Name: 组合 miRNA 治疗调节细胞周期和血管生成的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 了解如何使用细胞转染、RNA提取和实时定量PCR技术分析miR-143和miR-506对肺癌细胞周期和血管生成的调控作用。该方法为癌症治疗研究提供了重要的实验基础。

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未声明任何利益冲突。

1. miR-143 和 miR-506 转染
警告：进行所述实验时，须佩戴乳胶手套、防护眼镜并穿上实验服。必要时，应在生物安全柜内操作，且需开启柜内风扇，不得阻塞通风口或扰乱层流气流。应始终按照制造商说明，将防护玻璃窗调节至适当高度。
<ol>
	<li>在生物安全柜中，将 NSCLC A549 细胞接种于 T25 cm2 培养瓶/6 孔板/96 孔板中，使用添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12K 培养基（完全培养基），于 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中过夜培养。</li>
	<li>将 miR-143 和/或 miR-506 模拟物，或阴性对照 siRNA 与转染试剂（2.4 µg miR 与 14 µL 转染试剂混合；参见材料表）在 500 µL 转染培养基和 1.5 mL 无血清无抗生素的 DMEM/F12K 培养基中悬浮，最终 miRNA 浓度为 100 nM。不同细胞系可能需要对 miRNA 用量和浓度进行优化。建议方法包括使用递增浓度的 miRNA（例如 50–200 nM）转染细胞，并检测目的基因的表达下调情况。</li>
	<li>从培养瓶/板中移除完全培养基，并用 1× PBS 洗涤一次。</li>
	<li>加入 miRNA/阴性对照-转染试剂复合物，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6 小时（孵育体积根据培养瓶规格确定）。</li>
	<li>更换为 4 mL 完全培养基，继续培养细胞 24 小时和/或 48 小时。</li>
	<li>通过胰蛋白酶消化收集转染后的细胞：每个 T25 cm2 培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 5–10 分钟，随后加入 3 mL 完全培养基终止消化。将每个培养瓶中的细胞悬液转移至单独标记的 15 mL 离心管中。操作过程需在生物安全柜中进行。</li>
	<li>以 751 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。 
	注意：弃上清时需小心操作，避免震荡离心管导致细胞丢失。</li>
	<li>加入 2 mL 1× PBS，以 751 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>重复步骤 7 和 8 一次，以彻底去除残留的培养基和上清液。 
	注意：此阶段样品可于 -80 °C 保存，或立即使用。</li>
</ol>
2. RNA 提取
<ol>
	<li>使用70%异丙醇和RNA酶去污溶液喷洒工作区域进行清洁。</li>
	<li>应使用合适的RNA提取试剂盒进行RNA提取（参见材料表）。</li>
	<li>从-80 °C取出离心管，使其解冻。加入300 µL裂解缓冲液，上下吹打以破坏细胞膜。</li>
	<li>加入等体积的100%超纯乙醇。</li>
	<li>充分混匀后转移至分离柱中。</li>
	<li>在11至16 × g 条件下离心30秒，弃去穿流液。</li>
	<li>加入400 µL洗涤缓冲液，离心以去除缓冲液。</li>
	<li>在每个样品中加入5 µL DNA酶I和75 µL DNA消化缓冲液，孵育15分钟。</li>
	<li>用400 µL RNA预处理缓冲液洗涤样品。</li>
	<li>用RNA洗涤缓冲液洗涤两次。</li>
	<li>向柱中加入无核酸酶水，离心后收集RNA。</li>
	<li>使用紫外分光光度计测定总RNA浓度。</li>
</ol>
3. 逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）
<ol>
	<li>在进行RT-qPCR之前，先合成cDNA。在测定RNA浓度后，将1 µg RNA加入到终体积为20 µL的反应体系中，在PCR管中制备cDNA。操作时应始终在洁净的实验台上进行。</li>
	<li>所有其他必需的试剂见表1。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>每样本用量 (µL)（总体积 20 µL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X cDNA Master mix</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>随机六聚体引物（Random hexamers）</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT 增强剂（RT enhancer）</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso 酶混合液（Verso enzyme mix）</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无 DNase 和 RNase 的水（DNase and RNase free water）</td>
			<td>加入 RNA 后补足至 20 µL 所需体积</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：&#160;由RNA样本合成cDNA所需的材料。&#160;为一个样本的cDNA合成配制混合液所需各组分的用量。
<ol start="3">
	<li>在热循环仪中孵育，温度条件如下：42 °C 孵育 30 分钟；95 °C 孵育 2 分钟；4 °C 保存直至收集样品。</li>
	<li>立即用于常规 PCR 或 qPCR，或将 cDNA 储存于 -20 °C。</li>
	<li>使用无 DNase/RNase 的水将引物储备液稀释至 10 µM，配制正向和反向引物溶液。</li>
