Name: 非随机小鼠模型在非活性 X 染色体上对 Mcp2 的药理再激活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 了解利用非随机X染色体失活小鼠模型进行Mecp2基因药理再激活的技术方法。该方案通过立体定位手术向小鼠脑内递送化学抑制剂，实现失活X染色体上Mecp2-GFP的再激活表达，为Rett综合征等X连锁神经发育疾病的基因治疗研究提供重要的实验工具。

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作者感谢Antonio Bedalov提供试剂；感谢弗吉尼亚大学组织病理学核心实验室提供冷冻切片服务；感谢弗吉尼亚大学流式细胞术核心实验室提供流式细胞术分析；感谢Christian Blue和Saloni Singh在基因分型方面的技术协助。本研究工作得到了Z.Z.获得的Double Hoo研究资助，以及S.B.获得的弗吉尼亚大学-弗吉尼亚理工大学种子基金奖的试点项目计划奖和哈特韦尔基金会个体生物医学研究奖的支持。

涉及小鼠的实验已获得弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC；#4112）的批准。
1. 构建一种具有基因标记的Xi上Mecp2的非随机X染色体失活小鼠模型
注意：本研究中使用的小鼠品系如下：Mecp2-Gfp/Mecp2-Gfp（Mecp2tm3.1Bird，材料表）和 Xist/ΔXist（B6;129-Xist&#60;tm5Sado&#62;；由西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心的Antonio Bedalov提供）。已针对各品系设计了相应的繁殖策略，以扩增每种品系的小鼠群体。
<ol>
	<li>使用 表1 中列出的基因特异性引物，对所有小鼠品系及其繁殖后获得的后代进行PCR基因分型。</li>
</ol>
2. 设计小鼠繁殖策略以生成 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp
<ol>
	<li>将一只 Mecp2-Gfp/Y 雄性小鼠与一只 XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 雌性小鼠共同饲养（12 小时光照 / 12 小时黑暗循环），建立繁殖配对（图 1A）。理想情况下，每次至少设置 5 对繁殖配对，使用健康且具有生育能力的小鼠。雌性小鼠怀孕并分娩后，让其与雄性共同哺育第一窝仔鼠。 
	注意：由于父源 Xist 基因敲除会损害印记型 X 染色体失活（XCI）、剂量补偿及分化通路17，在繁殖中使用 XistΔ-Mecp2/Y 小鼠将无法获得所需基因型的雌性仔鼠。</li>
	<li>在出生后第 21 天（P21）断奶后，通过基于 PCR 的基因分型分析鉴定并标记 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 雌性仔鼠（图 1B）。 
	注意：关于每组所需动物数量，以下报告结果中设置了 5 对繁殖配对，共获得约 10 只雌性 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 小鼠。</li>
	<li>所有建议实验均使用雌性小鼠模型。 
	注意：性别是 XCI 研究中的重要生物学变量，雄性模型无法反映随机 X 染色体失活所带来的混杂效应。</li>
	<li>为在整个动物实验中保持一致性并排除动物年龄的任何影响，所有实验均在 5−8 周龄的雌性 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 小鼠中进行。</li>
</ol>
3. 分离雌性 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）
<ol>
	<li>将 Mecp2-Gfp/Y 雄性小鼠与 XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 雌性小鼠进行定时交配。设置至少3−4个交配笼，以提高怀孕的可能性。</li>
	<li>交配后次日早晨确认阴道栓后，将雌鼠分离，该日记为胚胎发育0.5天（E0.5）。监测待孕雌鼠的体重增长，并通过肉眼观察小鼠腹部以确认怀孕。在E14.5−15.5时，通过颈椎脱位法处死怀孕雌鼠。</li>
	<li>在超净工作台内，用70%乙醇擦拭怀孕雌鼠的腹部。使用无菌剪刀解剖腹腔，取出含有胚胎的子宫角。用镊子小心取出胚胎，同时剪除残留的腹部组织（通常可获得6−12个胚胎）。</li>
	<li>将含有胚胎的子宫角置于10 mm组织培养皿中。使用无菌剪刀和镊子沿子宫角剪开，分离出携带单个胚胎的胚囊。小心地将含有其余胚胎的子宫角放入盛有30 mL无菌Hanks平衡盐溶液（HBSS）并置于冰上的容器中。</li>
	<li>用无菌剪刀和镊子轻轻剪开胚囊，分离出胚胎。通过剪断脐带去除胎盘。</li>
	<li>将胚胎头部切除。 
	注意： 胚胎其余组织将用于后续处理，而胚胎头部组织则用于提取DNA以进行基因型鉴定。</li>
	<li>使用无菌剪刀和镊子沿胚胎中线剪开腹部，取出心脏、肝脏和肺等内脏器官。</li>
	<li>将剩余的胚胎组织转移至无菌的60 mm组织培养皿中，并用剪刀或剃刀将其切成小块。为分散细胞团块，加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育15分钟。</li>
	<li>加入5 mL含10%胎牛血清（FBS）和10 µg/mL青霉素/链霉素（pen/strep）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）以中和胰蛋白酶-EDTA，并通过反复吹打（约20−30次）使组织充分解离。</li>
	<li>在300 x g 条件下离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于4 mL含10% FBS和10 µg/mL pen/strep的DMEM培养基中。将细胞接种至60 mm培养皿，在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>对每个胚胎重复执行步骤3.5−3.10。</li>
	<li>将步骤3.11获得的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）培养至少3−4天。 
	注意： 此阶段的MEFs也可冻存，用于后续实验。</li>
	<li>为确定每个胚胎的性别和基因型，使用从胚胎头部提取的DNA，按照表1中列出的引物和PCR条件进行基因型PCR分析。</li>
</ol>
