Name: 激发-扫描高光谱成像显微镜，以有效区分荧光信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 学习激发-扫描高光谱成像显微镜技术，用于在单一样本中有效区分多种荧光信号。该方法利用超连续激光照明，显著提高成像速度和数据灵敏度，适用于转盘式或激光扫描共聚焦显微镜系统。

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作者感谢以下机构的支持：NSF 1725937、NIH P01HL066299、NIH R01HL058506、NIH S10OD020149、NIH UL1 TR001417、NIH R01HL137030、AHA 18PRE34060163 以及 Abraham Mitchell 癌症研究基金。

Leavesley 博士和 Rich 博士披露其对一家初创公司 SpectraCyte LLC 持有财务利益，该公司成立的目的是将光谱成像技术商业化。

激发扫描高光谱成像系统的最佳使用始于光路的构建。具体而言，光源、滤光片（可调谐和二向色性滤光片）、滤光片切换方式以及相机的选择，决定了可用的光谱范围、可能的扫描速度、探测器灵敏度和空间采样能力。汞弧灯提供多个激发波长峰，但其光谱输出不平坦，因此在输出峰处需要显著降低信号强度，以将光谱图像数据校正至可追溯至美国国家标准与技术研究院（NIST）的响应值38。其他替代光源，如氙弧灯和白光超连续谱激光器，可能提供更均匀的光谱输出，更适合用于激发扫描高光谱成像38,39,40。光源、可调谐滤光片和二向色性滤光片的选择共同决定了可用的光谱范围。该范围应根据实验样品所需的光谱信息进行慎重选择。
此外，在选择可调谐滤光片的切换机制时，还应考虑各种相机参数，例如量子效率、像素尺寸和可用的帧率，因为这些因素会影响潜在的采样速率41</...

光谱成像可通过多种方式进行，并有多个相关术语1，2，3，4。通常，光谱成像指在至少两个空间维度和一个光谱维度上获取的数据。多光谱成像与高光谱成像通常根据波长波段的数量或光谱波段是否连续来区分1。在本应用中，高光谱数据定义为通过连续波长波段获取的光谱数据，其相邻波段中心波长的间隔不超过所用激发滤光片半高全宽（FWHM）的一半（即对于带宽为14–20 nm的滤光片，中心波长间隔不大于5 nm）。数据波段的连续性实现了数据集的过采样，从而确保在对光谱域进行采样时满足奈奎斯特准则。
高光谱成像技术由美国国家航空航天局（NASA）在20世纪70年代和80年代结合第一颗陆地卫星（Landsat）的发展而研发5,6收集多个连续光谱波段的数据，可生成每个像素的辐射光谱。通过识别和定义各组分的特征辐射光谱，不仅能够根据其特有的光谱特征检测表面物质，还能消除干扰信号，例如由大气条件引起的信号变化。利用物质特征光谱进行检测的概念于1996年被应用于生物系统，Schröck 等人采用五种不同荧光染料及其已知光谱的组合，通过一种称为光谱核型分析（spectral karyotyping）的技术实现了对标记染色体的区分。7该技术由Tsurui等人于2000年进一步发展，用于组织样本的荧光成像，通过使用七种荧光染料及奇异值分解，将每个像素的光谱信号分解为参考光谱库中光谱的线性组合，从而实现光谱分离8. 与遥感技术中的相应方法类似，只要给定高光谱图像，即可计算出每种已知荧光团的贡献值， 先验的 每种荧光染料光谱的信息。
高光谱成像还已应用于农业9、天文学10、生物医学11、化学成像12、环境应用13、眼科护理14、食品科学15、法医学16，17、医学科学18、矿物学19以及监控领域20。当前荧光显微镜高光谱成像系统的一个关键限制在于，标准的高光谱成像技术通过以下方式将荧光信号分离到窄波段中：1）首先对激发光进行滤波以控制样本激发，然后 2）进一步对发射光进行滤波，将荧光发射分离为窄波段，之后可通过数学方法进一步区分21。对激发照明光和发射荧光同时进行滤波会减少可用信号量，从而降低信噪比，并导致需要较长的采集时间。信号弱和采集时间长限制了高光谱成像作为诊断工具的应用性。
已开发出一种成像方式，该方式利用高光谱成像技术并增强可获取的信号，从而缩短所需的采集时间21,22。这种被称为激发扫描高光谱成像的新方法，通过改变激发波长并收集宽范围的发射光来获取光谱图像数据。先前研究已表明，与发射扫描技术相比，该技术可使信噪比提高数个数量级21,22。信噪比的提升主要归因于所检测的发射光具有较宽的通带（约600 nm），而特异性则通过仅对激发光进行滤波而非荧光发射光来实现。这使得所有发射光（对应每一个激发波长）均可到达探测器21。此外，该技术可用于区分自体荧光与外源性标记物。更重要的是，由于可检测信号的增强而缩短了采集时间，这不仅降低了光漂白的风险，还使得光谱扫描的采集速率能够满足光谱视频成像的实际应用需求。
本实验方案的目的是作为激发扫描高光谱成像显微镜的数据采集指南。此外，文中还包含有助于理解光路和硬件的说明。同时描述了如何在激发扫描高光谱成像显微镜上实现开源软件的应用。最后，提供了如何将系统校准至可溯源至美国国家标准与技术研究院（NIST）的标准、调整软硬件设置以获得准确结果，以及将检测到的信号解混为各个组分贡献的方法说明。

