Name: 离子交换色谱 (IEX) 与多角度光散射 (ALS) 相结合, 用于蛋白质分离和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学习离子交换色谱结合多角度光散射技术进行蛋白质分离与表征的方法。该技术可准确测定蛋白质摩尔质量、寡聚状态及翻译后修饰，适用于糖蛋白和膜蛋白分析，为生物制药质量控制提供可靠工具。

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作者感谢希伯来大学沃尔夫森应用结构生物学中心的 Tsafi Danieli 博士提供的建议与合作。作者还感谢以色列雷霍沃特市的 Danyel Biotech 有限公司在本研究中所使用的分析型 FPLC-MALS 系统的建立与技术支持。

1. 系统的准备
<ol>
	<li>安装快速蛋白液相色谱系统（FPLC）以及多角度激光散射（MALS）/折射率（RI）检测器（参见材料表），并根据制造商的说明安装相应的控制、数据采集和分析软件包。</li>
	<li>将 MALS 和 RI 检测器连接在 FPLC 的紫外（UV）和电导率检测器的下游。除非 pH 梯度实验绝对需要，否则应绕过 pH 检测器，以尽量减少 UV 检测器与 MALS 检测器之间的检测器间体积。使用内径为 0.25–0.5 mm 的毛细管将色谱柱与检测器连接，使用内径为 0.75 mm 的毛细管将 RI 检测器的出口连接至废液或组分收集器。</li>
	<li>确保 FPLC 与检测器之间的必要信号连接已建立，包括将 FPLC 检测器的 UV 模拟输出信号连接至 MALS 的辅助输入（Aux input），并通过 I/O 盒将 FPLC 的数字输出信号连接至 MALS 的自动进样输入（Autoinject In）。</li>
</ol>
2. 样品与缓冲液的制备
<ol>
	<li>使用 0.1 µm 滤膜过滤所有试剂，包括洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。将前 50–100 mL 缓冲液滤入废液瓶中，以去除干燥滤膜中的微粒，其余缓冲液保存在已用过滤水彻底清洗并加盖以防止灰尘进入的洁净无菌瓶中。</li>
	<li>调整牛血清白蛋白（BSA）样品的 pH 值和离子强度（例如 pH = 8，50 mM NaCl），使其在稀释、超滤或缓冲液置换过程中能够结合到离子交换（IEX）柱上。 
	注意：建议将蛋白质样品预过滤至不会去除目标物质的最小孔径滤膜（0.02–0.1 µm）。或者，也可将样品在高速（13,000–16,000 × g）下离心 10 分钟，以沉淀较大颗粒。</li>
	<li>准备至少 0.3–0.5 mg 的 BSA（参见材料表），注入 1 mL 柱（5/50 mm），以获得高质量的多角度激光散射（MALS）分析结果。请注意，进样体积无限制。</li>
</ol>
3. 蛋白质离子交换层析方法的选择与开发
<ol>
	<li>根据蛋白质的一级序列计算其等电点（pI），可使用 ExPASy 网站上的 Protparam tool 等在线服务器进行计算15。注意，牛血清白蛋白（BSA）的 pI 为 5.8。</li>
	<li>选择色谱柱类型和缓冲液参数。
	<ol>
		<li>根据缓冲液的 pKa 值及其离子性质，为阴离子交换色谱（AIEX）和阳离子交换色谱（CIEX）选用不同的缓冲液。运行 AIEX 色谱柱时使用阳离子型缓冲液，运行 CIEX 色谱柱时使用带有小反离子的阴离子型缓冲液。本示例中，分析 BSA 时在 AIEX 色谱柱上使用 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8）。</li>
		<li>对于 pI 低于 7 的蛋白质（如 BSA），应选用 AIEX 色谱柱，并使用 pH 值比蛋白质 pI 高至少两个单位的缓冲液；对于 pI 高于 7 的蛋白质，则应选用 CIEX 色谱柱，并使用 pH 值比蛋白质 pI 低至少两个单位的缓冲液。</li>
		<li>根据蛋白质与色谱柱基质之间结合强度优化缓冲液的 pH 值。若蛋白质与色谱柱结合不佳，可选择离 pI 更远的 pH 值。确保所选 pH 条件下蛋白质保持稳定。</li>
		<li>在结合缓冲液和洗涤缓冲液中使用低盐浓度，以促进蛋白质与基质的结合，因为蛋白质的结合依赖于上样样品的离子强度。蛋白质通常需要一定量的盐以维持其稳定性，因此在上样和洗涤步骤中建议使用 50 mM NaCl（或其他替代性盐）。</li>
		<li>洗脱缓冲液中使用最高 0.5 M NaCl 以使蛋白质从色谱柱上解离。 
		&#8203;注意：由于标准型折射率（RI）检测器的测量范围有限，不建议使用更高盐浓度。但若使用高浓度型号检测器，则可耐受高达 2 M NaCl 的盐浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤执行初始方法。
	<ol>