4. 使用基于荧光激活细胞分选的检测方法验证XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠脑组织中绿色荧光蛋白（GFP）的表达缺失
<ol>
	<li>使用剪刀将大脑皮层与脑半球其余部分分离，并放入含有250 mM蔗糖、25 mM氯化钾（KCl）、5 mM氯化镁（MgCl2）、10 mM Tris-Cl、并添加2%多聚甲醛（PFA）和0.1%非离子去污剂的1 mL冰浴核分离介质（NIM）缓冲液中（材料表）。</li>
	<li>使用冰浴玻璃匀浆器进行匀浆。</li>
	<li>在4 °C条件下，以600 × g离心5分钟，使匀浆组织沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于1 mL含25%碘克沙醇的NIM溶液中。</li>
	<li>在4 mL超速离心管中加入1 mL含29%碘克沙醇的NIM溶液（样品准备好前置于冰上保存），然后小心地将1 mL样品（含25%碘克沙醇）铺于其上。</li>
	<li>在超速离心机中，4 °C条件下以9,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀物重悬于500 μL荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（含1 mM EDTA、0.05%叠氮化钠和2%牛血清白蛋白[BSA]的磷酸盐缓冲液[PBS]）中。 
	注意：样品可在4 °C保存，最长可保存1周。</li>
	<li>加入5 μL 7-氨基放线菌素D（7-AAD；50 mg/mL），室温孵育5分钟，以染色DNA。</li>
	<li>使用流式细胞术分析样品的7-AAD和绿色荧光蛋白（GFP）信号。</li>
</ol>
5. 确定XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠模型用于Xi再激活的可行性
<ol>
	<li>在6孔板和腔室载玻片中接种步骤3.12获得的雌性XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEFs、Mecp2/Mecp2-Gfp MEFs和Xist-Mecp2/Y MEFs，密度为1 × 105 个细胞/mL，使用含10% FBS和10 µg/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基，于37 °C、5% CO2条件下培养。 
	注意：Mecp2/Mecp2-Gfp MEFs和Xist-Mecp2/Y MEFs分别作为实验中的阳性对照和阴性对照。</li>
	<li>24小时后为细胞更换新鲜培养基。对于XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEFs，加入含有XCIFs抑制剂（例如0.5 μM LDN193189和2.5 μM GSK650394）的培养基，或仅加入溶剂对照。每2天更换一次含新鲜抑制剂或仅含溶剂的培养基。对于Mecp2/Mecp2-Gfp MEFs和Xist-Mecp2/Y MEFs，每2天更换一次新鲜培养基。</li>
	<li>抑制剂处理1周后，收获MEFs用于RNA提取（6孔板）或固定细胞进行免疫荧光染色（腔室载玻片）。分别使用从Mecp2/Mecp2-Gfp胚胎分离的MEFs作为阳性对照，从Xist-Mecp2/Y胚胎分离的MEFs作为阴性对照。
	<ol>
		<li>对于RNA提取，采用基于硫氰酸胍的RNA提取试剂提取总RNA，并使用逆转录酶进行逆转录。使用Mecp2-WT和Mecp2-GFP引物（见表1）通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测Mecp2-Gfp的表达水平，具体方法如前所述12。</li>
		<li>对于免疫荧光染色，使用抗GFP一抗（1:100）对MEFs进行染色，具体方法如前所述12,16。通过定量免疫荧光法测定药物处理的XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEFs中的GFP荧光强度，具体方法如前所述18。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 在XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠模型大脑中演示药理学Xi再激活
<ol>
	<li>准备药物和溶剂对照。
	<ol>
		<li>为脑部注射准备新鲜的无菌溶剂溶液（0.9% NaCl、0.5%甲基纤维素、4.5%二甲基亚砜 [DMSO]）。</li>
		<li>准备化学抑制剂，包括1.5 mM LDN193189（ACVR1的小分子抑制剂）和1.6 mM GSK650394（SGK1的小分子抑制剂，PDPK1的下游效应分子），用溶剂（0.9% NaCl、0.5%甲基纤维素、4.5% DMSO）重悬，或仅使用溶剂作为对照。每只动物每次注射的化学抑制剂或溶剂总体积为10 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于脑部注射的动物。
	<ol>
		<li>使用消毒剂（10%次氯酸钠溶液）擦拭实验台和加热垫，准备手术区域。</li>
		<li>通过腹腔注射给予4周龄小鼠氯胺酮/赛拉嗪混合物进行麻醉，剂量分别为140 mg/kg和10 mg/kg。使用足底回缩反射判断麻醉深度。</li>
		<li>麻醉诱导后，在眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。</li>
		<li>剃除小鼠从颈部至头顶的毛发。</li>
		<li>将小鼠置于立体定位仪平台上，将其门齿钩入鼻夹的咬杆中，并收紧鼻夹固定鼻部，确保小鼠头部处于水平平面。</li>
		<li>根据需要调整耳棒高度，使其到达耳道后部，并固定耳棒，确保小鼠头部处于水平且在手指触碰时保持不动。</li>
		<li>交替使用局部抗菌剂（如聚维酮碘和70%乙醇）擦拭小鼠头部进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>给药。
	<ol>
		<li>使用无菌手术刀在颅顶正中做一条0.75 cm的水平切口。</li>
		<li>使用0.45 mm钻头，在左右大脑半球上方对称钻出两个孔（距矢状缝2 mm，距人字缝2 mm，约位于顶骨中部）。</li>
		<li>将10 μL注射器牢固地固定在立体定位仪平台上。</li>
		<li>混匀化学抑制剂溶液，并吸取10 μL溶液至注射器中，避免注射器内产生气泡。</li>
		<li>将注射器针头插入钻孔中，保持针头与颅骨垂直（90°）。当针头穿过颅骨时，将立体定位仪数字显示器的坐标归零，然后继续推进针尖至2.5 mm深度。</li>
