诱导小鼠的牙周炎

我们的协议允许在可访问且受控的小鼠模型中研究周内炎。因此，此协议比患者样本或体外模型具有优势。该技术的主要优点是鼠标已经研究得很好，而且该方法在技术上在设施要求方面很简单，而且具有成本效益。

由于牙齿尺寸小，此过程具有挑战性，因此将程序可视化以了解该技术的定位和性能是有益的。在确认对头趾捏没有反应后，将鼠标放在紧闭细胞挤出聚苯乙烯泡沫表面的主导手侧，用胶带固定爪子。使用每对切口的单根橡皮筋，以及固定在闭合细胞挤压聚苯乙烯泡沫表面的长针，支撑嘴张开。

使用贴在泡沫上的封闭钳子收回右脸颊。将泡沫和鼠标放在显微镜和光源下。然后，用牙铲收回舌头，使用27测量针将25至50微升局部麻醉剂注射到粘膜褶皱中，该褶皱紧邻第一个曼迪布拉摩尔。

应观察注射部位周围的组织肿胀。要暴露纸浆，请使用任何合适的牙科马达，配备圆形高速金刚石 0.8 毫米牙科毛刺，速度为每分钟 800 发，钻钻第一右眼摩尔的遮挡部分，直到通过牙龈看到纸浆角。使用 K 或 H 文件（8 号或 10 号）刺穿纸浆，并打破覆盖中牙和近孔纸浆角的凹痕，允许将文件插入角中。

继续尽可能深入地处理纸浆内的文件，同时用文件扩大开口，通常用毛刺在牙齿的锋利边缘周围观察出的纸浆出血，并去除牙刀，以减轻实验期间的疼痛。使用微刷清洁任何碎屑。并留下反向左第一人多摩尔作为控制。

在手术后头三天，体重对动物进行重压，每天注射一次每公斤丁丙诺啡。继续监测动物在未来42天，通过称重和一般行为评估每周两到三次。在整个后续过程中，在笼子地板上的培养皿中，将用水软化的食物颗粒。

在实验结束时，使用手术剪刀和钳子收集下颚部分，包括治疗的和未处理的两侧的三个摩尔。使用钳子尽可能多地剥离软组织，在样品上留下大部分骨骼和牙齿。在 PBS 中短暂冲洗组织。

在固定4%的对甲醛之前，24至48小时。然后用新鲜的PBS冲洗样品三次。对于微计算断层扫描，或微CT分析将收获的组织放在一个直径为12毫米的管中，管中含有1.5毫升PBS。

以样品为导向，使齿和根的球状或语言表面平行于管的底部。使用海绵分离样品。用柔性薄膜覆盖管子的顶部。

选择控制文件，将能量设置为 70 千伏，强度设置为 114 微安，分辨率设置为 6 微米立方体 Voxel 大小。单击"童子军视图"。当图像出现时，单击参考线并标记样本的扫描区域，单击每个样本后添加扫描。

标记所有示例后，转到任务列表，然后选择"开始交互任务"。对于 Micro-CT 切片的轮廓，请选择表示牙齿近似中间的切片，其中存在日冕浆、两条运河的弧形纸浆和两个面食。单击等高线面板，从远点根顶点开始，通过中根顶点的中线边框，沿远根顶点的远点边界和远点根的斜边线边界，通过毛茸茸区域，将斜面边框与径向边界标记到径向的 paque apical 区域。

复制并粘贴生成的轮廓，并相应地根据位于中间切片两侧的五个切片调整轮廓。要计算为每个样本标记的轮廓的组织体积，请在 Micro-CT 评估下选择"任务"并单击 3D 评估。然后，在 3D 评估窗口中，单击"选择"并选择一个过滤器来计算组织体积。

在 Micro-CT 分析结束时，将组织从扫描仪转移到含有 1 毫升 EDTA 的微型离心管中，使用 10 天。在脱钙结束时，将样品放入含有乙醇浓度增加的组织学盒中，每浓度一小时。第二次乙醇浸入后，将样品转移到二甲苯中进行两次一小时的浸泡，然后将盒式磁带转移到60摄氏度的液体石蜡中，在化学罩中过夜，让二甲苯蒸发。

第二天早上，将脱水样品的冠和根部平行于模具底部，放在组织学阻断机中，将样品嵌入石蜡中。要获得部分，请将石蜡块样品固定到微酮切割块上，并修剪样品，直到达到感兴趣的组织。当牙齿的任何部分可见时，开始获得六微米厚的部分，调整切割角度，直到获得包括日冕和弧形纸浆和尖牙的下垂截面。

在这里，显示整个处理下脚。处理后的第一右摩尔的放大，允许观察中牙和大元角和运河入口的暴露。Micro-CT 成像可可视化中浆暴露，以及骨吸收的中分和显性近位放射性区域。

事实上，与对子相比，在经过治疗的牙齿中测量组织体积的显著周食骨吸收。组织学分析表明，在经过处理的牙齿中，牙髓本身呈现坏死，与控制组织纸浆组织相比，在H和E染色后可以清楚地观察到坏死。此外，更重要的是，在经过治疗的牙齿的周食区，观察到由免疫细胞组成的周食病变，在控制牙齿中不存在。

在纸浆暴露期间正确定位鼠标至关重要，因为正确的定位能够正确接触动物的嘴并获得最佳结果。其他的临床炎症分析方法，如免疫组织染色和传真和细胞的详细分子分析，可以按照此协议进行。该协议对于牙科研究，而且对于免疫学研究都非常重要，因为它为局部诱发炎症提供了一个内置内部控制的模型。