		<li>将 1 mg BSA（6 mg/mL 溶液 170 µL）溶于约 0.5 mL 含 50 mM NaCl 的 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8）中上样。用相同缓冲液洗涤色谱柱 10–15 柱体积（CV），以彻底洗去未结合的分子和颗粒，直至光散射（LS）、紫外（UV）和折射率（RI）信号完全稳定。</li>
		<li>使用含 0.5 M NaCl 的 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8）进行一个短的线性盐梯度洗脱，梯度范围为 20–30 CV。可采用 0%–100%（或其他常用梯度）的洗脱缓冲液梯度，或将其分为两个梯度：先 0%–50% 洗脱缓冲液，再 50%–100% 洗脱缓冲液，每个梯度持续 10–20 CV。对于 BSA，初始方法建议采用 15%–70% 的广泛梯度，持续 30 CV。 
		&#8203;注意：在某些情况下，初始方法即可实现足够分离，满足可靠的多角度光散射（MALS）分析要求，无需额外运行。但在多数情况下，初始方法仅用于指导后续方法的优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过调整不同参数优化离子交换色谱（IEX）方法，以提高分辨率并改善峰分离效果。
	<ol>
		<li>调整梯度斜率和长度。陡峭且较短的梯度可产生强度高但分离度差的峰，而平缓且较长的梯度则产生强度较低但分离更好的峰。需在峰分辨率与信号强度之间取得平衡，以实现最佳 MALS 分析效果。 
		注意：增加上样蛋白量可增强 LS、UV 和 RI 信号，但会牺牲分辨率。</li>
		<li>采用分步式盐浓度梯度进行洗脱。请注意，通常可结合使用分步洗脱与线性梯度。</li>
		<li>降低流速以改善峰分离效果。 
		注意：对于填料颗粒非常小的色谱柱，此方法改善效果不明显。</li>
		<li>调整缓冲液 pH 值，以增大样品中不同蛋白质组分之间的电荷差异，从而改善各变体间的分离效果。需注意，在某一 pH 下未能有效分离的蛋白质，可能在另一 pH 下实现分离。</li>
		<li>使用线性或分步式 pH 梯度使蛋白质从 IEX 色谱柱上解离。必要时可采用同时改变 pH 和盐浓度的复合洗脱梯度。</li>
		<li>使用更强的盐（如 MgCl2）或更弱的盐（如乙酸钠）以提高灵敏度和分辨率16。</li>
		<li>使用更长的 IEX 色谱柱，或更换为填料颗粒更小的不同色谱柱基质，以提升分离能力。</li>
		<li>更换色谱柱类型（AIEX/CIEX），以获得不同的分离模式。请注意，目前已有含强、弱或混合模式配体的基质可供选择，这些可提高某些样品的分辨率。</li>
		<li>选用不同供应商生产的、配体相同但连接于不同基质树脂的色谱柱。树脂本身（独立于配体）可能与蛋白质发生不同相互作用，从而影响分离谱图。</li>
		<li>在缓冲液中添加助剂（可稳定溶液中蛋白质的分子），以提高蛋白质稳定性并防止聚集，从而改善 IEX 实验效果。 
		注意：此类助剂的示例包括糖类、醇类、尿素、非离子型或两性离子型去垢剂，以及变性盐（chaotropic salts）和稳定盐（kosmotropic salts）17,18。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. IEX-MALS 实验
<ol>
	<li>在MALS软件中，从“方法”中打开“新建实验”并选择 在线 方法来自 光散射 系统方法文件夹。如果 DLS 模块可用且需要采集 DLS 数据，请选择 在线 方法来自 光散射与QELS 子文件夹</li>
	<li>在运行下设置参数 配置 部分
	<ol>
		<li>设定运行的流速 通用泵 流速设置为FPLC中使用的流速（1.5 mL/min），并在下方输入或核对缓冲液参数 溶剂 部分</li>
		<li>输入蛋白质名称（BSA）、折射率增量（dn/dc；蛋白质的标准值为 0.185 mL/g）、280 nm 波长处的紫外消光系数（0.66 g/L）-1·cm-1），以及蛋白样品的浓度（6 mg/mL）在 样本 标签下方的选项卡 注射器 插入进样体积（170 µL）至同一部分。</li>
		<li>在 基础采集 标签，位于下方 步骤 切片，选中复选框 自动注射触发 设置运行时长，确保在梯度达到最终值后，数据采集至少持续5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在FPLC软件中设置实验参数。
	<ol>
		<li>创建一个新实验 方法编辑 表。初始实验将采用盐或pH的线性梯度（见步骤3.3）。对于优化后的方法，根据初始方法中的洗脱结果，建立更特异的梯度或阶梯式程序（见步骤3.4和 图1）。在方法中加入一个脉冲信号，以触发MALS软件中的数据采集。</li>
		<li>用相应的缓冲液清洗柱子和阀门：使用含50 mM NaCl的20 mM Tris-HCl（pH 8）作为洗涤缓冲液（A阀），使用含500 mM NaCl的相同缓冲液作为洗脱缓冲液（B阀）。确保最后一次柱子洗涤使用结合缓冲液（低盐浓度），以使蛋白质能够结合到柱基质上。若需大量去除强结合的杂质，可在使用相关缓冲液洗涤前先用0.5 M NaOH清洗，随后用中和缓冲液洗涤。</li>
