Name: 原位杂交的色原性杂交是HPV相关头颈部癌症诊断的工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 了解HPV RNA原位杂交技术用于头颈部癌症诊断的方法。该技术通过可视化E6-E7 mRNA表达来检测活跃的人乳头瘤病毒感染，具有高灵敏度和特异性，可精确定位病毒转录并辅助预后评估。

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作者感谢欧洲乔治·蓬皮杜医院和内克尔医院病理科（Laurianne Chambolle、Elodie Michel 和 Gisèle Legall）；PARCC 欧洲乔治·蓬皮杜医院组织学平台（Corinne Lesaffre）；Virginia Clark 对语言的编辑；以及 Alexandra Elbakyan 的贡献。

本方案遵循伦理准则，并已获得伦理委员会（Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II，编号：2015-09-04）的批准。
1. 材料准备
<ol>
	<li>1×洗涤缓冲液的配制
	<ol>
		<li>在大容量试剂瓶中加入2.94 L蒸馏水和一瓶（60 mL）50×洗涤缓冲液（见材料表），配制3 L的1×洗涤缓冲液，充分混匀。 
		注意：1×洗涤缓冲液可预先配制，在室温下保存最多1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复染试剂的配制
	<ol>
		<li>配制50%苏木精染液。
		<ol>
			<li>在通风橱中，将100 mL Gill苏木精I液（见材料表）加入到染色缸中的100 mL蒸馏水中。 
			注意：50%苏木精染色液可重复使用，最多使用1周。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制0.02%（w/v）氨水（蓝化试剂）。</li>
		<li>在通风橱中，将1.43 mL的1 N氢氧化铵加入盛有250 mL蒸馏水的量筒或其他容器中，用石蜡膜密封容器，充分混匀3–5次。 
		注意：为确保实验定量准确性，必须使用氢氧化铵。试剂可预先配制，确保所有容器始终保持加盖状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1×抗原修复试剂的配制
	<ol>
		<li>在大烧杯中加入70 mL的10×抗原修复试剂（见材料表）和630 mL蒸馏水。</li>
		<li>将烧杯置于带磁力搅拌器的加热板上，并用铝箔覆盖。</li>
		<li>在100 °C下煮沸10–15分钟。 
		注意：煮沸时间不得超过30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>试剂平衡
	<ol>
		<li>确保杂交炉已开启并预热至40 °C，在托盘底部放置湿润的保湿纸。 
		注意：步骤3.4至4.2需要使用杂交炉（见材料表）。</li>
		<li>从冰箱中取出扩增试剂（AMP1–AMP6，见材料表），在室温下平衡至少30分钟，再进行相应的孵育步骤。</li>
		<li>每次使用前，将靶标探针和/或对照探针在40 °C的烘箱、水浴或培养箱中预热至少10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在通风橱中进行黏附增强和脱蜡
注意：从载于未染色玻片上的 3–5 µm 厚组织学样本开始本实验方案。
<ol>
	<li>为了增强附着性，将载玻片置于烘箱中于 60 °C 烘烤 1 小时，或于 40 °C 过夜。</li>
	<li>将未染色的组织学载玻片放入染色架中。将染色架浸入盛有新鲜二甲苯的染色缸中，持续 5 分钟，并间歇性振荡。更换新鲜二甲苯后重复此步骤。</li>
	<li>将染色架浸入盛有新鲜 100% 乙醇的染色缸中，持续 3 分钟，并持续振荡。更换新鲜 100% 乙醇后重复此步骤。</li>
	<li>让载玻片在室温下干燥 2 分钟。 
	注意：在实验结束后，不得将脱蜡试剂用于载玻片的脱水步骤。</li>
</ol>
3. 组织预处理