		<li>将针头回撤0.5 mm，使最终深度为2 mm。</li>
		<li>缓慢注射10 μL溶液（约1分钟）。注射完成后，将针头留在脑内约1分钟，然后拔出针头。</li>
		<li>对另一侧半球重复注射（仅溶剂对照）。</li>
		<li>使用缝线或“皮肤胶”闭合小鼠皮肤切口（若伤口&#62; 0.5 cm，应同时使用缝线和“皮肤胶”）。</li>
		<li>松开耳棒，将小鼠从立体定位仪中取出。</li>
		<li>给予镇痛药（Buprenorphine SR 0.5 mg/kg 腹腔注射），并将小鼠置于设定为37 °C的加热垫上，直至动物恢复意识。</li>
		<li>当小鼠清醒并有反应后，将其转移回原笼中。</li>
		<li>每2天重复一次操作，持续20天。后续注射无需重复钻孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离小鼠脑组织。
	<ol>
		<li>完成给药方案后，在CO2麻醉箱中处死小鼠。</li>
		<li>用针将小鼠固定在操作表面上。</li>
		<li>使用剪刀和镊子在肋骨下方沿体壁和腹壁做侧向切口。小心分离肝脏与膈肌。</li>
		<li>用剪刀剪开膈肌，并沿整个肋骨长度继续剪开，以暴露胸膜腔。</li>
		<li>用剪刀在左心室后端做切口。</li>
		<li>立即开始向右心室注射约15 mL PBS，持续约2分钟。肝脏颜色由红色变为淡粉色表明灌注良好。</li>
		<li>向小鼠右心室注射约10 mL含4%多聚甲醛的PBS溶液，持续约2分钟。</li>
		<li>将小鼠断头，用剪刀沿颅顶正中剪开头皮以暴露颅骨。</li>
		<li>将剪刀一端插入枕骨大孔，向眼眶方向横向剪开颅骨。另一侧重复此操作。尽量使剪刀保持浅层，避免损伤脑组织。</li>
		<li>用剪刀剪开小鼠两眼之间及鼻部上方的颅骨区域。</li>
		<li>用镊子轻轻剥离大脑半球上的颅骨。</li>
		<li>用刮勺托起脑组织，用剪刀小心分离固定脑组织至颅骨的脑神经纤维。</li>
		<li>将脑组织置于塑料培养皿中，切除小脑和嗅球，然后将脑组织放入装有15 mL含4% PFA的PBS溶液的离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷冻切片小鼠脑组织。
	<ol>
		<li>在4 °C条件下，用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定脑组织过夜。</li>
		<li>在4 °C条件下，用PBS溶液冲洗脑组织至少3次，每次5分钟。</li>
		<li>标记用于组织冷冻保存的一次性模具。</li>
		<li>使用剪刀和镊子剪去脑组织前端（从注射部位开始制作约5 mm的切片）。</li>
		<li>将脑组织转移至冷冻模具中，使脑前端朝下，以获得冠状切片。将装有脑组织的模具浸入最佳切割温度化合物（OCT）中。</li>
		<li>将液氮倒入10 mm塑料培养皿中，然后将装有脑组织的冷冻模具放入液氮中。 
		注意：必须按照步骤6.5.5所述方向放置组织，以指导后续脑组织切片。</li>
		<li>当OCT变为完全不透明的白色时，将冷冻的脑组织放入-80 °C冰箱中保存。</li>
		<li>切片前，将脑组织在-20 °C条件下平衡至少30分钟，然后使用冷冻切片机进行切片（厚度5−6 μm），每张载玻片贴附2−3个切片。载玻片可于-80 °C保存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用免疫荧光方法检测Xi再激活。
	<ol>
		<li>开始染色前，在4 °C条件下将脑切片干燥过夜。</li>
		<li>将载玻片浸入抗原修复液（0.1 M柠檬酸，0.1 M Tris碱，pH = 6.0）中，在100 °C加热块上孵育5分钟。</li>
		<li>在室温下用1×PBS溶液洗涤载玻片4次，每次5分钟。</li>
		<li>在封闭液（0.1 M NH<s>4</s>Cl/PBS/0.2%明胶/0.05%非离子表面活性剂）中室温孵育20分钟。</li>
		<li>在室温下用洗涤缓冲液（PBS/0.2%明胶）洗涤载玻片3次，每次5分钟。</li>
		<li>在孵育液（PBS/0.2%明胶/1% BSA）中加入抗GFP-AlexaFluor647抗体（1:100）和抗MAP2抗体（1:1,000），对脑切片进行染色，并在4 °C条件下孵育过夜。</li>
		<li>收集一抗溶液（可重复使用）。在室温下用洗涤缓冲液洗涤载玻片4次，总时长30分钟。</li>
		<li>在孵育液中加入山羊抗鸡IgG-FITC标记的二抗（1:1,000），在室温避光条件下孵育1−2小时。</li>
		<li>在室温下用洗涤缓冲液洗涤载玻片4次，总时长30分钟。</li>
		<li>在22 mm × 50 mm盖玻片上滴加含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂，然后将盖玻片倒置覆盖在载玻片上，确保完全覆盖所有组织切片。</li>
		<li>在显微镜下成像，并调整图像的对比度和亮度。采集图像，并定量分析经药物处理和溶剂处理的XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠脑半球中GFP阳性细胞的数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li>
<li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此前，已鉴定出在哺乳动物雌性细胞中选择性沉默X染色体连锁基因所必需的XCIFs12。我们进一步优化了靶向XCIFs（如ACVR1）以及PDPK1下游效应分子的高效小分子抑制剂，这些抑制剂可在小鼠成纤维细胞系、小鼠皮层神经元以及源自Rett综合征（RTT）患者的成纤维细胞系中有效重新激活X染色体连锁的Mecp2基因。这些结果表明，X染色体再激活是一种有望用于挽救X染色体连锁疾病患者基因缺陷的治疗策略；然而，其在体内的可行性仍有待验证。最近研究表明，XCIF抑制剂可在体内重新激活X染色体连锁的Mecp2基因，为此研究构建了一种非随机的XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠模型。
该方法的一个诱人特点 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 该模型的优势在于能够对X染色体失活连锁的基因进行精确定量 Mecp2 由于缺失了多个原因，导致重新激活 Xist 在母源X染色体上， XistΔ:Mecp2...