		<li>使用注射器将蛋白样品加入进样环中。若上样体积超过10 mL，应使用超大进样环或FPLC仪器的泵阀，并绕过FPLC的过滤泵和混合器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>首先在MALS软件中点击以启动实验 运行 按钮，然后在FPLC软件中进行设置。数据将在MALS检测器接收到FPLC仪器发出的脉冲信号后开始采集。</li>
	<li>如果采用连续流动模式手动进行IEX-MALS操作，而非使用独立方法，则应应用步骤4.1–4.4中所述的相同运行参数和操作说明。</li>
	<li>在最终方法验证并运行后，使用空白进样（以加载缓冲液代替样品）执行完全相同的方法。空白运行中自动进样脉冲与梯度之间的时间间隔必须与样品运行完全一致。</li>
</ol>
5. IEX-MALS 实验数据的分析
<ol>
	<li>在 MALS 软件的 Procedure 部分下逐步执行分析。Basic Collection 视图显示实验的原始数据采集结果。
	<ol>
		<li>如果色谱图噪声较大，使用 Despiking 选项卡对色谱图进行平滑处理。通常情况下，选择 normal 级别即可。</li>
		<li>在 Baseline 视图中为所有信号（所有 LS、UV 和 RI 检测器）定义基线。</li>
		<li>在 Peaks 视图中定义用于分析的峰。验证每个峰下蛋白质的 dn/dc 值和 UV 消光系数是否正确。 
		&#8203;注意：对于蛋白质，通常使用 0.185 mL/g 的标准折射率增量值；但对于其他大分子，应根据分子性质使用不同的 dn/dc 值。多核苷酸（DNA/RNA）的平均 dn/dc 为 0.17 mL/g19，而蔗糖等糖类的平均 dn/dc 值为 0.145 mL/g20，脂质和去垢剂的 dn/dc 值范围在 0.1–0.16 mL/g21 之间。</li>
		<li>在 Molar Mass &amp;#38; Radius from LS 和 Rh from QELS 视图下，利用拟合参数和相关函数分析摩尔质量与半径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由于盐浓度升高，IEX-MALS 运行过程中 RI 信号会发生显著变化。因此，在需要 RI 数据进行质量计算时，应从空白进样中减去基线信号。
	<ol>
		<li>同时打开蛋白质和空白 IEX-MALS 实验。右键单击蛋白质实验名称，选择 Apply Method，然后在文件对话框中选择 Baseline Subtraction 文件夹。选择正确的方法类型（例如 online），用于标准摩尔质量分析。请注意，为蛋白质实验定义的参数和设置将保存到新打开的方法中。</li>
		<li>在 Baseline Subtraction 视图下，点击 Import Blank 导入空白运行的信号。在 Instruments（位于 Import Blank 按钮旁）中，勾选所有需要进行扣除的检测器。</li>
		<li>在 Peaks 视图中，根据蛋白质峰区域溶液的电导率调整 dn/dc 值（如有必要），因为在运行过程中溶液的 RI 值会发生变化12。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 BSA 单体对 IEX-MALS 系统进行校准。 
	&#8203;注意：通常情况下，IEX-MALS 系统会定期使用一种均分散蛋白质（如 BSA 单体）进行校准，以实现峰对齐、峰展宽校正以及将角度检测器相对于 90° 检测器进行归一化，该蛋白质的回转半径（Rg）应 &#60;10 nm。在本示例中，BSA 既作为校准分子，同时也是摩尔质量分析的对象。
	<ol>
		<li>在 Procedures &#62; Configuration 视图下对齐峰。</li>
		<li>在 Normalization 视图下执行归一化操作，输入 Rg 值为 3.0 nm。</li>
		<li>在同一 Configuration 选项卡下的 Band Broadening 中，选择峰并使用 Perform Fit 按钮将 UV 和 LS 信号与 RI 信号对齐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结果图显示在 Results Fitting 视图中。通过右键单击图形，选择 Edit，然后点击 Advanced 按钮，可更改坐标轴比例和其他图形参数。在 EASI Graph 选项卡中还可获得具有更多显示选项的图形：在窗口顶部的 Display 下拉菜单中选择 Molar Mass。</li>
	<li>请注意，所有结果（包括摩尔质量、半径、纯度水平等）均可在 Results 部分的 Report 视图（摘要或详细）中查看。使用 Report Designer 按钮可在报告中添加更多结果、参数以及图表。</li>
</ol>