注意：这些步骤遵循制造商针对头颈部样本的“标准”预处理建议。根据所操作的组织类型，第 3.1 和 3.2 节的操作时间可能需要相应调整。
<ol>
	<li>阻断过氧化物酶活性
	<ol>
		<li>向每张载玻片上加入4–6滴过氧化氢（参见材料表），于室温孵育10分钟。</li>
		<li>在室温下用蒸馏水洗涤载玻片，每次2分钟，共洗2次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>断裂RNA/组织结合
	<ol>
		<li>用镊子移除1.3节中沸水浴内1倍目标修复试剂（TTR1x）表面的铝箔，并停止搅拌。将载玻片架缓慢且小心地浸入其中，持续15分钟。随后再次用铝箔覆盖烧杯。 
		注意：此步骤期间需保持微沸状态。 
		警告：使用镊子操作铝箔和载玻片架，以避免烫伤。务必穿戴适当的个人防护装备，如手套和实验服。</li>
		<li>立即用镊子将热的载玻片架转移至蒸馏水浴中，洗涤2分钟。 
		注意：确保样本不在TTR1x中冷却。</li>
		<li>用新鲜的100%乙醇洗涤载玻片2分钟。</li>
		<li>让载玻片在室温下干燥2分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立疏水屏障
	<ol>
		<li>使用疏水屏障笔（参见材料表）在样本周围画一圈屏障，使其至少干燥5分钟。 
		注意：确保屏障完全干燥。若在操作过程中屏障磨损，可重新绘制。避免用笔触碰组织。本步骤可在此处暂停过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白酶消化
	<ol>
		<li>将载玻片置于载玻片架上，每个样本加约4滴蛋白酶增强液（参见材料表）。</li>
		<li>盖上湿度控制盘的盖子，放入杂交炉中，在40 °C下孵育30分钟。 
		注意：为防止蒸发，请确保旋钮完全旋转至锁定位置。</li>
		<li>从烘箱中取出托盘，并取出载玻片架。</li>
		<li>逐张载玻片快速去除多余液体，并将其放入盛有蒸馏水的染色缸中的载玻片架内。</li>
		<li>在室温下用蒸馏水洗涤载玻片，每次2分钟，共洗2次，持续轻轻振荡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 运行检测
注意：在孵育步骤之间，切勿让切片干燥。
<ol>
	<li>HPV 探针杂交 
	注意：使用前需将探针预热，以溶解可能存在的任何沉淀。在此步骤中，除HPV 探针外，也可使用肽基脯氨酰异构酶 B（PPIB）作为阳性对照，或使用二氢二羟酸还原酶（DAPB）作为阴性对照（参见材料表）。
	<ol>
		<li>轻敲或轻弹载玻片以去除多余液体，并将载玻片放入载玻片架中。每张切片加入约 4 滴 HPV 探针，确保完全覆盖组织区域。</li>
		<li>用盖子盖好杂交盒，放入烘箱中，在40 °C条件下孵育2 h。 
		注意：为防止蒸发，请确保旋钮完全旋转至锁定位置。</li>
		<li>从烘箱中取出杂交盒，并取出载玻片架。</li>
		<li>逐张取出载玻片，迅速去除多余液体，并将载玻片放入盛有 1x 洗涤缓冲液的染色缸中浸没的载玻片架内。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液振荡洗涤载玻片 2 分钟。更换新鲜的 1x 洗涤缓冲液后重复一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AMP1、AMP2、AMP3 和 AMP4 杂交 
	注意：这些步骤包括在杂交炉中进行杂交，所用试剂为购买试剂盒中的 AMP1–AMP4（参见材料表）。
	<ol>
		<li>轻敲或轻弹载玻片以去除多余液体，并将载玻片放入载玻片架中。每张切片加入约 4 滴AMP1，确保完全覆盖组织区域。</li>
		<li>用盖子盖好杂交盒，放入烘箱中，在40 °C条件下孵育30 min。</li>
		<li>从烘箱中取出杂交盒，并取出载玻片架。</li>
		<li>逐张取出载玻片，迅速去除多余液体，并将载玻片放入盛有 1x 洗涤缓冲液的染色缸中浸没的载玻片架内。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液振荡洗涤载玻片 2 分钟。更换新鲜的 1x 洗涤缓冲液后重复一次。</li>
