Name: 一种对绿色藻原体同步文化进行深入分析的多表率提取方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 了解从单一样本同时提取叶绿素、脂质、代谢物、蛋白质和淀粉的高通量方法。该技术使用模式绿藻莱茵衣藻，通过气相色谱和液相色谱分析，实现多组学综合研究并减少数据变异性。

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<span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">我们非常感谢 Gudrun Wolter 和 Änne Michaelis 提供出色的技术支持。感谢 Giavalisco 实验室所有成员给予的帮助。感谢马克斯·普朗克学会对本研究的资助，以及圣保罗研究基金会（FAPESP）为 L A Giraldi 提供的博士后资助。

1. Chlamydomonas reinhardtii 的预培养
<ol>
	<li>通过将 Chlamydomonas reinhardtii（野生型菌株 CC-1690 mt+）从 TAP 固体培养基平板转移至含有 200 mL HSM 培养基的锥形瓶中，制备预培养物12。</li>
	<li>将预培养物置于旋转摇床上，在 24 °C 及 100 µmoles·m-2·s-1 连续光照条件下培养，直至细胞密度达到约 2 × 106 个细胞/mL。</li>
</ol>
2. 在发酵罐中同步化衣藻液体培养物
注意：本实验方案中提供的参数（如温度、光照和 CO2）专用于 CC-1690 mt+ 菌株的同步化培养。若要使用其他菌株建立同步化培养体系，需测试其最适培养条件。
<ol>
	<li>将预培养物转移至发酵罐系统（参见 补充图1 （用于定制发酵罐设计），连接至循环冷却器以维持温度，并通入过滤的 CO₂ 进行鼓泡2 （体积分数2%）并在发酵罐底部用磁力搅拌子持续搅拌。</li>
	<li>为启动同步化，将发酵罐设置为12:12小时光照-黑暗循环，温度34 °C，光照强度200 µmoles·m⁻²·s⁻¹。-2·s-1 光照并确保其中含有500 mL HSM培养基培养物，细胞密度为1 × 106 细胞/毫升</li>
	<li>24小时周期结束时，将培养物重新稀释至1 x 106 以每毫升细胞数计，使用管路系统结合蠕动泵将新鲜HSM培养基以最小干扰方式加入，该系统可先将特定体积的培养物泵出，再泵入经高压灭菌的培养基。 
	注意：作为蠕动泵的替代方案，可使用接种注射器抽取培养物，同时在无菌条件下将所需体积的新鲜培养基直接加入发酵罐中。</li>
	<li>重复步骤 2.3 三次，以获得 4 个同步培养物th 接种当天</li>
	<li>为验证细胞同步性，每隔2 h取样一次，使用细胞计数器和细胞大小分析仪测量细胞密度和细胞体积（参见 材料表）。根据细胞密度，将样品稀释1:10至1:100倍，在30 – 1900 µm的尺寸范围内进行测量3.</li>
</ol>
3. 收集衣藻细胞
<ol>
	<li>标记15 mL锥形离心管，并准备一个装有液氮的杜瓦瓶。</li>
	<li>使用注射器（50 cm3）通过发酵罐的内层玻璃管收集样品。将样品分装至锥形离心管中，每管应含有10-15 × 106个细胞。记录每管转移的体积，并使用细胞计数器和细胞大小分析仪测量每个时间点的细胞密度和细胞大小（参见材料表）。</li>
	<li>在4000 × g条件下离心5分钟，使细胞成团。弃去上清液，将沉淀在液氮中速冻，随后于-80 °C保存。</li>
</ol>
4. 提取缓冲液的制备以及叶绿素、脂质和代谢物的提取
警告：甲醇（MeOH）和甲基叔丁基醚（MTBE）具有易燃性，长时间接触或暴露可能引起呼吸道、眼睛或皮肤刺激。请仅在通风橱中谨慎操作，并在提取过程中采取适当的安全措施（如穿戴实验服、护目镜、手套等）。
<ol>
	<li>提取缓冲液 1
	<ol>