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</ol>

D.S. 是 Wyatt Technology Corporation 的员工，该公司产品在本方案中被使用。A.T. 是 Danyel Biotech 的员工，该公司是 Wyatt 和 ÄKTA 仪器的经销商。

离子交换色谱-多角度激光散射（IEX-MALS）是一种强大的蛋白质分离与表征方法，可对纯化蛋白质及异质样品进行准确的摩尔质量测定，用于表征天然寡聚体、非天然聚集体、共价与非共价复合物以及偶联蛋白质。通过采用线性梯度或一系列盐浓度梯度的程序，可实现不同蛋白质组分的良好分离，并允许MALS对各个独立峰进行准确分析。若需要更高的分辨率，可通过调节不同参数（如方案中步骤3.4所述的梯度斜率）进一步优化。由于IEX-MALS提供了其他方法（如SEC-MALS）之外的额外且关键的蛋白质表征信息，因此可作为一种有价值的蛋白质质量控制检测手段。
尽管SEC-MALS是测定蛋白质摩尔质量的标准且常用技术，但标准分析型SEC色谱柱的分辨率相对较低，可能限制MALS获得准确的摩尔质量测量结果12。SEC-MALS技术局限性的一些实例包括含有连续寡聚体的溶液、聚集体含量较高且未能与单体峰完全分离的样品，以及摩尔质量相近的异质群体（如修饰蛋白质）。
离子交换色谱法（IEX）的设计与操作比尺寸排阻色谱法（SEC）更为复杂，但IEX-MALS实验所获得的信息可与SEC-MALS分析互为补充，有时甚至比后者提供更丰富的信息。IEX-MALS已成功用于表征具有相同摩尔质量的抗体变体、在SEC上未能完全分离的寡聚体，以及难以通过SEC分析的短肽12,24。此外，对于尺寸过大而无法通过SEC分离的大分子组装体，例如含有病毒DNA的完整颗粒和空颗粒的腺相关病毒（AAV），可在MALS分析前通过IEX实现分离25。与SEC相比，IEX具有更多样化的分离能力14，并且可通过调节多种参数（如缓冲液pH、盐的种类、色谱柱类型与长度等）来提高峰分辨率。与SEC不同，IEX对样品进样体积无限制，且可分析任意大小的分子（参见Amartely等人的表112）。这对于低光散射（LS）信号强度的样品而言是一个显著优势，例如非常小的蛋白质或在浓缩时易发生聚集的稀释蛋白样品。由于分析型IEX色谱柱比SEC色谱柱更稳定，且产生的颗粒物更少，因此IEX-MALS所需的平衡时间极短，光散射信号也能迅速稳定。这使得可以按照本方案所述独立运行单个实验，并根据需要随时终止运行。
与尺寸排阻色谱（SEC）通常仅需一次实验（使用具有合适分离范围的色谱柱）即可获得良好结果不同，离子交换色谱（IEX）可能需要进行多次实验，通过优化方法参数才能实现最佳分辨率。在采用盐浓度梯度进行的IEX-MALS实验中，运行过程中缓冲液的电导率以及相应的折射率（RI）会发生显著变化，从而导致RI信号的改变。因此，每次IEX-MALS实验都需要额外进行一次空白运行，并在数据分析时进行基线扣除（如实验方案第5.2步所述），除非浓度分析仅依赖紫外检测（此时需预先知道各峰的消光系数）。对于线性梯度，基线扣除分析是可靠的，尽管针对盐浓度阶梯式程序的基线扣除方法仍需进一步开发。各峰的dn/dc值应根据其洗脱时对应的具体缓冲液电导率进行调整（相关计算方法可参考文献12）。若蛋白质在低于200 mM NaCl浓度下洗脱（如BSA示例），该调整可忽略不计。
与尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）相比，离子交换色谱-多角度激光散射（IEX-MALS）中使用的蛋白质用量相对较大（如方案步骤2.3中所述），这对于克服盐梯度引起的折光指数（RI）信号剧烈变化以及梯度缓冲液混合不充分导致的RI波动至关重要。如果仅使用紫外检测（UV）进行质量测定，则可使用较少的样品量。上样蛋白的用量取决于蛋白的摩尔质量、均一性、纯度以及紫外消光系数。对于较小的蛋白质，所需上样量应更高，而对于较大的蛋白质则可降低上样量（例如，20 kDa蛋白约为1 mg，150 kDa蛋白约为0.2 mg）。对于非均一性样品，由于样品量分布在多个组分之间，因此需要注入更多的样品。分析型高效液相色谱（HPLC）系统所需的样品量可能少于FPLC系统。
最近有研究报道，在纯化过程中使用多角度激光散射（MALS）进行在线分析。这种实时分析方法能够高效地检测纯化过程中产生的聚集产物，从而避免蛋白质纯化后所需的额外分析步骤26。离子交换色谱（IEX）常被用作中间纯化步骤，因此，制备型IEX色谱柱与MALS的联用不仅可作为分析表征手段，还可用于大规模纯化过程的实时监测。非分析型IEX色谱柱同样具有良好的稳定性，颗粒释放程度低，因此适用于与MALS联用。其他分离技术，如亲和色谱或疏水交换色谱，也可在处理相对纯净样品时与MALS联用（以避免MALS和示差折光（RI）检测器受到污染）。但这需要对方法进行调整和优化，以实现良好的峰分离，同时获得足够干净的光散射（LS）和RI信号，从而确保MALS分析的成功。