	<li>根据待检测基因的样本数量，分别为每个基因配制独立的预混液。每个 cDNA 样本（qPCR 孔）的反应体系配制见表 2。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>每样本用量 (µL)（20 µL 体系）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR 预混液</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正向引物 - 10 μM</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反向引物 - 10 μM</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无 DNase 和 RNase 的水</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA 样本</td>
			<td>3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：cDNA样品定量实时PCR所需材料。&#160;配制一份qPCR反应体系所需的试剂用量。
<ol start="7">
	<li>将每个样品放入相应的孔中。</li>
	<li>设计96孔qPCR板的样品布局。针对每个样品和分析基因，需进行三个复孔反应，或至少两个复孔。</li>
	<li>使用光学透明的粘性封膜密封96孔板。</li>
	<li>短暂离心板子，使反应混合物沉降至各孔底部。</li>
	<li>按照以下热循环程序运行RT-qPCR： 
	1) 50 °C 反应 2 min 
	2)&#160;95 °C 反应 2 min 
	3)&#160;95 °C 反应 15 s 
	4)&#160;读取荧光信号 
	5)&#160;60 °C 反应 1.5 min 
	6)&#160;重复步骤3共39次</li>
	<li>在上述程序结束后，继续运行以下热循环程序以生成熔解曲线，用于判断扩增产物的单一性： 
	7) 65 °C 反应 0.31 min 
	8)&#160;+0.5 °C/循环 
	9)&#160;读取板信号 
	10)&#160;重复步骤8共60次，直至温度升至95 °C 
	11)&#160;72 °C 反应 2 min</li>
</ol>
4. 琼脂糖凝胶电泳验证单基因扩增
<ol>
	<li>用1x TBE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。</li>
	<li>在温热（约50 °C）的凝胶中加入溴化乙锭（EtBr），使其终浓度约为0.2–0.5 µg/mL。EtBr可与DNA结合，在凝胶成像仪的紫外光下使其可见。</li>
	<li>将温热的凝胶倒入配备于电泳槽中的凝胶托盘中。安装提供的梳子并固定，以形成均匀的加样孔。</li>
	<li>静置凝胶，使其在室温（RT）下冷却约30分钟。</li>
	<li>待凝胶完全凝固后，将凝胶连同托盘放入电泳槽中。</li>
	<li>向电泳槽中加入1x TBE缓冲液，直至完全浸没凝胶。</li>
	<li>使用紫外分光光度计测定PCR扩增产物中DNA的浓度。</li>
	<li>取约15 ng DNA置于小型PCR管中，加入5 µL上样染料，并加入适量无核酸酶水，使总体积达到15 µL。</li>
	<li>将DNA分子量标记物和样品加入加样孔中。</li>
	<li>以100 V电压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶长度的约75%–80%处。 
	注意：确保电泳方向为负极向正极。</li>
	<li>取出凝胶，放入凝胶成像仪中观察DNA条带。</li>
</ol>
5. 细胞周期分析
<ol>
	<li>在T25 cm2培养瓶中，每份样品接种5 × 105个细胞，并按照第1节步骤1-5所述方案进行转染。</li>
	<li>转染后24小时和48小时，用胰酶消化收集细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，并正确标记。</li>
	<li>在751 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入2 mL预冷的1× PBS，涡旋混匀后，在751 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重复使用1× PBS洗涤一次，以去除残留培养基。</li>
	<li>通过移液加入200 µL预冷的1× PBS，重悬并充分吹打使细胞沉淀完全分散。</li>
	<li>在轻轻涡旋的同时，逐滴加入2 mL预冷的70%乙醇，对细胞进行固定。</li>
	<li>室温孵育30分钟，随后将离心管置于4 °C环境中1小时。</li>
	<li>从4 °C取出离心管，在751 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>加入2 mL预冷的1× PBS，涡旋混匀后，在751 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入500 µL含碘化丙啶（50 µg/mL）和核糖核酸酶A（200 µg/mL）的1× PBS溶液。</li>
	<li>室温避光孵育30分钟。</li>
	<li>在流式细胞仪上获取数据。利用前向散射光与侧向散射光（FSC vs. SSC）图选择主要细胞群体，排除FSC与SSC密度图左下角的碎片信号以及图顶部至右上区域的细胞聚集体信号。</li>
	<li>使用适当的软件分析数据，以鉴定处于细胞周期各阶段的细胞亚群。</li>
</ol>
6. 细胞凋亡检测
<ol>
	<li>每个样品在T25 cm2培养瓶中接种5 × 105个细胞，并按照第1节步骤1-5所述方案进行转染。</li>
	<li>转染后24小时和48小时，用胰酶消化收集细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，并正确标记。</li>
	<li>以751 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>每管加入2 mL预冷的1× PBS，涡旋混匀后以751 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1× PBS重复洗涤一次，以去除残留培养基。</li>
	<li>用预冷的dH2O将10× Annexin V结合缓冲液稀释至1×。</li>
	<li>向每个样品管中加入1 mL 1× Annexin V结合缓冲液，轻轻重悬细胞。</li>
	<li>取96 µL细胞悬液加入1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>向含有细胞悬液的管中加入1 µL Annexin V-FITC偶联物和12.5 µL碘化丙啶（PI）。</li>
	<li>将细胞悬液置于冰上避光孵育10分钟。</li>
	<li>向每个样品管中加入250 µL预冷的1× Annexin V结合缓冲液进行稀释。</li>
	<li>立即使用流式细胞仪分析样品。</li>
</ol>
7. 通过抗体细胞周期微阵列进行蛋白质表达分析
<ol>
	<li>在T25 cm2培养瓶中为每个样品接种5 × 105个细胞，并按照第1节步骤1-5所述方案进行转染。</li>
