 在具有相对接近质量或形状的蛋白质群体之间进行精细分离，成功地确定了混合物样品中每种蛋白质状态的摩尔质量。首先，使用 0.1 微米过滤器过滤所有试剂，包括洗涤和洗涤缓冲液。

将前 50 至 100 毫升缓冲液过滤到废瓶中，以消除干过滤器中的颗粒。在经过过滤水彻底清洗并封盖的清洁无菌瓶中，过滤缓冲液的剩余部分。使用 pH-8 Tris 缓冲液和 50 毫摩尔氯化钠，将 BSA 样品稀释至每毫升 6 毫克，使 pH 和离子强度允许与离子交换柱结合。

使用注射器将至少 0.3 至 0.5 毫克 BSA 注射到一毫升柱中，以实现高质量的 MALS 分析。要启动离子交换 MALS 实验，请在 MALS 软件中打开 New，从方法中进行实验，然后从光散射系统方法文件夹中选择联机方法。如果 DLS 模块可用且要获取 DLS 数据，则从光散射（使用 QELS 子文件夹）中选择联机方法。

要设置参数，请根据"配置"部分，首先将通用泵部分中运行的流速设置为 FPLC 中使用的流速为每分钟 1.5 毫升。在"溶剂"部分下，输入或验证缓冲参数。在"喷油器"部分下，将蛋白质名称输入为 BSA，折射率增量为每克 0.185 毫升，波长为 280 纳米的 UV 消光系数为每克 0.66 升/厘米。

在"样品"选项卡中，输入蛋白质样本的浓度为每毫升6毫克，然后将注射的样本量也插入为170微升。在"过程"部分下，在"基本集合"选项卡中，选择"自动注入时触发"复选框，并将运行持续时间设置为 70 毫升，以便数据收集在梯度达到其最终值后至少持续五分钟。然后，在 FPLC 软件中，在方法编辑器选项卡中创建新的实验。

对于初始实验，创建盐或 pH 的线性梯度，而对于优化方法，根据手稿创建更具体的梯度或逐步程序。在将触发 MALS 软件中数据收集的方法中包括脉冲信号。然后，打开泵阀，用0.5摩尔氢氧化钠清洗，去除强约束的杂质，然后洗一个中和缓冲液。

然后，用Tris缓冲pH8清洗柱，用洗涤缓冲器清洗气柱，用洗涤缓冲器清洗B阀。使用盐浓度低的洗涤液液作为最后洗涤液冲洗柱，使蛋白质与柱基质结合。在样品注射之前，洗涤后和洗脱结束时，必须稳定光散射基线，以确保低噪音和完全纯稀释。

使用注射器，将蛋白质样本放在循环中。首先在 MALS 软件中开始实验，单击"运行"按钮，然后在 FPLC 软件中启动实验。通过 MALS 探测器从 FPLC 仪器接收脉冲信号后将收集数据。

如果使用连续流模式而不是独立方法手动执行离子交换 MALS，则应用与前面描述的相同的运行参数和指令。验证并运行最终方法后，使用空白注入执行完全相同的方法，方法是加载缓冲区而不是示例。自动注入脉冲和空白运行的渐变之间的时间与样本运行的时序相同，这一点很重要。

要开始分析，在 MALS 软件中的"过程"部分下，请使用"除皮"选项卡和"正常"级别平滑色谱图。如果他们表现出很多噪音，将级别设置为"重"。在基线视图中，定义所有信号的基线，包括 LS、UV 和 RI 检测器。

在"峰值"视图中，定义分析的峰值。验证每个峰下蛋白质的 RI 增量值 dn/dc 和 UV 消光系数的正确值。在"摩尔质量"和"光散射半径"视图中，使用 Zimm 模型分析摩尔质量和半径，并拟合零度。

如果 QELS 可用，则在 QUELS 视图的 Rh 下，观察 Rh 值和关联函数的拟合质量。由于盐浓度的增加，RI信号在离子交换 MALS 运行期间发生显著变化。要从空白注射中减去基线信号，请同时打开蛋白质和空白离子交换 MALS 实验。

右键单击蛋白质实验名称，选择"应用方法"，然后从文件对话框中选择基线减法文件夹。选择标准摩尔质量分析的联机方法。在"基线减法"视图下，单击"导入空白"以导入空白运行的信号。

在"仪器"下，检查所有探测器以减去。要使用 BSA 单体校准离子交换 MALS 系统，在"过程"和"配置"视图中，对齐峰值。在"规范化"视图中，输入 3.0 纳米作为 Rg 值以执行规范化。

然后，在同一配置选项卡中的"带宽"下，选择峰值并使用"执行拟合"按钮将 UV 和 LS 信号与 RI 信号匹配。结果图表显示在"结果拟合"视图中。通过右键单击图形、选择"编辑"，然后单击"高级"按钮来更改轴比例和其他图形参数。

要拥有更多显示选项，请选择"EASI 图形"选项卡，并在"显示"下拉菜单中的窗口顶部选择摩尔质量或 Rh Q.所有结果，包括摩尔质量、半径、纯度级别等，可在"结果"部分下的"报表"视图中提供。使用"报表设计器"按钮向报表添加更多结果或参数以及数字。本实验中，使用离子交换分析列对离子交换 MALS 进行了 BSA 分析。

色谱图以 280 纳米显示 UV，以 90 度角显示光散射、折射率和电导率曲线以及每个峰的摩尔质量。由 30 列卷组成的宽线性梯度，从 75 毫摩尔到 350 毫摩尔氯化钠将 BSA 单体从二氧化硅和较高寡聚物中分离。下游 MALS 分析结果计算出单体摩尔质量为 66.8 千度，计算出的二丁摩尔质量为 130 千度。

基于洗坡时的缓冲电导率，梯度更改为不同的程序，即175毫米氯化钠的长步，然后是从175毫升到500毫升氯化钠的线性梯度。新的梯度大大提高了分辨率，在BSA单体和较高寡聚物种之间产生了极好的分离。采用200毫摩尔和250毫摩尔氯化钠的逐步方案，也专注于高寡聚物种。

它导致 BSA 单体、二丁体和修剪器之间的极佳分离。按照此过程，可以在通过离子交换分隔的每个变体上执行质谱法、SDS-PAGE 活性和稳定性测试等方法，以识别和进一步描述每个变体。我们发现，离子交换 MALS 将 MALS 分析的功率扩展到 SEC-MALS 无法完全分析的样品。

按电荷分离解决在 SEC 中具有共同性的不同物种。