X染色体失活（XCI）是一种剂量补偿过程，通过沉默雌性个体中的一条X染色体来平衡X连锁基因的表达1。因此，失活的X染色体（Xi）会积累异染色质的特征性修饰，包括DNA甲基化以及抑制性的组蛋白修饰，例如组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）和组蛋白H2A泛素化（H2Aub）2。X染色体沉默的主要调控区域是X失活中心（Xic），该区域大小约为100−500 kb，负责X染色体的数量感知与配对、随机选择其中一条X染色体进行失活，并启动和传播染色体上的沉默信号3。X染色体失活过程由X失活特异性转录本（Xist）启动，Xist以顺式（cis）方式包被Xi，介导全染色体范围的基因沉默，并重塑X染色体的三维结构4。近年来，多项蛋白质组学和遗传学筛选研究已鉴定出更多参与XCI调控的因子，例如与Xist相互作用的蛋白质5,6,7,8,9,10,11,12。例如，先前一项无偏倚的全基因组RNA干扰筛选研究鉴定了13种反式作用的XCI因子（XCIFs）12。从机制上看，XCIFs调控Xist的表达，因此干扰XCIFs的功能会导致XCI缺陷12。综上所述，该领域近年来的进展为启动和维持X染色体失活所必需的分子机制提供了重要的认识。
XCI 调控因子的鉴定及其在 XCI 中的作用机制研究与 X 染色体连锁的人类疾病（如 Rett 综合征（RTT））直接相关13,14. Rett综合征（RTT）是一种罕见的神经发育障碍，由X连锁的甲基化CpG结合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2, MECP2）基因发生杂合突变所致MECP2主要影响女孩的）15。因为 MECP2 位于X染色体上，因此Rett综合征女孩对该基因呈杂合状态 MECP2 缺陷型，约50%细胞表达野生型，约50%细胞表达突变型 MECP2值得注意的是，RTT突变细胞含有一个处于休眠状态但为野生型的拷贝 Mecp2 在X染色体失活（Xi）上提供功能性基因的来源，若能重新激活该基因，可能缓解疾病症状。除雷特综合征（RTT）外，尚有其他多种X连锁人类疾病，其治疗策略也可能通过重新激活Xi实现，例如DDX3X综合征。
通过短发夹RNA（shRNA）或小分子抑制剂抑制XCIFs、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDPK1）以及激活素A受体1型（ACVR1），可重新激活X染色体失活中心（Xi）连锁基因12。在多种离体模型中已观察到Xi连锁基因的药物学再激活，这些模型包括小鼠成纤维细胞系、成年小鼠皮层神经元、小鼠胚胎成纤维细胞以及来自Rett综合征（RTT）患者的成纤维细胞系12。然而，Xi连锁基因的药物学再激活是否能在体内实现仍有待证实。其中一个限制因素是缺乏有效的动物模型来准确测量再激活Xi上基因的表达水平。为实现这一目标，已构建了一种XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠模型，该模型由于母源X染色体上Xist基因的杂合缺失，使得所有细胞中的Xi染色体上的Mecp2基因均带有遗传标记16。利用该模型，可在活体小鼠脑组织中定量检测经XCIFs抑制剂处理后Mecp2基因从Xi染色体的表达情况。本文描述了XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠模型的构建方法，以及利用基于免疫荧光的检测手段在皮层神经元中定量分析Xi再激活的技术流程。