	<li>转染后24小时和48小时，用胰酶消化收集细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，并做好相应标记。</li>
	<li>以751 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入2 mL预冷的1× PBS，涡旋混匀后以751 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1× PBS重复洗涤一次。</li>
	<li>加入150 µL含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，轻轻吹打以破坏细胞膜。</li>
	<li>为避免裂解缓冲液的干扰，使用厂家提供的溶剂交换柱进行缓冲液置换，将裂解缓冲液更换为标记缓冲液。</li>
	<li>采用BCA法测定总蛋白浓度。</li>
	<li>取70 µg蛋白样品，加入标记缓冲液使终体积达到75 µL。</li>
	<li>将100 µL二甲基甲酰胺（DMF）加入1 mg生物素试剂中（即生物素/DMF溶液）。</li>
	<li>向每份蛋白样品中加入3 µL生物素/DMF溶液（标记为生物素化蛋白样品），室温孵育2小时。</li>
	<li>加入35 µL终止试剂，涡旋混匀。</li>
	<li>室温孵育样品30分钟。</li>
	<li>从冰箱中取出微阵列芯片，使其在使用前于室温平衡1小时。</li>
	<li>将芯片置于培养皿中，加入3%脱脂奶粉溶液（溶于厂家提供的封闭试剂中），在室温下持续振荡孵育45分钟，以阻断非特异性结合。</li>
	<li>用ddH2O水洗涤芯片（除非另有说明，后续所有洗涤均使用ddH2O）。</li>
	<li>重复洗涤约10次，彻底去除芯片表面的封闭液。此步骤对获得均匀且低背景信号至关重要。</li>
	<li>去除芯片表面多余的水分，立即进行下一步操作，避免芯片干燥。</li>
	<li>将3%脱脂奶粉溶于偶联试剂中，配制偶联溶液。</li>
	<li>将6 mL偶联溶液加入第7.12步中制备的全部生物素化蛋白样品中。</li>
	<li>将一张芯片放入厂家提供的偶联室的一个孔中，并加入约6 mL蛋白偶联混合液。 
	注意：确保芯片完全浸没在蛋白偶联混合液中。</li>
	<li>盖上偶联室，于室温在旋转摇床中持续振荡孵育2小时。</li>
	<li>将芯片转移至培养皿中，加入30 mL 1×洗涤缓冲液，置于旋转摇床上振荡10分钟，弃去溶液。</li>
	<li>重复步骤7.24两次。</li>
	<li>按照步骤7.17和7.18所述方法，用ddH2O水充分冲洗芯片，并立即进入下一步，防止芯片干燥。</li>
	<li>在30 mL检测缓冲液中加入30 µL Cy3-链霉亲和素（0.5 mg/mL）。</li>
	<li>将芯片放入培养皿中，加入含Cy3-链霉亲和素的30 mL检测缓冲液。</li>
	<li>在旋转摇床上避光振荡孵育20分钟。 
	注意：Cy3为荧光染料，需用铝箔包裹或在避光条件下操作，以保持荧光强度。</li>
	<li>执行步骤7.24–7.26，并通过轻柔气流吹干或将芯片放入50 mL锥形管中以1300 × g离心5–10分钟使其干燥。</li>
	<li>将芯片放入芯片架中，并用铝箔覆盖。</li>
	<li>使用微阵列扫描仪，选择适当的激发和发射波长扫描芯片。对于Cy3，激发波长峰值约为550 nm，发射波长峰值约为570 nm。</li>
	<li>分析数据（参见材料表中所列软件）。</li>
</ol>
8. RNA测序
<ol>
	<li>在T25 cm2 培养瓶中，每份样品接种 5 × 105 个细胞，并按照第1节步骤1-5所述方案进行转染。</li>
	<li>转染后24小时和48小时，用胰酶消化法收集细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，并做好相应标记。</li>
	<li>按照第2节步骤1-6提取RNA。</li>
	<li>使用生物分析仪检测RNA的质量和浓度。RNA完整性评分（RIN）需高于8，并具有合适的电泳图谱，以确认RNA质量合格。</li>
	<li>从总RNA中取约2 µg样品用于RNA测序（从总RNA中富集信使RNA）。</li>
	<li>使用下一代测序仪进行测序11。</li>
	<li>对RNA测序仪生成的FASTQ文件进行质量修剪，并比对至参考基因组11。</li>
	<li>按照 &#60;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/&#62; 网站的说明，将FASTQ文件及原始读段计数数据上传至GeneBank。 
	注：此前的研究结果可参见登录号SRP133420。</li>
</ol>
9. 管腔形成实验
<ol>
	<li>按照第1节第1-5步所述方法，使用HUVEC细胞替代A549细胞，在转染后36小时评估miRNA转染的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的促血管生成潜能。</li>
	<li>用M199饥饿培养基在37 °C、5% CO2条件下对HUVECs进行4小时的饥饿处理。</li>
	<li>将低生长因子基底膜基质从-80 °C取出，置于4 °C过夜保存，使其缓慢解冻，以避免气泡形成和提前聚合。</li>
	<li>在超净工作台内，小心且缓慢地向96孔板的每个孔中加入0.04 mL低生长因子基底膜基质进行包被，避免产生气泡。</li>
	<li>向96孔板相邻的孔中加入0.1 mL PBS，以维持湿度并保持温度稳定。</li>
	<li>将96孔板在37 °C孵育至少20分钟，以完成基底膜提取物的聚合。孵育时间不得超过1小时。</li>
	<li>将各组转染后的HUVECs进行胰酶消化，并重悬于M199培养基中，调整细胞浓度至1 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>向96孔板中已聚合基底膜基质的各孔加入0.1 mL上述细胞悬液。</li>
	<li>将96孔板置于37 °C、5% CO2条件下孵育，同时在超净工作台内配制生长因子。</li>
	<li>将生长因子（VEGF）重悬至最终所需浓度的2倍（如最终浓度为2 ng/mL，则配制成4 ng/mL），并在含细胞的0.1 mL M199饥饿培养基上方加入0.1 mL含生长因子的M199饥饿培养基。对于未添加VEGF的对照孔，则在含细胞的0.1 mL M199饥饿培养基上方加入0.1 mL普通M199饥饿培养基。</li>
	<li>将96孔板在37 °C、5% CO2条件下继续孵育6小时。</li>
	<li>孵育结束后，使用连接数字相机的明场显微镜，以4倍物镜对每个孔拍摄图像。</li>
	<li>使用配备&#34;angiogenesis analyzer&#34;插件的图像分析软件处理图像19。采用节点数、交点数和总出芽长度三个参数，比较miRNA处理对血管生成的影响。</li>
</ol>