随着质量控制（QC）在生物制药行业的监管需求以及生命科学研究的可靠性和完整性保障中的重要性日益增加，对蛋白质产物进行定量表征变得愈发关键1,2。根据欧洲蛋白质生产与纯化合作伙伴关系网络（Protein Production and Purification Partnership in Europe, P4EU）和欧洲生物物理研究资源协会与欧洲分子生物物理学协会（Association of Resources for Biophysical Research in Europe and Molecular Biophysics in Europe, ARBRE-MOBIEU）网站所述（分别为 https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs 和 https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control），蛋白质质量控制不仅需要表征最终产物的纯度，还应包括其寡聚状态、均一性、身份、构象、结构、翻译后修饰及其他相关性质3,4。
最常用的质控表征方法之一是体积排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）。该方法将分析级体积排阻色谱柱与多角度激光散射（MALS）以及紫外-可见光谱和示差折光检测器联用，能够准确测定每个洗脱峰的蛋白质摩尔质量5。SEC-MALS 可不依赖洗脱体积独立测定洗脱峰的摩尔质量，从而克服了通过色谱柱校准进行分析型 SEC 测定时存在的不准确性。增加一个动态光散射（DLS）模块后，可实现粒径测量，进而确定流体动力学半径。在学术研究中，SEC-MALS 通常用于确定蛋白质的寡聚状态、构象、纯度水平、聚集程度以及修饰后的蛋白质（如糖蛋白或脂溶剂化膜蛋白），并可分别测定蛋白质及其偶联组分的摩尔质量6,7,8。
在许多情况下，蛋白质纯化过程的最终产物并非结构明确的单一分子种类，而是具有一定的异质性。此类混合物中的蛋白质可能在结构（例如不同的寡聚形式）、构象或蛋白质亚型方面存在差异。蛋白质异质性也可能由轻微的化学差异引起，例如C端赖氨酸加工或天冬酰胺/谷氨酰胺脱酰胺，从而导致电荷变异9,10。翻译后修饰（如糖基化）的差异同样可导致样品的异质性并引起电荷变化9。这些不同类型的异质性会反映在蛋白质的生物物理特性中，并可能影响目标蛋白质的稳定性和生物学活性11。
对于此类异质样品，可靠的质控分析需要高分辨的分析分离技术。在某些情况下，由于分析型SEC色谱柱的分辨率和分离能力有限12，难以实现良好的分离，从而导致SEC-MALS分析结果不准确。将高特异性分离技术（如离子交换色谱，IEX）与MALS联用，可克服SEC-MALS在分析异质样品时的局限性，为蛋白质表征提供一种互补的方法（见Amartely等12中的表1）。与根据大分子流体动力学尺寸进行分离的SEC不同13，IEX依据大分子表面电荷进行分离14。阴离子交换（AIEX）和阳离子交换（CIEX）介质分别结合带负电荷和正电荷的变体。IEX-MALS能够在质量或形状相近的蛋白质组分之间实现精细分离，成功测定混合样品中每种蛋白质状态的摩尔质量12。
本文介绍了一种用于分离和分析同一样品中牛血清白蛋白（BSA）寡聚体形式的离子交换多角度激光散射（IEX-MALS）实验的标准操作流程。文中讨论了针对特定蛋白质选择离子交换色谱柱的重要性，以及缓冲液的pH值和电导条件。同时逐步描述了IEX-MALS实验数据的分析方法。尽管在尺寸排阻多角度激光散射（SEC-MALS）中对BSA寡聚体的分离已具有良好且足够的效果，但BSA仍是一个展示IEX-MALS能力及实验优化过程的典型示例。先前的一项研究12讨论了SEC-MALS导致分离效果不佳的案例，以及通过IEX-MALS实现良好分离与准确分析的实例。