<table><tbody><tr><td>小鼠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mecp2&lt;sup&gt;tm3.1Bird&lt;/sup&gt;</td><td>杰克逊实验室</td><td>#014610</td><td></td></tr><tr><td>B6;129-Xist (tm5Sado)</td><td>由西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心 Antonio Bedalov 提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22×22 mm 盖玻片</td><td>FISHERfinest (Fisher Scientific)</td><td>125488</td><td></td></tr><tr><td>32% 多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 注射器</td><td>Medline Industries</td><td>NPMJD50LZ</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>CellStar</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BioLegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵 (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A661-3</td><td></td></tr><tr><td>抗-GFP-AlexaFluor647</td><td>Invitrogen</td><td>A-31852</td><td></td></tr><tr><td>抗-MAP2</td><td>Aves Labs</td><td>MAP</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Promega</td><td>R396D</td><td></td></tr><tr><td>缓释型布托啡诺</td><td>Zoopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C-1857</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>VWR 生命科学</td><td>89510-198</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>22-034-486</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗鸡 IgG FITC 标记二抗</td><td>Aves Labs</td><td>F-1005</td><td></td></tr><tr><td>GSK650394</td><td>ApexBio</td><td>B1051</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 10&amp;mu;l 注射器</td><td>Hamilton Sigma-Aldrich</td><td>28615-U</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Ketaset</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td></td></tr><tr><td>大型钝头/钝头弯剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Cayman Chemicals</td><td>11802</td><td></td></tr><tr><td>碘克沙醇</td><td>Sigma</td><td>1343517</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl2)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M35-212</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma</td><td>M0262-100G</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的封片剂</td><td>Vectashield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>针头，26 号 × 1.25&quot;</td><td>PrecisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>Refresh Lacri-Lube</td><td>93468</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度 (O.C.T.) 包埋剂</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 混合液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 (Pen/Strep)</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 pH 7.4 (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-103-CM</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浅玻璃或塑料托盘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>皮肤胶/组织粘合剂</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>标准止血钳</td><td>精细科学工具公司</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>标准镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>直剪虹膜剪</td><td>精细科学工具公司</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn</td><td>NDC: 59399-111-50</td><td></td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔡司 AxioObserver 活细胞显微镜</td><td>蔡司</td><td>Zeiss AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm 钻头</td><td>IDEAL MicroDrill</td><td>67-1000</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScalibur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃匀浆器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵育箱</td><td>Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Leica 3050S 研究型冷冻切片机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>立体定位平台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼 Coulter Optima L-100 XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅 (37 &amp;ordm;C)</td><td>Fisher Scientific Isotemp 2239</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于药物再激活x染色体上沉默mecp2基因的非随机小鼠模型