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</ol>

作者感谢路易斯安那州立大学的 John Caskey 在 RNA 测序数据通路分析方面的协助，以及德克萨斯大学西南医学中心 McDermott 中心下一代测序核心实验室在 RNA 测序和数据分析方面的工作。本研究得到了路易斯安那大学门罗分校药学院启动资金以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所基金 5 P20 GM103424-15 和 3 P20 GM103424-15S1 的资助。

miRNA 可作为癌症治疗的靶向疗法，其依据是疾病组织与正常组织之间表达水平的失调。本研究旨在确定可能在多个阶段抑制细胞周期进程的 miRNA。研究发现，miR-143 和 miR-506 能够阻滞癌细胞的细胞周期，本文所述实验方案旨在阐明这种联合 miRNA 治疗的作用机制。
所述方法可全面了解miRNA的功能。研究miRNA的挑战在于其能够靶向多个基因，从而影响多条信号通路。如果在处理前已确定特定靶点，则可通过所述qPCR分析鉴定特定目的基因的表达情况。例如，本研究的重点是CDK1和CDK4/6的表达及其对细胞周期的影响。
因此，使用碘化丙啶（propidium iodide）和流式细胞术进行细胞周期分析是一种可靠的方法，可根据细胞在细胞周期中的不同阶段检测细胞群体的变化。该方法基于碘化丙啶（PI）与DNA结合后产生的荧光信号强度与其DNA含量成正比，从而反映细胞所处的周期阶段。简言之，处于S期的细胞正在合成DNA，其荧光信号强于G0/G1期的细胞；而处于G2期的细胞已完成DNA复制，因此产生最强的荧光信号。
<p...