		<li>重复步骤 4.2.1–4.2.5，但使用约 4 滴AMP2代替 AMP1，并在40 °C条件下孵育15 min。用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
		<li>重复步骤 4.2.1–4.2.5，但使用约 4 滴AMP3代替 AMP1，并在40 °C条件下孵育30 min。用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
		<li>重复步骤 4.2.1–4.2.5，但使用约 4 滴AMP4代替 AMP1，并在40 °C条件下孵育15 min。用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AMP5 和 AMP6 杂交 
	注意：这些步骤无需在烘箱中进行杂交，而是在室温下完成。AMP5 和 AMP6 来自购买的试剂盒（参见材料表）。
	<ol>
		<li>轻敲或轻弹载玻片以去除多余液体，并将载玻片放入载玻片架中。每张切片加入约 4 滴AMP5，确保完全覆盖组织区域。</li>
		<li>用盖子盖好杂交盒，在室温下孵育30 min。</li>
		<li>逐张取出载玻片，迅速去除多余液体，并将载玻片放入盛有 1x 洗涤缓冲液的染色缸中浸没的载玻片架内。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液振荡洗涤载玻片 2 分钟。更换新鲜的 1x 洗涤缓冲液后重复一次。</li>
		<li>重复步骤 4.3.1–4.3.4，但使用约 4 滴AMP6代替 AMP5，并在室温下孵育15 min。用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用3,3'-二氨基联苯胺进行信号检测
警告：二氨基联苯胺（DAB）具有毒性。处理和处置该化学品时，应遵循适当的安全预防措施和操作规范。
<ol>
	<li>取适当大小的离心管，将DAB-A和DAB-B（见材料表）以相同体积混合，每种溶液加入相同滴数。每个切片配制约120 µL DAB底物（每种试剂约2滴，共4滴），充分混匀3至5次。</li>
	<li>从切片架中逐个取出玻片，轻敲或轻弹以去除多余液体，再将其放回切片架中。</li>
	<li>向每个组织切片上滴加约120 μL DAB溶液，确保完全覆盖组织，室温孵育10分钟。</li>
	<li>根据当地规定处理剩余的DAB溶液，并将玻片放入盛有自来水的染色缸中，浸入切片架内。</li>
</ol>
6. 复染
<ol>
	<li>将载玻片架移至含有50%苏木精染色液的染色缸中，在室温下静置30秒。注意载玻片将变为紫色。</li>
	<li>立即将载玻片架转移回盛有自来水的染色缸中，通过上下移动载玻片架清洗载玻片3至5次。</li>
	<li>使用新鲜的自来水重复清洗步骤，直至载玻片透明，而组织切片仍保持紫色。</li>
	<li>将染色缸中的自来水更换为0.02%氨水。上下移动载玻片架2至3次。注意组织切片应变为蓝色。</li>
	<li>将氨水更换为自来水，清洗载玻片3至5次。</li>
</ol>
7. 脱水
<ol>
	<li>将载玻片架移至通风橱内装有70%乙醇的染色缸中，偶尔晃动，静置2分钟。</li>
	<li>将载玻片架移至装有100%乙醇的第一染色缸中，偶尔晃动，静置2分钟。</li>
	<li>将载玻片架移至装有100%乙醇的第二染色缸中，偶尔晃动，静置2分钟。</li>
	<li>将载玻片架移至装有二甲苯的染色缸中，偶尔晃动，静置5分钟。</li>
</ol>
8. 载玻片封片
<ol>
	<li>从载物架上取下载玻片，平放在通风橱内，组织切片面朝上。</li>
	<li>逐张进行封片：每张载玻片上加入一滴以二甲苯为基质的封片剂，小心地将 24 mm × 50 mm 的盖玻片覆盖在组织切片上，避免产生气泡。</li>
	<li>室温下静置干燥 ≥5 分钟。</li>
</ol>
9. 样品评估
<ol>
	<li>在标准明场显微镜下以20x–40x的放大倍数观察组织切片。</li>
</ol>