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

X染色体失活（XCI）是指雌性个体中一条X染色体随机沉默，以实现两性之间的基因剂量平衡。因此，所有雌性个体在X连锁基因表达上均为杂合状态。XCI的关键调控因子之一是Xist，它对XCI的启动和维持至关重要。先前的研究通过大规模的功能缺失遗传筛选，已鉴定出13种反式作用的X染色体失活因子（XCIFs）。使用短发夹RNA或小分子抑制剂抑制XCIFs（如ACVR1和PDPK1）可在培养细胞中重新激活X染色体连锁基因。然而，在活体动物中重新激活失活X染色体的可行性和耐受性仍有待确定。为实现这一目标，研究人员构建了一种XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠模型，该模型由于其中一条X染色体上的Xist被删除，导致X染色体失活不再随机。利用该模型，可在小鼠大脑中定量评估XCIF抑制剂处理后失活X染色体再激活的程度。最近发表的研究结果首次表明，通过药物抑制XCIFs可在活体小鼠大脑的皮层神经元中重新激活失活X染色体上的Mecp2基因。

为了验证 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 小鼠模型在X染色体失活（Xi）再激活研究中的可行性，我们在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中测试了XCIF抑制剂介导的Xi连锁 Mecp2-Gfp 的再激活。如第3节所述，从第15.5天的 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 胚胎中分离得到雌性MEFs（图1A）。通过基因型PCR（如前所述19）（图1B）以及基于FACS的检测方法（图1C）确认了雌性 XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEFs的基因型。MEFs分别用DMSO或两种药物LDN193189和GSK650394（浓度分别为0.5 μM和2.5 μM）处理7天。药物处理后，通过qRT-PCR检测 Mecp2-Gfp 的表达水平。如 <strong cla...