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George Matthaiolampakis
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George Mattheolabakis

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Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

细胞周期是一系列调控事件的组合，通过有丝分裂过程实现DNA复制和细胞增殖1。周期蛋白依赖性激酶（CDKs）可调控并促进细胞周期进程2。其中，有丝分裂期CDK（CDK1）和间期CDKs（CDK2、CDK4和CDK6）在细胞周期进展中发挥关键作用3。视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）被CDK4/CDK6复合物磷酸化，从而促进细胞周期进程4，而CDK1的活化对成功完成细胞分裂至关重要5。过去几十年中，多种CDK抑制剂已被开发并在临床试验中进行评估，显示出靶向CDK在癌症治疗中的潜力。事实上，最近已有三种CDK抑制剂被批准用于乳腺癌治疗6,7,8,9,10。因此，CDKs，特别是CDK1和CDK4/6，在调控癌细胞进展方面具有重要意义。
miRNA（miR）是一类小型非编码RNA，可在转录后水平调控基因表达，调控约30%的人类基因11。其作用机制主要通过抑制信使RNA（mRNA）的翻译或促进其降解来实现12。miRNA具有重要的生物学意义，目前已鉴定出超过5,000种miRNA，且单个miRNA分子可调控多个基因11,13。更重要的是，miRNA的表达水平与多种疾病及其疾病状态相关，包括癌症13。事实上，miRNA已被界定为具有致癌性或肿瘤抑制功能，能够促进或抑制肿瘤的发生与发展14,15。miRNA在病变组织中的相对表达水平可影响疾病的进展，因此，外源性递送miRNA具有潜在的治疗价值。
肺癌是癌症相关死亡的首要原因，其中超过60%的肺癌病例为非小细胞肺癌16,17，其5年生存率低于20%18。近期研究评估了miR-143-3p和miR-506-3p在靶向肺癌细胞周期中的应用11。miR-143和miR-506的序列分别与CDK1以及CDK4/CDK6互补，本研究分析了这两种miRNA对A549细胞的作用。本文详细描述并讨论了实验方法。在转染后的不同实验设计和时间点，评估了基因表达、细胞周期进程和细胞凋亡。我们采用实时定量PCR（RT-qPCR）和微阵列分析来检测特定基因的表达水平，并利用下一代RNA测序技术分析全基因组范围的基因表达失调情况11。后一种方法具有高灵敏度和可重复性，可精确测定每个基因转录本的相对丰度，且单次实验即可分析数千个基因。此外，本文还进行了miRNA处理诱导的凋亡分析并予以描述。生物信息学方法辅助完成了信号通路分析。本文展示了用于评估联合使用miR-143与miR-506治疗潜力的实验方案。
本实验方案的主要目的是研究miRNA在细胞中的作用，重点关注细胞周期。本文介绍的技术范围广泛，从翻译前的基因表达分析（使用qPCR）到蛋白质水平的复杂且新颖的基因分析技术（如微阵列分析）。希望本报告能为从事miRNA研究的科研人员提供帮助。此外，本文还提供了用于细胞周期和细胞凋亡分析的流式细胞术方法。