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CB：董事会，学术研讨会：MSD、BMS、Astrazeneca、Roche

使用市售试剂盒进行HPV RNA CISH是检测病毒转录物并指示HPV活跃感染的有力工具。该方法可手动操作，整体步骤易于遵循，且市售试剂盒使用方便。此技术可同时对19个组织学样本及一个对照玻片进行染色，检测过程约需8小时。关键在于各步骤之间切勿让样本干燥（除非另有说明）。根据所处理的组织类型，前处理条件可能需要相应调整。
HPV E6-E7 mRNA 表达信号具有精确的空间分辨率，从而排除了肿瘤邻近的HPV感染非肿瘤细胞可能带来的污染。检测HPV E6和E7 RNA具有功能相关性，因为这些转录本可通过与细胞内的p53和pRb蛋白相互作用，介导HPV诱导的细胞转化4。因此，在子宫颈癌前病变中，根据信号的定位，HPV RNA CISH有助于区分低级别鳞状上皮内病变（LSIL）与高级别鳞状上皮内病变（HSIL）：在大多数LSIL病例中，整个上皮层均可见大量弥散性染色的细胞核，提示处于病毒复制阶段；而HSIL则表现为表层有大量弥散性染色的细胞核，同时伴有基底层强阳性核内及胞浆内点状信号（此类病变既往称为CIN2），或在整个上皮层均出现强核染色...

HPV RNA CISH 是一种用于检测活动性 HPV 感染的有力工具，对于口咽部或子宫颈等不同部位的良性或恶性病变的诊断可能具有关键意义。活动性 HPV 感染的检出有助于支持 HPV 诱导病变的诊断，从而影响其治疗方案和预后判断。
人乳头瘤病毒（HPV）是最常见的性传播感染，已描述超过100种病毒基因型1。从示意图上看，低危型基因型（如6型和11型）可引起生殖器疣、复发性呼吸道乳头状瘤病及其他良性病变；而高危型基因型（如16型和18型）则导致大多数宫颈癌和肛门癌，并在不同地区头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的肿瘤发生中发挥不同程度的作用，具体比例取决于区域流行病学数据2。
目前有多种工具可用于检测人乳头瘤病毒感染。由于高危型HPV感染会导致病毒致癌蛋白E6和E7的表达3，因此检测E6和E7的转录本被广泛视为识别活动性HPV感染的金标准4。HPV RNA CISH可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本上进行，而这类样本可从患有各种HPV相关疾病的患者中较为容易地获取。该方法已在宫颈、肛门和阴道的鳞状上皮内瘤变，以及宫颈、肛门和上呼吸道消化道的浸润性鳞状细胞癌中进行了性能评估5：在HPV DNA聚合酶链式反应（PCR）阳性病例中，其敏感性超过98%。这一结果略优于更为常用的p16免疫组化染色（93%）和HPV DNA原位杂交（DNA ISH：97%）。在另一项包含57例来自头颈部、生殖器区域、皮肤及泌尿道鳞状细胞癌（SCC）患者的研究队列中，与HPV DNA ISH相比，HPV RNA CISH具有更高的敏感性（100% vs 88%）和特异性（87% vs 74%）6。
P16免疫组化染色是一种反映细胞周期紊乱的间接标志物，这种紊乱可能由人乳头瘤病毒感染引起（但不仅限于此）4,7。该检测方法成本效益高，具有良好的敏感性和阴性预测值，美国病理学家学会（CAP）和国际抗癌联盟（UICC）均推荐将其作为口咽癌（OPC）中高危型人乳头瘤病毒感染的替代标志物8。
尽管本文仅关注HNSCC中HPV的检测，HPV RNA CISH在涉及HPV感染的多种其他临床情况下也具有重要临床意义。例如，该技术可提高形态学上不明确的宫颈低级别鳞状上皮内病变（LSIL，曾称为宫颈上皮内瘤变1级[CIN1]）的诊断准确性9。在口咽鳞状细胞癌（SCC）方面，HPV RNA CISH能够识别出HPV相关的SCC，这在国际抗癌联盟（UICC）最新发布的第八版头颈部肿瘤TNM分期分类中已被明确列为与HPV无关的口咽SCC不同的独立类型10。由于HPV相关SCC相较于HPV无关SCC具有更佳的预后，表现为更长的生存期以及对放疗和化疗更高的敏感性11,12,13，因此HPV感染的检测可能影响患者的临床管理策略14,15。此外，HPV RNA CISH还可用于HPV相关多表型鼻腔鼻窦癌的诊断，其检测信号强于HPV DNA CISH16。多项多因素分析表明，E6和E7转录本的检出总体上与口咽SCC更佳的预后相关7,15,17,18，并且在p16阳性的口咽SCC亚组中亦表现出类似关联19,20。
本文介绍了使用厂商提供的试剂盒在福尔马林固定石蜡包埋切片上进行人工HPV RNA CISH的实验方案。&#160;