<table><tbody><tr><td>气道平滑肌细胞</td><td>国家疾病研究互换组织（NDRI）</td><td>从美国神经疾病与中风研究所（NDRI）获取的人肺组织中分离得到</td><td>高度自发荧光的钙敏感细胞</td></tr><tr><td>自动快门</td><td>Thorlabs 公司</td><td>SHB1</td><td>可远程控制的快门以最小化光漂白</td></tr><tr><td>自动载物台</td><td>Prior Scientific</td><td>H177P1T4</td><td>用于自动采集多视野或拼接图像的远程可控载物台</td></tr><tr><td>自动载物台控制器（XY）</td><td>Prior Scientific</td><td>Proscan III (H31XYZE-US)</td><td>用于连接自动载物台与计算机及操纵杆</td></tr><tr><td>缓冲液</td><td>自制</td><td>自制</td><td>145 mM NaCl，4 mM KCl，20 mM HEPES，10 mM D-葡萄糖，1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，以及 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，pH 7.3</td></tr><tr><td>细胞培养室</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Attofluor 细胞培养皿，A7816</td><td>由外科级不锈钢和橡胶O型圈组成的盖玻片支架，用于密封培养基并防止样本和/或物镜污染</td></tr><tr><td>激发滤光片</td><td>Semrock 公司</td><td>TBP01-378/16</td><td>中心波长范围（340–378 nm），带宽（最小 16 nm，标称 FWHM 20 nm），折射率（1.88）</td></tr><tr><td></td><td>Semrock 公司</td><td>TBP01-402/16</td><td>中心波长范围（360–400 nm），带宽（最小16 nm，标称FWHM 20 nm），折射率（1.8）</td></tr><tr><td></td><td>Semrock 公司</td><td>TBP01-449/15</td><td>中心波长范围（400–448.8 nm），带宽（最小15 nm，标称FWHM 20 nm），折射率（1.8）</td></tr><tr><td></td><td>Semrock 公司</td><td>TBP01-501/15</td><td>中心波长范围（448.8–501.5 nm），带宽（最小15 nm，标称FWHM 20 nm），折射率（1.84）</td></tr><tr><td></td><td>Semrock 公司</td><td>TBP01-561/14</td><td>中心波长范围（501.5–561 nm），带宽（最小 14 nm，标称 FWHM 20 nm），折射率（1.83）</td></tr><tr><td>荧光滤光片组 二向色镜分光器</td><td>Semrock 公司</td><td>FF495-Di03</td><td>在495 nm处分离激发光和发射光（&gt;350–488 nm 范围内反射率高达 98% &gt;502-950 nm 范围内透射率为 93%，滤光片有效折射率（1.78）</td></tr><tr><td>荧光滤光片组 长通滤光片</td><td>Semrock Inc.</td><td>FF01 496/LP-25</td><td>允许波长大于496 nm的光通过（ &gt;503.2–1100 nm 范围内的平均透射率为 93%，折射率为 1.86</td></tr><tr><td>GCaMP探针</td><td>Addgene</td><td>G-CaMP3；质粒编号 #22692</td><td>基于单波长GCaMP2的基因编码钙离子指示剂</td></tr><tr><td>积分球</td><td>海洋光学</td><td>FOIS-1</td><td>用于宽角度照明的精确测量</td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>TE2000</td><td>倒置显微镜可直接激发样品，无需穿透培养基和/或组织的多层结构。</td></tr><tr><td>Mitotracker Green FM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>M7514</td><td>标记线粒体</td></tr><tr><td>可溯源至美国国家标准与技术研究院（NIST）的校准光源</td><td>海洋光学</td><td>LS-1-CAL-INT</td><td>具有已知光谱、用作标准的光源</td></tr><tr><td>可溯源至美国国家标准与技术研究院的荧光素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F36915</td><td>用于验证系统的适当光谱响应</td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R37605</td><td>标记细胞核</td></tr><tr><td>目标（10X）</td><td>尼康仪器公司</td><td>Plan Apo &amp;lambda; 10X/0.45 &amp;infin;/0.17 MRD00105</td><td>适用于大视野观察</td></tr><tr><td>目标（20倍）</td><td>尼康仪器公司</td><td>Plan Apo &amp;lambda; 20X/0.75 &amp;infin;/0.17 MRD00205</td><td>最常用于组织样本</td></tr><tr><td>目标（60倍物镜）</td><td>尼康仪器公司</td><td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &amp;infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td><td>最常用于细胞样本</td></tr><tr><td>sCMOS相机</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95B（版本 A8-062802018）</td><td>用于获取高灵敏度数字图像</td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>海洋光学</td><td>QE65000</td><td>用于测量激发扫描光谱系统的光谱输出</td></tr><tr><td>可调滤光片转换器</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda VF-5</td><td>用于自动激发滤光片调谐/切换的电动装置</td></tr><tr><td>氙弧灯</td><td>Sunoptic Technologies</td><td>Titan 300HP 光源</td><td>光谱输出相对均匀的光源</td></tr></tbody></table>