<table><tbody><tr><td>-80 &amp;deg;C 冰箱</td><td>VWR</td><td>VWR40086A</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>CELLTREAT Scientific&amp;nbsp;</td><td>50-607-511</td><td></td></tr><tr><td>96 孔微量培养板&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>A549 非小细胞肺癌细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>VWR</td><td>0710-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938c</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Silencer 阴性对照 No. 1 siRNA</td><td>Ambion</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液（100 倍）</td><td>Gibco</td><td>15240-062&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗体芯片检测试剂盒，2 次反应</td><td>Full Moon Bio</td><td>KAS02</td><td></td></tr><tr><td>明场显微镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Microscoptics&amp;nbsp;</td><td>IV-900</td><td></td></tr><tr><td>明场显微镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>New Star Environment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞周期抗体芯片，2 张芯片</td><td>Full Moon Bio</td><td>ACC058</td><td></td></tr><tr><td>Cell Logic+ 生物安全柜</td><td>Labconco</td><td>342391100</td><td></td></tr><tr><td>Cellquest Pro</td><td>BD bioscience</td><td>步骤 5.14；6.13：用于根据细胞周期&amp;nbsp; 阶段计算细胞群体分布，以及&amp;nbsp; 计算细胞凋亡分析中的群体分布&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 实时系统</td><td>BioRad</td><td>CFX96 光学模块</td><td></td></tr><tr><td>Chemidoc Touch 成像系统</td><td>BioRad</td><td>Chemidoc Touch 成像系统</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 低生长因子基底膜基质</td><td>Trevigen</td><td>3433-010-01</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>AmScope&amp;nbsp;</td><td>FMA050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L 葡萄糖，不含丙酮酸钠，含 L-谷氨酰胺</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Zymo Research</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长补充剂（ECGS）</td><td>BD Biosciences</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 移液器 Pick-A-Pack 套装</td><td>Eppendrof</td><td>05-403-152</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，绝对（200 证明），分子生物学级&amp;nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Alfa acar</td><td>L07462</td><td></td></tr><tr><td>F-12K 营养混合物（Kaighn 改良型），含 L-谷氨酰胺，Corning</td><td>Corning</td><td>45000-354</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur 流式细胞仪</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 - 优质</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Basix 微量离心管，带标准 snap caps</td><td>Fisherbrand Basix</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II 水套式 CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肝素溶液（5000 U/mL）</td><td>Hospira</td><td>NDC#63739-920-11</td><td></td></tr><tr><td>水平电泳系统</td><td>Benchtop lab system</td><td>BT102</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-143-3p miRNA 模拟物</td><td>ABM</td><td>MCH01315</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-506-3p miRNA 模拟物</td><td>ABM</td><td>MCH02824</td><td></td></tr><tr><td>人重组血管内皮生长因子（VEGF）</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）</td><td>个体供体</td><td>IRB# A15-3891</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 磷酸盐缓冲盐水（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity 通路分析</td><td>Qiagen</td><td>结果：用于生物信息学通路分析</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10-977-015</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11-668-027</td><td></td></tr><tr><td>上样染料 10X</td><td>ward's science+</td><td>470024-814</td><td></td></tr><tr><td>Medium M199（含 Earle&amp;prime;s 盐、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>显微镜数码相机</td><td>AmScope&amp;nbsp;</td><td>MU130</td><td></td></tr><tr><td>Modfit LT</td><td>Verity Software</td><td>步骤 5.15：用于分析细胞周期群体分布的替代软件</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop one C</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 10/10</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>B21210</td><td></td></tr><tr><td>Power UP sybr green 主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>MP Biochemicals LLC</td><td>IC19545825</td><td></td></tr><tr><td>Proscanarray HT 微阵列扫描仪</td><td>Perkin elmer</td><td>ASCNPHRG。我们使用 543 nm 激光激发波长。</td><td></td></tr><tr><td>q PCR 光学粘性封膜</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>牛胰核糖核酸酶 A</td><td>Sigma</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express</td><td>PerkinElmer</td><td>步骤 7.33：微阵列分析软件</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp 热循环仪</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraTube 离心管 15 ml</td><td>VWR</td><td>470224-998</td><td></td></tr><tr><td>SpectraTube 离心管 50 ml</td><td>VWR</td><td>470225-004</td><td></td></tr><tr><td>TBS 缓冲液，20x 液体</td><td>VWR</td><td>10791-796</td><td></td></tr><tr><td>温度控制&amp;nbsp; 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>温度控制微量离心机</td><td>Eppendrof</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific BioLite 细胞培养处理烧瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-009</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI23225</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce RIPA 缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89900</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Thermo-Fast 96 孔全裙边板</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0800WL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Verso cDNA 合成试剂盒（100 次反应）</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>超低范围 DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>VWR 标准实心门实验室冰箱</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

联合mirna治疗调控细胞周期与血管生成的分析

Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

肺癌（LC）是全球癌症相关死亡的首要原因。与其他癌细胞类似，肺癌细胞的一个基本特征是不受调控的增殖和细胞分裂。通过阻滞细胞周期进程来抑制增殖，已被证明是包括肺癌在内的癌症治疗的一种有前景的策略。
miRNA 治疗剂已成为重要的转录后基因调控因子，并在癌症治疗研究中受到日益关注。在近期研究中，我们利用两种 miRNA（miR-143 和 miR-506）调控细胞周期进程。对 A549 非小细胞肺癌（NSCLC）细胞进行转染，分析基因表达变化，并最终评估治疗所诱导的凋亡活性。检测到周期蛋白依赖性激酶（CDKs）表达下调（即 CDK1、CDK4 和 CDK6），细胞周期停滞于 G1/S 和 G2/M 期转换阶段。通路分析表明该治疗可能具有抗血管生成活性，使该策略具备多方面的生物学效应。本文详细描述了用于鉴定 miRNA 在抑制细胞周期、诱导凋亡以及通过抑制血管生成影响内皮细胞方面活性的研究方法。希望本文所呈现的方法能够支持未来关于 miRNA 治疗剂及其生物学活性的研究，且所提供的代表性数据可为其他研究人员开展实验分析提供指导。