<table><tbody><tr><td>&amp;Auml;KTA pure</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-26</td><td>FPLC&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.02 &amp;micro;m Anotop Whatman 滤膜 10 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1002</td><td>样品滤膜</td></tr><tr><td>0.1 &amp;micro;m Anotop Whatman 滤膜 10 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1012</td><td>样品滤膜</td></tr><tr><td>0.1 &amp;micro;m Anotop Whatman 滤膜 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-2012</td><td>流动相滤膜</td></tr><tr><td>BSA（纯度 &gt;97%）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A1900</td><td>牛血清白蛋白</td></tr><tr><td>miniDAWN TREOS&amp;nbsp;</td><td>Wyatt Technology</td><td>WTREOS</td><td>多角度激光散射检测器（MALS）</td></tr><tr><td>mono Q HR 5/50 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>阴离子交换分析柱</td></tr><tr><td>Optilab T-rEX</td><td>Wyatt Technology</td><td>WTREX</td><td>示差折光检测器</td></tr><tr><td>0.1 mm PES 1000 mL Stericup</td><td>Millipore</td><td>SCVPU11RE</td><td>流动相滤膜</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>71382</td><td>高效液相色谱级 NaCl</td></tr><tr><td>TRISMA 基础试剂</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T-1503</td><td>TRIS 缓冲液</td></tr></tbody></table>

离子交换色谱（iex）与多角度光散射（mals）联用技术用于蛋白质分离与表征

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

离子交换色谱结合多角度光散射（IEX-MALS）是一种强大的蛋白质分离与表征方法。将高特异性分离技术IEX与MALS实现的精确摩尔质量分析相结合，可对异质性蛋白质样品进行表征，包括具有非常相似摩尔质量的寡聚体形式或蛋白质群体的混合物。因此，IEX-MALS提供了更高层次的蛋白质表征能力，并可作为标准尺寸排阻色谱结合多角度光散射（SEC-MALS）技术的有力补充。
本文介绍了一种基本的离子交换色谱-多角度激光散射（IEX-MALS）实验方案，并以牛血清白蛋白（BSA）为例演示该方法。IEX 可将 BSA 分离为其不同的寡聚体形式，从而通过 MALS 对每种单独的形式进行摩尔质量分析。本文还展示了针对 BSA 的 IEX-MALS 实验优化过程，实现了 BSA 单体与较大寡聚体之间优异的分离效果。IEX-MALS 是一种用于蛋白质质量评估的重要技术，因为它能够对样品中存在的多种蛋白质组分实现精细分离并准确测定其摩尔质量。

BSA 是一种常见的蛋白质，常用于色谱实验系统的校准22，也非常适合用于离子交换色谱-多角度激光散射（IEX-MALS）以及尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）的实践操作。BSA 主要以单体形式存在，理论单体分子量为 66.7 kDa，通常还含有少量二聚体及更高阶的寡聚体23。
使用阴离子交换分析柱（见材料表）通过离子交换-多角度激光散射（IEX-MALS）对BSA进行分析。采用30个柱体积（CV）的宽线性梯度，NaCl浓度从75 mM升至350 mM，将BSA单体与较高级别的寡聚体分离。后续的MALS分析测得单体的计算摩尔质量为66.8 ± 0.7 kDa，二聚体的计算摩尔质量为130 ± 5 kDa（图1A）。
根据洗脱峰处缓冲液的电导率，将梯度程序更改为另一种方案：先用175 mM NaCl进行长时间的等度洗脱，随后采用从175 mM到500 mM NaCl的线性梯度。新梯度显著提高了分辨率，实现了牛血清白蛋白（BSA）单体（计算得到的摩尔质量为66.1 ± 0.7 kDa）与其较高寡聚体形式（计算得到的平均质量为132 ± 2 kDa）之间的良好分离（图1B）。为了进一步聚焦于高阶寡聚体并计算每种独立寡聚形式的摩尔质量，采用了200 mM和250 mM NaCl的阶梯式洗脱程序。该实验实现了BSA单体（计算质量为62.4 ± 0.4 kDa）、二聚体（计算质量为130 ± 10 kDa）和三聚体（计算质量为170 ± 10 kDa）之间的优异分离（图1C）。所有离子交换色谱-多角度激光散射（IEX-MALS）实验结果均表明，BSA主要以单体形式洗脱，纯度达80%，这与尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）的结果一致，在后者中BSA单体的纯度为85%12。
<img alt="显示蛋白质洗脱体积、摩尔质量及强度数据的尺寸排阻色谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59408/59408fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：BSA的离子交换-多角度光散射（IEX-MALS）实验优化。 （A）BSA在75–350 mM NaCl梯度程序下的IEX-MALS实验。（B）BSA在175 mM NaCl阶跃程序后接175–500 mM NaCl线性梯度程序下的IEX-MALS实验。（C）BSA在200 mM和250 mM NaCl阶跃程序下的IEX-MALS实验。色谱图显示了280 nm处的紫外吸收信号（蓝色）、90°角的光散射信号（红色）、折射率（粉色）和电导率（灰色）曲线，以及由MALS计算得到的各峰摩尔质量（黑色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59408/59408fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了在异质样品中利用高特异性离子交换色谱结合多角度光散射技术，准确测定蛋白质、蛋白质复合物及多肽的摩尔质量。该方法对于质量评估，以及天然寡聚体、电荷变体和混合蛋白质样品的表征具有重要价值。