激发扫描高光谱成像显微技术高效区分荧光信号

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

多种技术依赖于荧光信号的检测，以识别或研究现象，或阐明功能。在高光谱成像技术出现之前，分离这些荧光信号一直是一项繁琐的工作；而高光谱成像技术能够将不同荧光源彼此分离，并将其与背景信号及自发荧光区分开来（前提是已知其光谱特征）。然而，传统的发射光扫描高光谱成像由于需要对激发光和发射光均进行滤波，导致采集时间较长且信噪比较低。已有研究证明，激发光扫描高光谱成像可在减少必要采集时间的同时，显著提高所获取数据的信噪比。本实验方案利用市售设备，详细描述了如何构建、校准并使用激发光扫描高光谱成像显微系统，以实现对单个样品中多个荧光源信号的分离。该技术虽特别适用于细胞与组织的显微成像，但也可能广泛应用于任何可调节激发波长的荧光实验中，包括但不限于：化学成像、环境科学、眼科护理、食品科学、法医学、医学科学以及矿物学等领域。

本方案中的若干关键步骤对于获取准确且无成像与光谱伪影的数据至关重要。若省略这些步骤，可能导致数据看似显著，但无法通过其他光谱成像系统验证或重复，从而实质性地使基于这些数据得出的任何结论无效。其中最重要的步骤是正确的光谱输出校正（第3节）。校正因子用于补偿可调谐激发系统光谱输出随波长变化的差异。该过程通过调整高激发功率的波长，使其光学照明功率与低激发功率波长下的照明功率相当，从而实现平坦的光谱激发轮廓。不恰当校正因子的一个示例是在一个或多个波长处具有极低的数值（例如，&lt;0.001），这表明在这些波长下测得的强度值必须被大幅衰减才能获得平坦的光谱响应。
将系统校准至可溯源至美国国家标准与技术研究院（NIST）的标准，可确保使用激发扫描光谱成像系统所采集的数据与其他同样校准至NIST可溯源标准的系统具有可比性。因此，必须确保任何校正因子均能适当地调整所采集的数据。校正因子的准确性可通过使用荧光标准物质（例如可溯源至NIST的荧光素）进行验证。<stro...

