离子交换色谱（IEX）与多角度光散射（MALS）联用技术用于蛋白质分离与表征

本方案介绍了离子交换多角度激光散射法（ion-exchange MALs），这是一种用于蛋白质质量控制与表征的新方法，而质量控制对于生命科学研究和药品开发中结果的一致性和完整性至关重要。离子交换MALS可测定蛋白质纯度、寡聚状态、均一性、身份、构象、结构、翻译后修饰及其他性质。该检测方法具有非破坏性，可在接近生理条件的缓冲溶液中进行。

该方法可准确测定蛋白质或肽的摩尔质量、寡聚状态以及偶联程度（例如糖蛋白）。该方法也可应用于膜蛋白。离子交换色谱（IEX）根据大分子表面电荷的差异进行分离。

阴离子交换（AIEX）和阳离子交换（CIEX）介质分别结合带负电荷和正电荷的变体。离子交换-多角度激光散射（IEX-MALS）能够在质量或形状相近的蛋白质群体之间实现精细分离，成功测定混合样品中每种独立蛋白质状态的摩尔质量。实验开始时，使用0.1微米滤膜过滤所有试剂，包括洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。

将最初50至100毫升的缓冲液过滤至废液瓶中，以去除干滤器中的颗粒物。将剩余缓冲液过滤至一个洁净无菌的瓶子中，该瓶子需先用过滤水彻底清洗，并加盖以防止灰尘进入。使用pH为8的Tris缓冲液和50毫摩尔的氯化钠，将牛血清白蛋白（BSA）样品稀释至6毫克/毫升，使pH值和离子强度适合与离子交换柱结合。

使用注射器将至少 0.3 至 0.5 毫克的 BSA 注入一毫升柱中，以获得高质量的 MALS 分析结果。要开始离子交换 MALS 实验，请在 MALS 软件中打开“方法”下的“新建实验”，然后从光散射系统方法文件夹中选择在线方法。如果 DLS 模块可用且需要采集 DLS 数据，请从光散射“含 QELS”子文件夹中选择在线方法。

在“配置”部分中设置参数时，首先在“通用泵”部分将运行流速设置为FPLC中使用的流速，即1.5毫升每分钟。在“溶剂”部分输入或核对缓冲液参数。在“进样器”部分，输入蛋白质名称为BSA，折射率增量为0.185毫升每克，以及在280纳米波长处的紫外消光系数为0.66升每克每厘米。

在“样品”选项卡中，输入蛋白样品的浓度为 6 毫克/毫升，同时输入进样体积为 170 微升。在“操作步骤”部分的“基本收集”选项卡中，选中“自动进样触发”复选框，并将运行时间设置为 70 毫升，以确保在梯度达到最终值后数据采集至少持续五分钟。然后，在 FPLC 软件的“方法编辑器”选项卡中创建一个新的实验。

对于初始实验，创建盐浓度或pH的线性梯度；而对于优化后的方法，则根据论文建立更特异的梯度或阶梯式程序。在方法中加入一个脉冲信号，以触发MALS软件中的数据采集。然后打开泵阀，用0.5摩尔的氢氧化钠洗涤，以去除强结合的杂质，随后用中和缓冲液洗涤。

然后，用 pH 8 的 Tris 缓冲液洗涤层析柱，A 阀用洗涤缓冲液洗涤，B 阀用洗脱缓冲液洗涤。使用低盐浓度的洗涤缓冲液作为最后一步洗涤，以冲洗层析柱，从而使蛋白质能够结合到层析柱基质上。在上样前、洗涤后以及洗脱结束时，必须使光散射基线稳定，以确保低噪声和完全纯净的稀释环境。

使用注射器将蛋白样品加入进样环中。首先在MALS软件中点击“运行”按钮启动实验，然后在FPLC软件中启动。当MALS检测器接收到FPLC仪器发出的脉冲信号后，即开始采集数据。