离子交换色谱（IEX）与多角度光散射（MALS）联用技术用于蛋白质分离与表征

结合多角度光散射的离子交换色谱（IEX-MALS）是一种用于蛋白质分离与表征的强有力方法。该组合……

本方案介绍了离子交换多角度激光散射法（ion-exchange MALs），这是一种用于蛋白质质量控制与表征的新方法，而质量控制对于生命科学研究和药品开发中结果的一致性和完整性至关重要。离子交换MALS可测定蛋白质纯度、寡聚状态、均一性、身份、构象、结构、翻译后修饰及其他性质。该检测方法具有非破坏性，可在接近生理条件的缓冲溶液中进行。该方法可准确测定蛋白质或肽的摩尔质量、寡聚状态以及偶联程度（例如糖蛋白）。该方法也可应用于膜蛋白。离子交换色谱（IEX）根据大分子表面电荷的差异进行分离。阴离子交换（AIEX）和阳离子交换（CIEX）介质分别结合带负电荷和正电荷的变体。离子交换-多角度激光散射（IEX-MALS）能够在质量或形状相近的蛋白质群体之间实现精细分离，成功测定混合样品中每种独立蛋白质状态的摩尔质量。实验开始时，使用0.1微米滤膜过滤所有试剂，包括洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。将最初50至100毫升的缓冲液过滤至废液瓶中，以去除干滤器中的颗粒物。将剩余缓冲液过滤至一个洁净无菌的瓶子中，该瓶子需先用过滤水彻底清洗，并加盖以防止灰尘进入。使用pH为8的Tris缓冲液和50毫摩尔的氯化钠，将牛血清白蛋白（BSA）样品稀释至6毫克/毫升，使pH值和离子强度适合与离子交换柱结合。使用注射器将至少 0.3 至 0.5 毫克的 BSA 注入一毫升柱中，以获得高质量的 MALS 分析结果。要开始离子交换 MALS 实验，请在 MALS 软件中打开“方法”下的“新建实验”，然后从光散射系统方法文件夹中选择在线方法。如果 DLS 模块可用且需要采集 DLS 数据，请从光散射“含 QELS”子文件夹中选择在线方法。在“配置”部分中设置参数时，首先在“通用泵”部分将运行流速设置为FPLC中使用的流速，即1.5毫升每分钟。在“溶剂”部分输入或核对缓冲液参数。在“进样器”部分，输入蛋白质名称为BSA，折射率增量为0.185毫升每克，以及在280纳米波长处的紫外消光系数为0.66升每克每厘米。在“样品”选项卡中，输入蛋白样品的浓度为 6 毫克/毫升，同时输入进样体积为 170 微升。在“操作步骤”部分的“基本收集”选项卡中，选中“自动进样触发”复选框，并将运行时间设置为 70 毫升，以确保在梯度达到最终值后数据采集至少持续五分钟。然后，在 FPLC 软件的“方法编辑器”选项卡中创建一个新的实验。对于初始实验，创建盐浓度或pH的线性梯度；而对于优化后的方法，则根据论文建立更特异的梯度或阶梯式程序。在方法中加入一个脉冲信号，以触发MALS软件中的数据采集。然后打开泵阀，用0.5摩尔的氢氧化钠洗涤，以去除强结合的杂质，随后用中和缓冲液洗涤。然后，用 pH 8 的 Tris 缓冲液洗涤层析柱，A 阀用洗涤缓冲液洗涤，B 阀用洗脱缓冲液洗涤。使用低盐浓度的洗涤缓冲液作为最后一步洗涤，以冲洗层析柱，从而使蛋白质能够结合到层析柱基质上。在上样前、洗涤后以及洗脱结束时，必须使光散射基线稳定，以确保低噪声和完全纯净的稀释环境。使用注射器将蛋白样品加入进样环中。首先在MALS软件中点击“运行”按钮启动实验，然后在FPLC软件中启动。当MALS检测器接收到FPLC仪器发出的脉冲信号后，即开始采集数据。如果离子交换 MALS 采用连续流动模式手动进行，而非使用独立方法，则应用与之前所述相同的运行参数和操作步骤。