黑色素瘤患者衍生异种移植模型

与传统的基于塑料组织培养的检测相比,患者衍生的异种移植 (PDX) 模型更有力地概括黑色素瘤分子和生物特征,并更预测治疗反应。在这里,我们描述了我们用于建立新的 PDX 模型的标准操作协议,以及现有 PDX 模型的特征/实验。

PDX彻底改变了癌症实验的临床前研究。我们现在可以在实验室里模仿病人身上发生的事情。现在，我们可以研究如何克服阻力，以及如何，从长远来看，我们可以提高患者的生存。

演示程序将是敏晓。首先，将以前收集到的黑色素瘤组织转移到无菌培养皿中。使用手术剪刀、手术刀刀片和钳子，首先尽可能从正常组织中去除正常组织。

然后切除肿瘤中央的苍白白色组织识别的坏死组织。然后使用手术刀将初始肿瘤块细分为大约相等的片段，用于手术小鼠植入。如果肿瘤组织太难进行机械分离，使用手术刀尽可能精细地切碎肿瘤块，形成泥浆。

将浆料与冷汉克的平衡盐溶液一起转移到50毫升的管中，无需钙和镁离子。在摄氏4度下以220倍g离心4分钟。去除上经剂后，每克肿瘤组织10毫升加热、新鲜消化介质中重新悬浮浆料。

将管子放在37摄氏度的水浴中20分钟，每5分钟与一次性移液器进行大力混合。使用高达 50 毫升的 HBSS 洗涤浆料，在 4 摄氏度下以 220 倍 g 离心，4 分钟，然后取出上光。每克肿瘤组织加入五毫升预热 TEG 缓冲液，摇动以轻轻重新悬浮，并将管子在 37 摄氏度下放置两分钟，无需混合。

要淬火，请添加至少一个等量的冷染色介质，并在 4 摄氏度下以 220 倍 g 的离心机，在 4 摄氏度下进行 4 分钟。去除上经剂后，每克肿瘤组织加入10毫升染色介质，然后上下移液，重新悬浮颗粒。通过 40 微米细胞滤株过滤它，以获得用于小鼠注射的单细胞悬浮液。

要植入手术切除或手术活检组织，首先从NSG下背部剃毛6至8周大麻醉小鼠，留下约1.5厘米至3厘米的区域没有头发。准备肿瘤块，并在培养中将肿瘤浆分成单独的土堆进行手术植入。使用手术刀刀片，在鼠标背面的中心进行大约五毫米长的切口。

使用一对钳子，在操作员对面的切口侧皮肤上生活。用剪刀在另一只手，通过轻轻切割皮膜与小剪刀切口，将皮肤从肌肉层分离出来，从而为肿瘤组织创建一个口袋。使用手术刀刀片拿起一个肿瘤夹头，以及一个单独的肿瘤浆组织土堆，并轻轻地将组织放入创建的口袋。

然后在口袋里的肿瘤组织土堆上加入100微升的人造细胞外基质。使用两对钳子，拉起两端的切口，使伤口边缘靠近。然后应用一个或两个伤口夹来关闭伤口。

皮下注射每公斤镇痛一到五毫克。当完全愈合时，大约七天后，取出伤口夹。每周监测一次小鼠，检查有无可看的肿瘤。

一旦肿瘤达到所需的体积，使用手术钳来抬起安乐死小鼠肿瘤附近的皮肤，并使用弯曲的剪刀进行水平切割。使用钝分离技术来调动肿瘤两侧和肿瘤上的皮肤，使肿瘤暴露。使用剪刀和手术刀刀片将肿瘤与筋膜分离。

切出肿瘤，并转移到无菌的培养皿。将肿瘤切成小块，从肿瘤中去除坏死组织。为了将肿瘤组织培养成一毫米大小，请将两到三个小肿瘤片切成小于一毫米的肿瘤组织。

将所有切碎的组织转移到两毫升低温的卑鄙。加入一毫升冷冻介质，混合好。将小瓶放入干冰上预冷却的异丙醇细胞冷冻容器中，将容器存放在零下80摄氏度的冰柜中过夜，然后将小瓶转移到液氮储存中。

要捕捉冷冻组织进行下游检测，将肿瘤组织片放入低温小瓶中，立即将低温恶果放入液氮中，将小瓶存放在零下80摄氏度的冰柜中。在比较肿瘤组织生长的三种不同方法时，利用酶消化对肿瘤细胞的单细胞悬浮利用最成功。除了允许更快速的肿瘤生长，它也足以将一个初始肿瘤扩展到10至20只小鼠，而肿瘤夹头和泥浆法只能扩展到5至10只小鼠。

黑色素瘤患者衍生异种移植模型通常反映患者在治疗时表现出的药物敏感性。一种来自黑色素瘤患者的异种移植物，最初对BRAF抑制剂有反应，但最终复发，也表现出对BRAF蛋白抑制的初始敏感性，加上 MEK 激酶抑制剂，但肿瘤最终复发。在为银行准备 PDX 组织时，必须小心，因为这将确保未来 PDX 扩展、治疗试验以及表征的成功。

通过PDX材料，单细胞RNA测序、全外显子测序和蛋白质组表征，是我们实验室利用许多方法解剖治疗耐药性的方法之一。PDX技术允许研究人员研究治疗阻力使用肿瘤细胞，更好地重新综述肿瘤生物学在人类患者相对于传统的癌症模型生长在塑料。这一优势允许提供更具预测性的见解。

研究人员在处理来自人类患者的肿瘤组织时，应始终小心并使用生物安全二级预防措施。