激发扫描高光谱成像显微技术高效区分荧光信号

该方案具有重要意义，因为它描述了一种可用于在单个样品中分离多种荧光信号的方法。与传统方法相比，激发扫描能够提高实验速度并增强数据的灵敏度。通过使用诸如超连续谱激光器等不同的照明光源，该方法可适用于转盘或激光扫描共聚焦显微镜系统。

进行激发扫描光谱成像显微镜观察时，重要的是要确认每种荧光标记的激发峰位于不同的波长。首先，按照文本方案中所述设置倒置荧光显微镜和相机，然后将样品放置在载物台上。

在微管理者主窗口的下拉菜单中，选择 475 纳米用于初始样品观察。然后双击曝光时间旁边的输入框，输入 100，将曝光时间设置为 100 毫秒。最后，点击“实时”以查看样品。

现在点击“自动”按钮，即自动强度显示范围按钮，将最小值和最大值调整至具有实际意义的可视范围内。接下来，使用显微镜的调焦旋钮对样品进行聚焦。

聚焦后，调节样品位置，使其边缘位于视野中心。然后微调焦距。当图像中边缘特征清晰锐利时，即表示样品已处于聚焦状态。

现在，打开多维采集工具。在菜单中，单击加载按钮，并选择一个包含适合光谱采集波长范围的预设设置。确认采集设置后，移动到样品的空白区域，单击采集，以获取包含背景和噪声的光谱图像堆栈，供后续减除使用。

然后，移动样品以寻找最亮的区域。样品的荧光强度通常在远离边缘的区域更强。找到最亮区域后，采集单个图像序列。

将获取的图像导入 Image J，并使用 Image J 的测量功能确认是否存在包含过曝像素的波长。如果由于过曝需要缩短曝光时间，则应同时使用新的曝光时间重新采集背景图像。如果发现任何图像包含相机的上限检测限信号，应调整光谱扫描的曝光时间，以确保在整个光谱范围内的最大信号不超过相机的动态范围。

在确定适当的曝光时间后，将未标记的样本放置于载物台上。对未标记样本进行光谱成像，以检测是否存在背景自发荧光。随后，将单标记样本置于载物台上。

采集每个单标记样本的光谱图像数据，用作光谱对照以构建光谱库。对每个对照样本使用相同的波长范围、曝光时间和相机设置进行扫描。接下来，将含有实验样本的玻片放置在显微镜上。

选择一个细胞标记适当的视野，使用已确定的采集设置从样品中获取光谱图像数据。通过从样品图像中减去背景光谱，并将图像乘以校正系数，对图像进行平坦光谱响应校正。此处使用 MATLAB 脚本快速处理图像。

接下来，生成光谱库。为获得最佳结果，需将每个端元归一化至最强强度的波长波段：首先确定哪个波长波段的值最强，然后将每个波长波段的测量值除以该最大值。随后将光谱数据保存为 dat 文件。

完成后，对光谱图像数据进行解混。解混步骤将为每种荧光标记生成一幅丰度图像，其中丰度表示来自该特定标记的相对荧光信号在图像中的含量。接下来，打开每幅解混后的图像，以直观检查各纯组分的分布情况。

将误差图像的强度与解混后的图像进行比较。如果误差图像的强度与解混后的丰度图像相近，则表明光谱图像数据中的信号可能未被准确解析。最后，通过将误差图像与解混后的图像进行对比，检查是否存在未识别的残余结构。

若操作正确，光谱解混过程可将光谱图像堆栈分离为各荧光标记的独立贡献。此处展示的解混后光谱图像集包含分别突出显示气道平滑肌细胞自发荧光、GCaMP 探针和线粒体标记的单个图像。细胞核及核周区域存在较高误差，表明光谱库中的光谱无法很好地解释这些区域的实测光谱。

从带有标记且具有自发荧光的细胞中采集的纯光谱很可能会污染该纯组分的光谱轮廓。此处可以观察到，使用受自发荧光污染的纯光谱进行解混，与经过比例校正减法处理后获得的校正纯光谱之间的差异。在对敏感样品进行成像时，正确的数据采集至关重要，因为这类样品可能仅能耐受一次成像过程，而背景和对照样品则可重复成像。

尽可能预先确定合适的硬件和采集参数。下一步，可利用该系统获取的延时数据生成的视频，随时间追踪特定位置的荧光信号源，例如第二信使信号的定位。使用强光源时需格外小心，避免眼睛暴露于光线下。

此外，处理生物标记物时务必佩戴合适的手套。