<table><tbody><tr><td>苏木精溶液，Gill No. 1</td><td>Merck</td><td>GHS132</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ 烤箱 (110v)</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>321710</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ 载玻片架</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>300104</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水屏障笔</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>310018</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.5 HD 检测试剂 - 棕色</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>322310</td><td>该试剂盒包含扩增试剂 AMP1、AMP2、AMP3、AMP4、AMP5 和 AMP6，以及检测试剂 DAB-A 和 DAB-B</td></tr><tr><td>RNAscope 3-plex 阴性对照探针</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>320871</td><td>DAPB</td></tr><tr><td>RNAscope 3-plex 阳性对照探针</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>320861</td><td>PPIB</td></tr><tr><td>RNAscope H2O2 & Protease Plus 试剂</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>322330</td><td>过氧化氢 ×2 和 Protease Plus ×1</td></tr><tr><td>RNAscope 探针 - HPV16/18</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>311121</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 靶标修复试剂</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 洗涤缓冲液试剂</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>310091</td><td>洗涤缓冲液 50X ×4</td></tr></tbody></table>

染色原位杂交作为人乳头瘤病毒相关头颈部癌症诊断的工具

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

人乳头瘤病毒（HPV）感染是口咽部鳞状细胞癌（OPSCC）一个亚型的主要危险因素，该亚型通常比与酒精和烟草相关的OPSCC预后更好。对HPV病毒RNA进行显色原位杂交（CISH）可实现对致癌蛋白E6和E7的病毒转录本进行半定量评估，并以良好的空间分辨率进行原位可视化。该技术能够诊断出活动性感染，通过在肿瘤内HPV感染细胞中可视化HPV转录情况来实现。该技术的一个优势是可避免邻近肿瘤的非肿瘤性HPV感染细胞带来的污染。总体而言，由于其良好的诊断性能，该技术被认为是识别活动性HPV感染的金标准。由于E6和E7病毒蛋白与细胞蛋白pRb和p53的相互作用是细胞转化所必需的，因此HPV RNA CISH在功能上具有相关性，能准确反映活动性致癌性HPV感染。该技术也具有重要的临床意义，因为&#34;低&#34;或&#34;高&#34;HPV转录水平有助于在HPV相关p16阳性头颈部癌患者中识别出两个不同的预后组别。本文介绍了在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片上手动进行HPV RNA CISH的实验方案，所用试剂盒来自厂商。除了显色检测外，RNA原位杂交也可采用荧光检测方式（RNA FISH）。此外，该技术还可与传统的免疫染色联合使用。

如本文所述，在头颈部鳞状细胞癌中，若肿瘤细胞的细胞质或细胞核中出现棕褐色点状染色，可视为阳性病例。在大多数研究中，信号结果被判定为“阳性”或“未检出”14。已有报道采用半定量方法对信号进行评估，但不同研究团队之间缺乏标准化。例如，在某些研究中，信号评分标准为：每个肿瘤细胞出现1–3个点记为1+，4–9个点记为2+，10个或以上点记为3+6；在事后分析中，仅纳入更容易判读的2+和3+信号。在另一项研究中，结果被分为两个评分等级：RNA CISH“高表达”和RNA CISH“低表达”。RNA CISH“高表达”的定义为：超过50%的癌细胞呈染色阳性，或在至少30%的癌细胞中，染色区域覆盖细胞表面（细胞核和细胞质）超过80%，上述观察使用20倍物镜完成（图1）21。
关于阳性对照，PPIB信号应在20倍至40倍放大下可见为细胞核内的点状颗粒。至于阴性对照切片，每20倍显微镜视野中每10个...