使用RT-qPCR和凝胶电泳进行基因表达分析
使用RT-qPCR进行差异基因表达分析，结果显示靶基因CDK1、CDK4和CDK6显著下调。CDK1和CDK4/6分别在G2/M期和G1/S期转换过程中发挥关键作用。本研究的分析方法实现了单个miR与联合miR作用效果的直接比较。采用乱序siRNA与转染试剂共同处理，以评估转染操作本身对基因下调检测结果可能产生的干扰，结果表明干扰极小。数据采用双尾t检验进行统计学分析。 t-测试，以及p &lt; 0.05 被认为具有统计学意义（图1）。在进行 qPCR 之前，使用 Primer-BLAST 对引物序列进行评估 &lt;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/&gt; 用于单基因扩增。通过凝胶电泳分析扩增产物也证实了这一点。...

miRNA 治疗在调控癌症进展方面具有重要意义。本文展示了用于鉴定联合 miRNA 治疗在抑制细胞周期和血管生成中活性的分析方法。

联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析

肺癌（LC）是全球癌症相关死亡的首要原因。与其他癌细胞类似，LC细胞的一个基本特征是……

该方法将有助于理解并掌握在体外鉴定两种微小RNA在肺癌细胞中活性所必需的实验技术。肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因。本文介绍的技术涵盖了从基础实验方法到更为复杂的实验方案，如基因表达分析和抗体蛋白微小RNA检测，这些技术专门用于鉴定微小RNA作用效果。以下方法将帮助我们解答关于两种微小RNA（microRNA 143和microRNA 506）对肺癌细胞周期调控作用的关键问题。我们将展示多种实验技术，包括细胞转染、RNA提取、实时定量PCR以及微小RNA分析。我们希望本演示能够有助于成功完成这些分析。首先，将培养的细胞接种于适合进行RNA和蛋白质提取的适当培养瓶中，以用于后续通过qPCR或微阵列分析进行基因表达检测。然后，在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的培养基中过夜培养。次日，通过将microRNA 143和microRNA 506分别用培养基稀释至各100 nmol/L的浓度，制备用于转染的microRNA样品。从培养箱中取出培养瓶，弃去培养基，用1×PBS洗涤。所有未处理的对照组仅包含不含血清的培养基和细胞。将细胞置于转染培养基中，在培养箱中孵育6小时。6小时后，移除培养基，并更换为4毫升新鲜的完全培养基。分别在24小时和48小时后通过胰蛋白酶消化法收集细胞。接下来，每管用 1× PBS 洗涤两次，并移除上清液。如需在后续时间进行 RNA 提取，请将细胞在 -80 摄氏度下冷冻保存。RNA 提取采用 RNA 试剂盒，按照制造商提供的说明书操作。首先，从负80摄氏度取出试管，使其解冻。加入300微升裂解缓冲液，上下吹打以破坏细胞膜。加入等体积的100%超纯乙醇。然后充分混匀并置于不同的柱中。离心后弃去穿流液。加入400 µL洗涤缓冲液，离心以去除缓冲液。每个样本中加入5 µL DNA酶1和75 µL VNA消化缓冲液，孵育15分钟。然后用400 µL RNA提取缓冲液洗涤样本，随后用RNA洗涤缓冲液洗涤两次。现在，向柱中加入无核酸酶的水，离心后收集RNA。测定RNA浓度。在此阶段，可将2微克RNA样本用于RNA测序。根据文中的方案，使用热循环仪制备cDNA。用无DNA酶和RNA酶的水配制正向和反向引物溶液，浓度为10微摩尔。根据待检测样本数量，为每个基因配制相应的主混合液。每种 cDNA 样本的反应量均根据文中所述表格确定。将各样本分别加入对应的孔中。进行 qPCR 时，建议预先准备一份包含 96 孔板布局的 Excel 文档，以便追踪样本位置。针对每个样本和待分析的基因，需进行三个复孔检测，至少也应设置两个复孔。使用透明、光学清晰的塑料封膜密封反应板。避免用手接触封膜的薄层塑料表面，以免产生非特异性信号。快速离心反应板，使所有试剂混匀并沉降至各孔底部。随后，使用定量实时PCR仪运行样本板。获取qPCR仪生成的CT值，并进行相对基因表达分析。按照本视频前面部分所述方法转染细胞。将每个样品的细胞分别收集到15毫升无菌离心管中，用于胰蛋白酶消化。随后，用1×PBS洗涤细胞两次，每次在751×g离心5分钟，然后弃去上清液。用移液枪加入200微升预冷的1×PBS，重悬并吹散细胞沉淀。在轻轻涡旋振荡的同时，逐滴向离心管中加入2毫升70%预冷乙醇，以固定细胞。室温孵育30分钟，然后置于4摄氏度环境中1小时。从4摄氏度取出试管并离心。加入2 ml 冰冷的PBS，涡旋混匀，然后通过离心去除上清液。在每个样品中加入500微升含碘化丙啶和核糖核酸酶A的1×PBS，其中碘化丙啶和核糖核酸酶A的浓度分别为50和200微克/毫升，于室温孵育30分钟。将样品转移至适当的试管中，避光保存，并进行流式细胞仪检测。本实验旨在鉴定经microRNA处理后所有细胞周期通路相关蛋白表达的变化。按照转染部分所述步骤收集蛋白样品，并使用BCA法进行定量。实验前一小时将载玻片从负四摄氏度取出，使其恢复至室温并去除水分。取 70 微克蛋白质样品，按照制造商说明书制备样品载玻片，文本部分也对此进行了逐步说明。需注意的是，使用超纯去离子水彻底清洗载玻片是另一个重要步骤，这有助于降低载玻片的背景信号。此外，在本实验中，直到最后一步之前都绝不能让样本载玻片干燥。最后，使用微阵列仪器扫描载玻片并分析数据。对经微小RNA处理的样本进行qPCR分析，以测定CDK1、CDK4和CDK6的基因表达水平。这些基因调控正常细胞和癌细胞的细胞周期，并已被作为抑制肿瘤进展的靶点。实验数据表明，经 microRNA 143 和 506 处理后，这些基因表现出下调效应。流式细胞术的细胞周期分布数据显示，经 microRNA 143 和 506 联合处理后，G0 和 G1 期细胞比例增加，S 期细胞比例减少。细胞周期特异性微阵列分析检测到约60个基因的蛋白质表达变化。所示热图显示，多个对细胞周期进程和增殖至关重要的基因在蛋白质水平上发生下调，例如CDK2、Helen 1和3、RE2F1。相反，通常因其生长抑制作用而被认知的蛋白质则表达上调。尽管结果是半定量的，还需要进一步分析，但微阵列分析能够快速概览通路的活性。我们相信，在观看本视频后，您将能够开展基础乃至复杂的实验室实验，从而帮助您鉴定细胞中微小RNA的活性。