在最终方法验证并运行后，使用空白进样进行完全相同的方法操作，即用平衡缓冲液代替样品。空白运行中自动进样脉冲与梯度洗脱之间的时间间隔必须与样品运行完全一致。开始分析时，在 MALS 软件的“操作步骤”部分，使用“去尖峰”选项卡中的“正常”级别来平滑色谱图。如果色谱图噪声较多，可将级别设置为“重度”。在“基线”视图中，为所有信号（包括光散射、紫外和示差折光检测器）定义基线。在“峰”视图中，定义用于分析的峰。验证每个峰下蛋白质的折射率增量（dn/dc）值和紫外消光系数的正确性。在“光散射法测定摩尔质量与半径”视图下，使用Zimm模型并以零阶拟合来分析摩尔质量和半径。如果可使用 QELS，在 QUELS 的 Rh 视图下观察 Rh 值及相关函数的拟合质量。由于盐浓度升高，离子交换 MALS 运行过程中 RI 信号会发生显著变化。为了从空白进样中扣除基线信号，请同时打开蛋白质和空白样品的离子交换 MALS 实验。右键单击蛋白质实验名称，选择“应用方法”，然后在文件对话框中选择“基线扣除”文件夹。选择用于标准摩尔质量分析的在线方法。在“基线扣除”视图下，单击“导入空白”以导入空白运行的信号。在“仪器”部分，勾选所有需要减去的检测器。为了使用 BSA 单体校准离子交换 MALS 系统，在“程序和配置”视图下对齐峰。在“归一化”视图下，输入 3.0 纳米作为 Rg 值以执行归一化。然后，在同一“配置”选项卡中的“谱带展宽”部分，选择峰形并使用“执行拟合”按钮，将紫外光（UV）和光散射（LS）信号与示差（RI）信号进行匹配。结果图显示在“结果拟合”视图中。通过右键单击图表，选择“编辑”，然后点击“高级”按钮，可更改坐标轴比例尺和其他图表参数。为了获得更多显示选项，请选择 EASI Graph 选项卡，然后在窗口顶部的 Display 下拉菜单中选择 Molar Mass 或 Rh Q。所有结果，包括摩尔质量、半径、纯度水平及其他参数，均可在 Results 部分的 Report 视图中查看。使用 Report Designer 按钮可向报告中添加更多结果或参数以及图表。在本实验中，使用阴离子交换分析柱通过离子交换 MALS 对 BSA 进行了分析。色谱图同时显示了280纳米处的紫外吸收、90度角光散射、折射率以及电导率曲线，并结合各峰的摩尔质量。通过30个柱体积的线性梯度洗脱（氯化钠浓度从75毫摩尔升至350毫摩尔），实现了牛血清白蛋白（BSA）单体与二聚体及更高阶寡聚体的分离。后续的多角度光散射（MALS）分析得出，单体的计算摩尔质量为66.8千道尔顿，二聚体的计算摩尔质量为130千道尔顿。根据洗脱峰处缓冲液的电导率，将梯度程序更改为另一种方案：先使用175毫摩尔氯化钠进行长时间的等度洗脱，随后采用从175毫摩尔到500毫摩尔氯化钠的线性梯度。新梯度显著提高了分辨率，实现了牛血清白蛋白（BSA）单体与较高寡聚体组分之间的良好分离。为进一步聚焦高寡聚体组分，还应用了200毫摩尔和250毫摩尔氯化钠的阶梯式洗脱程序。这实现了BSA单体、二聚体和三聚体之间的良好分离。通过此方法，可对经离子交换分离的每种变体进行质谱、SDS-PAGE活性和稳定性测试，以鉴定并进一步表征每一种变体。我们发现，离子交换耦合多角度光散射（MALS）技术将MALS分析的能力扩展到了那些无法通过SEC-MALS进行全面分析的样品。通过电荷分离可分辨在SEC中共同洗脱的不同物质。

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