人乳头瘤病毒（HPV）RNA 色原原位杂交被认为是检测肿瘤内活性人乳头瘤病毒感染的金标准之一。该方法可实现对 HPV E6-E7 mRNA 表达的可视化，并对其信号进行定位和半定量评估。

人乳头瘤病毒（HPV）感染是口咽部鳞状细胞癌（OPSCC）一个亚型的主要危险因素，该亚型通常与……相关

HPV RNA CISH 可用于检测活动性人乳头瘤病毒感染。由于原位杂交靶向 HPV RNA，该技术能够可视化病毒的活跃转录。该方法具有精确的空间分辨率和良好的诊断性能。HPV 的检测可为多种 HPV 相关病变的诊断提供支持，例如口咽部鳞状细胞癌或宫颈上皮内瘤变。此外，HPV 检测结果也可能影响预后判断。在配制缓冲液和复染试剂后，取一个大烧杯，将 70 毫升 10x 靶修复试剂加入 630 毫升蒸馏水中，配制成 1x 靶修复试剂。将烧杯置于带有磁力搅拌器的加热板上，并用铝箔覆盖。在100摄氏度下煮沸10至15分钟，注意煮沸时间不得超过30分钟。为阻断已脱蜡并置于载玻片架中的组织切片上的过氧化物酶活性，向每张载玻片加入4至6滴过氧化氢，用量以恰好覆盖样本为宜，在室温下孵育10分钟。将载玻片在室温下用蒸馏水洗涤两次，每次两分钟。为打断RNA组织切片中的RNA组织结合，在沸水中使用钳子移除一倍TRR上的铝箔，并停止搅拌。将载玻片架缓慢且极其小心地浸入其中。再次用铝箔覆盖烧杯，并孵育15分钟。使用镊子立即将热的载玻片架转移至蒸馏水浴中，清洗2分钟。随后将载玻片在新鲜的100%乙醇中清洗2分钟，并在室温下干燥2分钟。接下来，使用疏水屏障笔在每个样本周围画出屏障，并静置干燥至少五分钟。进行蛋白酶消化时，将载玻片放入湿度可控的托盘中，每个样本加入约四滴 Protease Plus。盖上托盘盖子，放入杂交炉中，在 40 摄氏度下孵育 30 分钟。将托盘从烤箱中取出，并取出载玻片架。每次处理一张载玻片，迅速去除多余的液体，然后将载玻片放入盛有蒸馏水的染色缸中的载玻片架上，确保载玻片完全浸没。在室温下用蒸馏水洗涤载玻片两次，每次两分钟，并持续振荡。开始杂交时，轻敲并快速甩动载玻片以去除多余的液体，然后将其放回载玻片架中。从烘箱中取出预热的HPV探针，每张切片加入约四滴，确保完全覆盖组织。用盖子盖好托盘，并将其放入40摄氏度的烘箱中孵育两小时。孵育完成后，将托盘从烘箱中取出，并取下载物架。每次取一张载玻片，迅速去除多余的液体，然后将载玻片放入盛有一倍洗液缓冲液的染色缸中的载物架上，室温下持续振荡洗涤2分钟，并用新鲜的一倍洗液缓冲液重复洗涤一次。轻敲并快速抖动以去除载玻片上多余的液体，然后再次将其放回载物架中。每个切片加入约四滴室温的AMP1，以完全覆盖每个切片。用盖子盖上托盘，并将其放入40摄氏度的烘箱中孵育30分钟。从烘箱中取出托盘后，移除载玻片架。每次处理一张载玻片，迅速去除多余的液体，将载玻片放入盛有一倍洗涤缓冲液的染色缸中的载玻片架内，于室温下持续振荡洗涤2分钟，并用新鲜的一倍洗涤缓冲液重复此步骤。取适当大小的离心管，加入等量滴数的DAB-A和DAB-B溶液，每张切片配制约120 µL DAB底物，涡旋混匀。从载玻片架中逐张取出载玻片，轻敲并快速甩动以去除多余液体，然后将其放回载玻片架中。用移液器将约 120 微升 DAB 混合液滴加到每个组织切片上，确保切片完全覆盖。室温孵育 10 分钟，随后进行复染。在每块盖玻片上滴加一滴封片介质，然后将盖玻片置于载玻片上，静置使其自然风干。数小时后，按照文中的描述，使用光学显微镜进行评估。如本文在头颈部鳞状细胞癌中所述，肿瘤细胞胞质或细胞核内出现棕褐色点状染色即判定为阳性病例。根据20倍物镜下的观察结果，将结果分为两个评分等级：RNA CISH 高评分和低评分。当RNA CISH染色在少于50%的肿瘤细胞中被观察到，且染色覆盖细胞表面少于80%时，判定为低评分。相反，当超过50%的染色癌细胞呈现阳性，或在超过30%的肿瘤细胞中染色面积超过细胞表面80%时，判定为高评分。在杂交过程中，切勿让切片干燥。切勿忘记预热探针。每个样本均需进行阳性和阴性对照，以评估RNA的质量。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