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组合 miRNA 治疗调节细胞周期和血管生成的分析

靶标ID文库是一种基于质粒的全基因组克隆cDNA集合，用于鉴定miRNA靶标。本文将展示其使用方法与应用。...

使用 MISSION Target ID 文库进行全基因组 miRNA 靶点筛选

本视频介绍了从转染了miRNA的肺癌细胞中提取RNA的实验方案。该方法可用于鉴定联合miRNA治疗在阻滞细胞周期和血管生成中的作用。...

RNA提取实验：一种从转染miRNA的肺癌细胞中提取RNA的方法

细胞周期分析：研究miRNA转染肺癌细胞中细胞周期调控的方法

本视频介绍了利用抗体微阵列检测特定基因表达，以研究转染miRNA的肺癌细胞中蛋白质表达水平的技术。在本视频展示的实验方案中，我们采用抗体微阵列来鉴定联合miRNA治疗在抑制细胞周期和血管生成中的活性。...

抗体芯片：一种研究经miRNA处理的肺癌细胞中蛋白质表达的技术

本视频展示了在原位小鼠模型中将miRNA抑制剂作为抗肿瘤生长治疗剂的体内递送方法。通过瘤内注射合成的miRNA抑制剂（antagomiR），可使其结合并抑制内源性miRNA，从而导致mRNA上调并抑制肿瘤生长。...

使用miRNA抑制剂模拟肿瘤内治疗：一种在小鼠模型中分析miRNA抑制剂对肿瘤生长影响的方法

体外诱导内皮-间充质转化（EndMT）的实验方案，可用于研究参与EndMT的细胞信号通路。在此实验模型中，通过TGF-β处理MS-1内皮细胞以诱导EndMT。...

转化生长因子-β信号诱导的内皮-间充质转化的分子分析

本报告描述了一种快速且可靠的细胞miRNA mRNA靶标验证方法。该方法利用合成的生物素标记的锁核酸（Locked Nucleic Acid,...

基于生物素的下拉实验验证细胞miRNA的mRNA靶标

本实验方案采用基于探针的实时聚合酶链式反应（PCR）、磺酰罗丹明B（SRB）检测、3’非翻译区（3’...

一种体外评估肿瘤细胞中microRNA水平、功能及相关靶基因的实验方案

本文介绍了一种用于表征具有生物学协同作用的miRNA模块及其组装成短转录子的方法，该方法可实现基因治疗应用中的同时过表达。...

胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征及其在基因治疗中的人工簇构建

本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35...

用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA...

通过锁核酸进行微小RNA的扩增与识别 原位 杂交作为一种新型检测与定量方法

了解如何使用细胞转染、RNA提取和实时定量PCR技术分析miR-143和miR-506对肺癌细胞周期和血管生成的调控作用。该方法为癌症治疗研究提供了重要的实验基础。

联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析

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