建立和表征三个抗阿法替尼的肺腺癌PC-9细胞系与增加剂量的阿法替尼开发

研究新的获得性抗药机制将有助于制定更有效、更安全的治疗策略，使抗癌剂耐药性和可转性癌症患者得到治疗。不幸的是，一般没有报告耐药性未发展的情况。这种逐步剂量升级法被认为是获得获得抗性细胞的最可靠的技术。

为了确定适当的抗阿法替尼浓度，培养PC-9细胞在生长介质中生长的10厘米细胞培养处理培养皿在37摄氏度和5%的二氧化碳。每毫升生长介质浓度的4倍-10至4细胞重新悬浮PC-9细胞，并在96孔微孔中将细胞以50微升的细胞悬浮液。在细胞培养箱中过夜孵化后，每井用50微升的阿法替尼溶液治疗细胞，在6个指示浓度的复制，并在扑杀培养箱中孵育96小时后，在每井中加入15微升的MTT染料。

在细胞培养孵化器中四个小时后，在每个井中加入100微升的溶解/停止溶液，并在夜间将板回孵化器。第二天早上，在微孔板上测量570纳米的光密度。对于连续的阿法替尼暴露，培养PC-9细胞在P-100菜中含有10毫升的生长培养基，直到细胞达到亚功量。

将亚氟培养物转移到三个新的P-100菜中，每盘培养培养皿有9毫升的生长培养基，然后将细胞返回到细胞培养箱。第二天早上，在每套三种培养皿中加入0.1纳米摩尔，即半极抑制浓度的1/10。当阿法替尼处理的细胞成为亚氟，使用一毫升移液器彻底混合培养物，并转移一毫升细胞从每道菜到9毫升的新鲜生长介质，在新的P-100菜肴。

将阿法替尼的浓度增加10%至20%，在10至12个月期间，每次培养物达到亚功量时，通过逐步剂量增加剂量增加阿法替尼浓度。当达到一微摩尔的阿法替尼浓度时，进行MTT测定，以确认细胞已产生抗阿法替尼。为了确定细胞系的生长曲线，培养亲亲PC-9和细胞培养库生长培养的三种抗阿法替尼细胞系24小时。

每毫升生长介质浓度的5倍-10至三分之三细胞，在96孔微孔板中每孔的12个100微升细胞复制。然后在演示的区域性的第 0 天、1 天、2 天、3 天、5 天和 7 天执行 MTT 测定，并使用适当的统计分析软件程序绘制结果。通过逆转录酶聚合酶链分析，通过表皮生长因子受体（EGFR基因组DNA表达）的识别变化，使用DNA纯化试剂盒，使用DNA纯化试剂盒将基因组DNA从感兴趣的细胞培养物中分离。

在分光光度计上测量分离基因组DNA的25-nan-micro-1光浓度。然后使用SYBR绿色主混合放大50纳米的基因组DNA，并使用基于荧光的逆转录酶聚合酶链反应检测系统分析结果。要通过测序识别EGFR基因组DNA表达的变化，使用EGFR exons19至21的特定底基因来放大基因组DNA。

然后根据制造商的说明使用PCR纯化套件对放大的PCR产品进行净化，并排列安普利森。通过西方印迹分析，确定表皮生长因子受体蛋白表达的变化，用阿法替尼治疗细胞24小时。24小时后，每次洗涤用5毫升的冰冷PBS洗两次细胞培养。

将细胞酶在放射性免疫沉淀测定缓冲液中，辅以1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂鸡尾酒2和3，在4摄氏度下30分钟。在孵化结束时，通过离心收集酸盐。使用双辛辛酸测定来确定裂酸样品的蛋白质浓度。

将蛋白质样品在4-X样品缓冲液中调整至0.5或每微升浓度1微克，并在96摄氏度下将样品煮沸5分钟。对于样品的西部印迹分析，组装乙醇清洁的玻璃板和垫片，并加载8%聚丙烯酰胺凝胶与适当的实验补充剂模具。在凝胶聚合时，将堆叠凝胶溶液添加到适当的模具中，插入梳子，让堆叠凝胶在室温下聚合 20 至 30 分钟。

当两种凝胶聚合后，将它们放在电泳装置中，然后向油箱中加注运行缓冲液。然后将每个蛋白质样品的20至30微升体积加载到每个井中，以180伏电压运行凝胶。大约 60 分钟后停止电泳，一旦染料前部流出凝胶，用三分缓冲的盐水清洗凝胶，并辅以 Tween，进行一到两分钟。

通过半干印迹将蛋白质转移到聚乙烯氟化物膜上，以300毫安的恒定电流进行一个半小时。用 5% 脱脂干牛奶用三缓冲盐水加 Tween 溶液在室温下稀释一小时，将膜块住。接下来，在四摄氏度下用适当的抗体在四摄氏度下探测膜。

第二天早上，每次洗涤用三个10分钟的新鲜三分缓冲盐水清洗膜，然后将膜暴露在适当的二级抗体中，在室温下进行1至1个半小时。然后每次洗涤用新鲜的三缓冲盐水洗膜五次，将膜暴露在增强的化学发光溶液中，用于使用薄膜进行信号可视化。在这里，观察到的亲PC-9细胞的细胞增殖减少，以回应阿法替尼浓度增加，证实PC-9细胞对阿法替尼暴露敏感。

然而，三种抗阿法替尼细胞系中没有一种表明在阿法替尼暴露下抑制细胞增殖。与亲体 PC-9 细胞相比，阿法替尼耐抗细胞系的生长曲线明显变慢。与亲体 PC-9 细胞相比，抗阿法替尼细胞表达的 EGFR 基因组 DNA 和 EGFR 蛋白质表达水平要高得多。

EGFR测序表明，PC-9细胞在EGFR exon 19中表现出15个碱基对删除，在exon 20中表现出野生型EGFR。然而，抗阿法替尼的一细胞和两个细胞系细胞，表现出野生型EGFR exon 19的扩增。抗阿法替尼细胞系三细胞在EGFR exon 19中包含与PC-9细胞相同的15个基对缺失，但在EGFR exon 20中观察到T790M的点突变。

当抑制剂浓度接近IC-50值时，细胞生长会变得相当缓慢。不要讨论培养，因为细胞将继续逐渐扩散。这些策略旨在模拟癌症患者在临床上发展相关耐药性的条件，以评估获得性抗药机制并制定安全有效的治疗策略。