光谱成像已成为在同一份样本中识别和分离多种荧光信号的可靠方法，能够有效区分目标信号与背景或自发荧光。激发扫描高光谱成像在此基础上进一步优化，可在降低图像采集所需时间的同时，显著提高信噪比。

多种技术依赖于荧光信号的检测，以识别或研究现象，或阐明功能。这些荧光信号的分离……

该方案具有重要意义，因为它描述了一种可用于在单个样品中分离多种荧光信号的方法。与传统方法相比，激发扫描能够提高实验速度并增强数据的灵敏度。通过使用诸如超连续谱激光器等不同的照明光源，该方法可适用于转盘或激光扫描共聚焦显微镜系统。进行激发扫描光谱成像显微镜观察时，重要的是要确认每种荧光标记的激发峰位于不同的波长。首先，按照文本方案中所述设置倒置荧光显微镜和相机，然后将样品放置在载物台上。在微管理者主窗口的下拉菜单中，选择 475 纳米用于初始样品观察。然后双击曝光时间旁边的输入框，输入 100，将曝光时间设置为 100 毫秒。最后，点击“实时”以查看样品。现在点击“自动”按钮，即自动强度显示范围按钮，将最小值和最大值调整至具有实际意义的可视范围内。接下来，使用显微镜的调焦旋钮对样品进行聚焦。聚焦后，调节样品位置，使其边缘位于视野中心。然后微调焦距。当图像中边缘特征清晰锐利时，即表示样品已处于聚焦状态。现在，打开多维采集工具。在菜单中，单击加载按钮，并选择一个包含适合光谱采集波长范围的预设设置。确认采集设置后，移动到样品的空白区域，单击采集，以获取包含背景和噪声的光谱图像堆栈，供后续减除使用。然后，移动样品以寻找最亮的区域。样品的荧光强度通常在远离边缘的区域更强。找到最亮区域后，采集单个图像序列。将获取的图像导入 Image J，并使用 Image J 的测量功能确认是否存在包含过曝像素的波长。如果由于过曝需要缩短曝光时间，则应同时使用新的曝光时间重新采集背景图像。如果发现任何图像包含相机的上限检测限信号，应调整光谱扫描的曝光时间，以确保在整个光谱范围内的最大信号不超过相机的动态范围。在确定适当的曝光时间后，将未标记的样本放置于载物台上。对未标记样本进行光谱成像，以检测是否存在背景自发荧光。随后，将单标记样本置于载物台上。采集每个单标记样本的光谱图像数据，用作光谱对照以构建光谱库。对每个对照样本使用相同的波长范围、曝光时间和相机设置进行扫描。接下来，将含有实验样本的玻片放置在显微镜上。选择一个细胞标记适当的视野，使用已确定的采集设置从样品中获取光谱图像数据。通过从样品图像中减去背景光谱，并将图像乘以校正系数，对图像进行平坦光谱响应校正。此处使用 MATLAB 脚本快速处理图像。接下来，生成光谱库。为获得最佳结果，需将每个端元归一化至最强强度的波长波段：首先确定哪个波长波段的值最强，然后将每个波长波段的测量值除以该最大值。随后将光谱数据保存为 dat 文件。完成后，对光谱图像数据进行解混。解混步骤将为每种荧光标记生成一幅丰度图像，其中丰度表示来自该特定标记的相对荧光信号在图像中的含量。接下来，打开每幅解混后的图像，以直观检查各纯组分的分布情况。将误差图像的强度与解混后的图像进行比较。如果误差图像的强度与解混后的丰度图像相近，则表明光谱图像数据中的信号可能未被准确解析。最后，通过将误差图像与解混后的图像进行对比，检查是否存在未识别的残余结构。若操作正确，光谱解混过程可将光谱图像堆栈分离为各荧光标记的独立贡献。此处展示的解混后光谱图像集包含分别突出显示气道平滑肌细胞自发荧光、GCaMP 探针和线粒体标记的单个图像。细胞核及核周区域存在较高误差，表明光谱库中的光谱无法很好地解释这些区域的实测光谱。从带有标记且具有自发荧光的细胞中采集的纯光谱很可能会污染该纯组分的光谱轮廓。此处可以观察到，使用受自发荧光污染的纯光谱进行解混，与经过比例校正减法处理后获得的校正纯光谱之间的差异。在对敏感样品进行成像时，正确的数据采集至关重要，因为这类样品可能仅能耐受一次成像过程，而背景和对照样品则可重复成像。尽可能预先确定合适的硬件和采集参数。下一步，可利用该系统获取的延时数据生成的视频，随时间追踪特定位置的荧光信号源，例如第二信使信号的定位。使用强光源时需格外小心，避免眼睛暴露于光线下。此外，处理生物标记物时务必佩戴合适的手套。

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