一种用于药物再激活X染色体上沉默Mecp2基因的非随机小鼠模型

本方案可用于构建一种非随机的小鼠模型，以在活体小鼠大脑中检测并定量X连锁失活Mecp2染色体的再激活。该模型可轻松改造，用于研究其他X连锁疾病模型中的Xi再激活，例如DDX3X综合征。我是Sanchita Bhatnagar实验室的博士后，我将与Zeming Zheng共同演示该实验流程。

首先将麻醉后的小鼠置于立体定位仪平台上，使其门齿钩住鼻部固定器的咬杆。在保持小鼠头部处于水平面的同时，拧紧鼻夹。调节耳棒的高度，使其到达耳道的尾侧部分，以固定头部，防止移动。

然后用局部消毒剂和70%乙醇交替擦拭头部进行消毒。当小鼠准备就绪后，使用无菌手术刀在颅顶中部做一条0.75厘米的水平切口。使用0.45毫米钻头，在矢状缝和人字缝交界处、顶骨大致中点位置，距矢状缝和人字缝各2毫米处，于左右大脑半球上方钻出两个对称的孔。

将一支10微升注射器牢固地安装到立体定位仪平台上，并向注射器中加入10微升 freshly prepared 化学抑制剂。将针头插入第一个钻孔，同时保持针头与颅骨垂直。当针头穿过颅骨时，将立体定位数字显示屏上的坐标归零，并继续推进针尖，直至达到2.5毫米的深度。

将针头回撤0.5毫米，至深度为2毫米处，缓慢注入全部10微升溶液，持续时间为1分钟。待所有抑制剂完全输送后，将针头在脑内保留1分钟，然后再撤出针头。使用等量溶剂作为对照，在第二个颅骨钻孔处重复注射操作，随后缝合切口处皮肤。

然后将小鼠从立体定位仪转移至37°C加热垫上，并进行监测直至完全恢复。在完成给药方案后，将小鼠固定在解剖垫上。使用剪刀和镊子在肋骨下方沿侧向切开皮肤和腹壁。

小心地将肝脏与膈膜分离，并沿整个肋骨长度剪开膈膜，以暴露胸膜腔。使用剪刀在左心室后端做一切口，并立即在两分钟内向右心室注入约15毫升的PBS。灌注成功时，肝脏颜色将由红色变为淡粉色。

当所有 PBS 输注完毕后，在两分钟内用约 10 毫升含 4% 多聚甲醛的 PBS 对心脏进行灌注。取下头部后，使用剪刀在头皮正中做一纵向切口以暴露颅骨。将剪刀的一侧尖端插入枕骨大孔，以便从颅骨向眼部方向做一侧向切口。

在颅骨的另一侧做类似的切口，尽量使剪刀末端保持在浅层位置，剪开小鼠两眼之间及鼻部上方的颅骨区域。用镊子轻轻剥离大脑半球的颅骨，并用解剖刀将脑组织抬起。仔细分离固定脑组织与颅骨的脑神经纤维，将脑组织放入塑料培养皿中。

然后切除小脑和嗅球。为了获得脑组织切片，首先将脑组织置于含有4%多聚甲醛PBS溶液的15毫升离心管中，于4°C条件下固定过夜。次日早晨，用新鲜的PBS溶液在4°C条件下清洗脑组织，每次5分钟，至少重复三次。

最后一次洗涤后，用剪刀和镊子去除每个半脑的前面部分，并将样品放入已标记的冷冻模具中，正面朝下。将每个组织浸入最佳切割温度介质中，然后在液氮中快速冷冻，置于10毫米的塑料培养皿内，随后于-80摄氏度保存。为确定Xi再激活，将5至6微米厚的脑组织切片浸入抗原修复液中，在100摄氏度的加热块上处理5分钟。

孵育结束后，用新鲜的PBS在室温下洗涤载玻片，每次洗涤5分钟，共洗涤4次，然后将载玻片浸入封闭液中。室温孵育20分钟后，用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤3次。将组织样本在4摄氏度下与相应的一抗孵育过夜。

在荧光显微镜下对切片成像，调整对比度和亮度，以便对药物处理组和对照溶剂处理组小鼠脑半球中GFP阳性细胞的数量进行定量分析。为了验证非随机X染色体失活小鼠模型在失活X染色体再激活研究中的可行性，通过基因型PCR和流式细胞术确认了雌性转基因小鼠胚胎成纤维细胞的基因型。PCR检测结果显示，药物处理可重新激活GFP标记的甲基化CpG结合蛋白2基因（即MECP2）的表达，而对照溶剂处理则不能。

非随机X染色体失活小鼠模型的胚胎成纤维细胞在药物处理后而非载体处理后也表达核定位GFP，表明X染色体失活因子抑制剂可在小鼠胚胎成纤维细胞中重新激活失活X染色体上的MECP2。药物处理可在灌注药物的脑半球约30%的细胞中重新激活失活X染色体上的MECP2-GFP，而在灌注载体的脑半球中未检测到重新激活。在药物处理的脑半球中，微管相关蛋白2阳性神经元也呈GFP阳性，提示失活X染色体上的MECP2-GFP得到表达。

药物方案将取决于靶点以及小分子抑制剂的效果，因此在体内实验前需先在体外优化剂量和处理方案。可利用非随机小鼠模型来测试不同药物的单独或联合使用效果。事实上，我们及其他研究者已鉴定出多个可作为药物靶点的X染色体失活相关因子。