如果离子交换 MALS 采用连续流动模式手动进行，而非使用独立方法，则应用与之前所述相同的运行参数和操作步骤。在最终方法验证并运行后，使用空白进样进行完全相同的方法操作，即用平衡缓冲液代替样品。空白运行中自动进样脉冲与梯度洗脱之间的时间间隔必须与样品运行完全一致。

开始分析时，在 MALS 软件的“操作步骤”部分，使用“去尖峰”选项卡中的“正常”级别来平滑色谱图。如果色谱图噪声较多，可将级别设置为“重度”。在“基线”视图中，为所有信号（包括光散射、紫外和示差折光检测器）定义基线。

在“峰”视图中，定义用于分析的峰。验证每个峰下蛋白质的折射率增量（dn/dc）值和紫外消光系数的正确性。在“光散射法测定摩尔质量与半径”视图下，使用Zimm模型并以零阶拟合来分析摩尔质量和半径。

如果可使用 QELS，在 QUELS 的 Rh 视图下观察 Rh 值及相关函数的拟合质量。由于盐浓度升高，离子交换 MALS 运行过程中 RI 信号会发生显著变化。为了从空白进样中扣除基线信号，请同时打开蛋白质和空白样品的离子交换 MALS 实验。

右键单击蛋白质实验名称，选择“应用方法”，然后在文件对话框中选择“基线扣除”文件夹。选择用于标准摩尔质量分析的在线方法。在“基线扣除”视图下，单击“导入空白”以导入空白运行的信号。

在“仪器”部分，勾选所有需要减去的检测器。为了使用 BSA 单体校准离子交换 MALS 系统，在“程序和配置”视图下对齐峰。在“归一化”视图下，输入 3.0 纳米作为 Rg 值以执行归一化。

然后，在同一“配置”选项卡中的“谱带展宽”部分，选择峰形并使用“执行拟合”按钮，将紫外光（UV）和光散射（LS）信号与示差（RI）信号进行匹配。结果图显示在“结果拟合”视图中。通过右键单击图表，选择“编辑”，然后点击“高级”按钮，可更改坐标轴比例尺和其他图表参数。

为了获得更多显示选项，请选择 EASI Graph 选项卡，然后在窗口顶部的 Display 下拉菜单中选择 Molar Mass 或 Rh Q。所有结果，包括摩尔质量、半径、纯度水平及其他参数，均可在 Results 部分的 Report 视图中查看。使用 Report Designer 按钮可向报告中添加更多结果或参数以及图表。在本实验中，使用阴离子交换分析柱通过离子交换 MALS 对 BSA 进行了分析。

色谱图同时显示了280纳米处的紫外吸收、90度角光散射、折射率以及电导率曲线，并结合各峰的摩尔质量。通过30个柱体积的线性梯度洗脱（氯化钠浓度从75毫摩尔升至350毫摩尔），实现了牛血清白蛋白（BSA）单体与二聚体及更高阶寡聚体的分离。后续的多角度光散射（MALS）分析得出，单体的计算摩尔质量为66.8千道尔顿，二聚体的计算摩尔质量为130千道尔顿。

根据洗脱峰处缓冲液的电导率，将梯度程序更改为另一种方案：先使用175毫摩尔氯化钠进行长时间的等度洗脱，随后采用从175毫摩尔到500毫摩尔氯化钠的线性梯度。新梯度显著提高了分辨率，实现了牛血清白蛋白（BSA）单体与较高寡聚体组分之间的良好分离。为进一步聚焦高寡聚体组分，还应用了200毫摩尔和250毫摩尔氯化钠的阶梯式洗脱程序。

这实现了BSA单体、二聚体和三聚体之间的良好分离。通过此方法，可对经离子交换分离的每种变体进行质谱、SDS-PAGE活性和稳定性测试，以鉴定并进一步表征每一种变体。我们发现，离子交换耦合多角度光散射（MALS）技术将MALS分析的能力扩展到了那些无法通过SEC-MALS进行全面分析的样品。

通过电荷分离可分辨在SEC中共同洗脱的不同物质。