本文介绍了一种建立具有非随机X染色体失活的可存活雌性小鼠模型的方案，即在100%的细胞中母源遗传的X染色体处于失活状态。我们还介绍了一种在体内检测药物诱导失活X染色体重新激活的可行性、耐受性和安全性的实验方案。

一种用于药物再激活X染色体上沉默Mecp2基因的非随机小鼠模型

X染色体失活（XCI）是指雌性个体中一条X染色体随机失活，以实现两性之间的基因剂量平衡。因此，所有……

本方案可用于构建一种非随机的小鼠模型，以在活体小鼠大脑中检测并定量X连锁失活Mecp2染色体的再激活。该模型可轻松改造，用于研究其他X连锁疾病模型中的Xi再激活，例如DDX3X综合征。我是Sanchita Bhatnagar实验室的博士后，我将与Zeming Zheng共同演示该实验流程。首先将麻醉后的小鼠置于立体定位仪平台上，使其门齿钩住鼻部固定器的咬杆。在保持小鼠头部处于水平面的同时，拧紧鼻夹。调节耳棒的高度，使其到达耳道的尾侧部分，以固定头部，防止移动。然后用局部消毒剂和70%乙醇交替擦拭头部进行消毒。当小鼠准备就绪后，使用无菌手术刀在颅顶中部做一条0.75厘米的水平切口。使用0.45毫米钻头，在矢状缝和人字缝交界处、顶骨大致中点位置，距矢状缝和人字缝各2毫米处，于左右大脑半球上方钻出两个对称的孔。将一支10微升注射器牢固地安装到立体定位仪平台上，并向注射器中加入10微升 freshly prepared 化学抑制剂。将针头插入第一个钻孔，同时保持针头与颅骨垂直。当针头穿过颅骨时，将立体定位数字显示屏上的坐标归零，并继续推进针尖，直至达到2.5毫米的深度。将针头回撤0.5毫米，至深度为2毫米处，缓慢注入全部10微升溶液，持续时间为1分钟。待所有抑制剂完全输送后，将针头在脑内保留1分钟，然后再撤出针头。使用等量溶剂作为对照，在第二个颅骨钻孔处重复注射操作，随后缝合切口处皮肤。然后将小鼠从立体定位仪转移至37°C加热垫上，并进行监测直至完全恢复。在完成给药方案后，将小鼠固定在解剖垫上。使用剪刀和镊子在肋骨下方沿侧向切开皮肤和腹壁。小心地将肝脏与膈膜分离，并沿整个肋骨长度剪开膈膜，以暴露胸膜腔。使用剪刀在左心室后端做一切口，并立即在两分钟内向右心室注入约15毫升的PBS。灌注成功时，肝脏颜色将由红色变为淡粉色。当所有 PBS 输注完毕后，在两分钟内用约 10 毫升含 4% 多聚甲醛的 PBS 对心脏进行灌注。取下头部后，使用剪刀在头皮正中做一纵向切口以暴露颅骨。将剪刀的一侧尖端插入枕骨大孔，以便从颅骨向眼部方向做一侧向切口。在颅骨的另一侧做类似的切口，尽量使剪刀末端保持在浅层位置，剪开小鼠两眼之间及鼻部上方的颅骨区域。用镊子轻轻剥离大脑半球的颅骨，并用解剖刀将脑组织抬起。仔细分离固定脑组织与颅骨的脑神经纤维，将脑组织放入塑料培养皿中。然后切除小脑和嗅球。为了获得脑组织切片，首先将脑组织置于含有4%多聚甲醛PBS溶液的15毫升离心管中，于4°C条件下固定过夜。次日早晨，用新鲜的PBS溶液在4°C条件下清洗脑组织，每次5分钟，至少重复三次。最后一次洗涤后，用剪刀和镊子去除每个半脑的前面部分，并将样品放入已标记的冷冻模具中，正面朝下。将每个组织浸入最佳切割温度介质中，然后在液氮中快速冷冻，置于10毫米的塑料培养皿内，随后于-80摄氏度保存。为确定Xi再激活，将5至6微米厚的脑组织切片浸入抗原修复液中，在100摄氏度的加热块上处理5分钟。孵育结束后，用新鲜的PBS在室温下洗涤载玻片，每次洗涤5分钟，共洗涤4次，然后将载玻片浸入封闭液中。室温孵育20分钟后，用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤3次。将组织样本在4摄氏度下与相应的一抗孵育过夜。在荧光显微镜下对切片成像，调整对比度和亮度，以便对药物处理组和对照溶剂处理组小鼠脑半球中GFP阳性细胞的数量进行定量分析。为了验证非随机X染色体失活小鼠模型在失活X染色体再激活研究中的可行性，通过基因型PCR和流式细胞术确认了雌性转基因小鼠胚胎成纤维细胞的基因型。PCR检测结果显示，药物处理可重新激活GFP标记的甲基化CpG结合蛋白2基因（即MECP2）的表达，而对照溶剂处理则不能。非随机X染色体失活小鼠模型的胚胎成纤维细胞在药物处理后而非载体处理后也表达核定位GFP，表明X染色体失活因子抑制剂可在小鼠胚胎成纤维细胞中重新激活失活X染色体上的MECP2。药物处理可在灌注药物的脑半球约30%的细胞中重新激活失活X染色体上的MECP2-GFP，而在灌注载体的脑半球中未检测到重新激活。在药物处理的脑半球中，微管相关蛋白2阳性神经元也呈GFP阳性，提示失活X染色体上的MECP2-GFP得到表达。药物方案将取决于靶点以及小分子抑制剂的效果，因此在体内实验前需先在体外优化剂量和处理方案。可利用非随机小鼠模型来测试不同药物的单独或联合使用效果。事实上，我们及其他研究者已鉴定出多个可作为药物靶点的X染色体失活相关因子。