原位杂交的色原性杂交是HPV相关头颈部癌症诊断的工具

染色体组学：利用新型OctoChrome FISH检测技术同时检测全部24条人类染色体的数目与结构异常

染色体组学, 染色体异常, FISH检测, OctoChrome, 人类染色体, 数目变异, 结构重排, 分子细胞遗传学, 染色体分析, 荧光原位杂交

一种用于分析染色体复制时间的定量方法。该方法利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入与荧光 原位...

染色体复制时间分析与荧光原位杂交相结合

在本视频中，感染了MCPyV病毒颗粒的细胞接受了处理 在 原位 杂交链式反应检测MCPyV特异性基因组。此外，将DNA-HCR技术与FISH相结合，以可视化感染的人皮肤细胞中的MCPyV...

HCR-DNA FISH：一种用于检测感染细胞中病毒DNA的荧光原位杂交技术

本视频展示了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本进行RNA染色原位杂交前处理的步骤。前处理过程有助于保持细胞内核酸的完整性以及整体组织形态。...

福尔马林固定石蜡包埋组织RNA显色原位杂交前处理：一种用于RNA显色原位杂交的福尔马林固定石蜡包埋组织切片处理流程

关键词：FFPE组织，RNA显色原位杂交，福尔马林固定，石蜡包埋，组织前处理，原位杂交，RNA检测，组织切片

本视频介绍了一种顺序杂交策略，该策略通过将mRNA探针与特定靶标mRNA进行杂交来实现检测。在探针杂交完成后，进行信号放大，以降低组织学样本RNA-CISH过程中的信噪比，从而提高分辨率。...

RNA原位杂交中的探针杂交与信号放大：组织切片中特异性RNA序列检测技术

本视频介绍了RNA显色原位杂交过程中信号检测的实验方案。该技术可用于在完整组织样本中直观诊断是否存在活跃的致癌感染。...

RNA CISH信号检测：在完整组织标本中进行RNA原位杂交时检测显色信号的技术

我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。...

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

高危型人乳头瘤病毒（HPV）存在于头颈部肿瘤组织中与较好的预后相关。近年来新开发的 RNA 原位 一种名为RNAscope的杂交技术可实现对福尔马林固定石蜡包埋组织切片中HPV E6/E7...

RNAscope技术 原位 头颈部鳞状细胞癌中转录活性人乳头瘤病毒的检测

多参数荧光免疫组织化学可用于评估肿瘤微环境中免疫细胞群体的数量、相对分布及定位情况。本文描述了利用该技术分析口咽癌中T细胞亚群的方法。...

石蜡包埋福尔马林固定人咽部鳞状细胞癌样本中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学检测

我们介绍一种利用荧光原位杂交（FISH）技术在裂解感染的人类细胞中可视化多种疱疹病毒RNA的实验方案，适用于悬浮或贴壁细胞。该方案包含荧光信号的定量分析，以生成核质比，并可扩展用于通过免疫荧光（IF）同时可视化宿主和病毒蛋白。...

KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）检测

了解HPV RNA原位杂交技术用于头颈部癌症诊断的方法。该技术通过可视化E6-E7 mRNA表达来检测活跃的人乳头瘤病毒感染，具有高灵敏度和特异性，可精确定位病毒转录并辅助预后评估。

染色原位杂交作为人乳头瘤病毒相关头颈部癌症诊断的工具

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