a-non-random-mouse-model-for-pharmacological-reactivation-mecp2-on

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

非随机小鼠模型在非活性 X 染色体上对 Mcp2 的药理再激活

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

荧光原位杂交（FISH）可在细胞内天然环境中检测核酸。本文介绍一种通过FISH同时联合检测RNA和DNA的实验方案，可用于研究小鼠胚胎干细胞中的X染色体失活。...

联合DNA-RNA荧光检测 原位 杂交（FISH）技术研究分化后雌性小鼠胚胎干细胞中的X染色体失活

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蛋白质通常包含多个可发挥不同细胞功能的结构域。基因敲除（KO）无法考虑这种功能多样性。本文中，我们报道了一种基于重组介导的盒式交换（RMCE）的结构-功能研究方法，该方法应用于基因敲除的胚胎干细胞，可实现对蛋白质不同功能结构域或变异体的分子解析。...

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我们报告了一种基于小发夹RNA（shRNA）和下一代测序的技术方案，用于鉴定在小鼠细胞系中调控X染色体失活的因子，该细胞系的失活X染色体上融合了萤光素酶基因和潮霉素抗性基因，并将其连接至甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）基因。...

在失活X染色体上筛选重新激活MeCP2的shRNA文库

通过在稀疏分布的细胞群体中诱导基因的缺失或获得功能，可研究基因在脑内的细胞自主性功能。本文描述 在体 电穿孔法递送 Cre 重组酶至具有 floxed 基因的稀疏发育期皮层神经元以实现基因功能缺失 在体内.

通过诱导小鼠大脑皮层中的 Cre-lox 重组 子宫内 电穿孔

随着与人类疾病相关的遗传变异逐渐被揭示，开发能够快速评估这些已鉴定变异生物学意义的系统变得日益重要。本方案描述了利用小鼠卵母细胞评估人类基因在女性减数分裂Ⅰ期中功能的方法。...

利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能

神经传导测量是评估神经退行性疾病小鼠模型的有用工具，但通常仅用于刺激后肢坐骨神经。本文介绍了一种测量复合肌肉动作电位（CMAP）的技术 体内...

体内电生理记录小鼠运动神经元变性模型前肢复合肌肉动作电位

电化学发光免疫分析法（ECLIA）是一种用于定量检测内源性和外源性MeCP2蛋白变体的新方法，可在较宽的工作范围内产生高度定量、准确且可重复的测量结果，且批内和批间误差较低。本文介绍了在96孔板格式中进行MeCP2-ECLIA的实验方案。...

一种基于电化学发光的MeCP2蛋白变体检测方法

啮齿类动物模型是研究自闭症谱系障碍（ASD）核心行为的有力工具。本文详细阐述了两种用于模拟小鼠ASD核心特征的行为学实验：自我理毛实验，用于评估重复性行为；以及三室社交互动实验，用于记录社交功能障碍。...

评估小鼠类自闭症行为的策略

了解利用非随机X染色体失活小鼠模型进行Mecp2基因药理再激活的技术方法。该方案通过立体定位手术向小鼠脑内递送化学抑制剂，实现失活X染色体上Mecp2-GFP的再激活表达，为Rett综合征等X连锁神经发育疾病的基因治疗研究提供重要的实验工具。

一种用于药物再激活X染色体上沉默Mecp2基因的非随机小鼠模型

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