		<li>在 100 mL 容量瓶中，加入 75 mL 甲基叔丁基醚（MTBE）和 25 mL 色谱纯甲醇（MeOH），混匀（体积比 3:1）。</li>
		<li>加入以下内标溶液：50 µL 皮质酮（1 mg/mL，溶于甲醇）、50 µL 1,2-二十七酰基--sn-甘油-3-磷酸胆碱（17:0 PC）（1 mg/mL，溶于色谱纯氯仿）、25 µL 氨苄西林（1 mg/mL，溶于超高效液相色谱级水）和 50 µL D-山梨醇-1-13C（1 mg/mL，溶于超高效液相色谱级水）。</li>
		<li>将提取缓冲液转移至洁净玻璃瓶中，并在使用前于 -20 °C 预冷 1 小时。提取时使用新鲜配制的溶液。该溶液可在 4 °C 下保存最多 2 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提取缓冲液 2
	<ol>
		<li>在 100 mL 容量瓶中，加入 75 mL 超高效液相色谱级水和 25 mL 超高效液相色谱级甲醇（MeOH），混匀。</li>
		<li>将提取缓冲液转移至洁净玻璃瓶中。提取时使用新鲜溶液。该溶液可在室温下保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 叶绿素、脂质和代谢物的提取
<ol>
	<li>将含有细胞沉淀（含 10–15 × 106 个细胞）的离心管置于液氮中。</li>
	<li>每管中加入 1 mL 预冷的（–20 °C）提取缓冲液 1，重悬细胞沉淀。 
	注意：此步骤需快速操作，以避免低黏度提取缓冲液蒸发。加入提取缓冲液 1 后，将离心管置于室温下。</li>
	<li>涡旋振荡，直至细胞在提取液中充分匀浆，然后将混合液分装至 2 mL 微量离心管中。</li>
	<li>将样品置于冰浴的超声波水浴仪（见材料表）中，超声处理 10 分钟。</li>
	<li>将所有样品置于 4 °C 条件下，在转速为 1000 rpm 的摇床中孵育 60 分钟。</li>
	<li>加入 650 µL 提取缓冲液 2，以诱导相分离。</li>
	<li>短暂涡旋后，在 4 °C 条件下以 20000 × g 离心 5 分钟。 
	注意：此步骤后，液体分为两相，管底出现固体沉淀。操作时需小心，避免两相液体混合。上层 MTBE 相含有脂质和叶绿素，下层相含有极性与中等极性代谢物，底部沉淀则含有蛋白质、淀粉及其他不溶性分子。</li>
</ol>
6. 分装组分
<ol>
	<li>将500 µL上层MTBE相（脂质）转移至已标记的1.5 mL离心管中。使用真空浓缩仪（见材料表）干燥样品，并于-80 °C保存至检测前。</li>
	<li>使用200 μL移液器去除残留的MTBE相。</li>
	<li>将650 µL下层相（极性与中等极性代谢物）转移至新的标记离心管中。使用真空浓缩仪（见材料表）干燥样品，并于-80 °C保存至检测前。</li>
	<li>通过移液去除多余体积，清除残留的下层相。</li>
	<li>将固体沉淀物在液氮中速冻，并于-80 °C保存以待进一步提取。</li>
</ol>
7. 极性代谢物（初级代谢物）的测定
<ol>
	<li>将极性相的干燥沉淀物（步骤 6.3）重悬于甲氧胺盐酸盐/吡啶溶液中，以对羰基进行甲氧基化。</li>
	<li>在 37 °C 下加热样品 90 分钟。</li>
	<li>按照先前所述方法13，使用 N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺（MSTFA）在 37 °C 下衍生化 30 分钟。</li>
	<li>采用气相色谱-飞行时间质谱联用技术（GC-TOF-MS）分析初级代谢物。梯度参数依据先前描述的方案14进行设置。</li>
</ol>
8. 非极性代谢物（脂质）的测定
<ol>
	<li>将非极性相的干燥沉淀物（步骤 6.1）重新悬浮于乙腈:异丙醇（7:3，v:v）的混合液中。</li>
	<li>在 20000 × g 条件下离心，并使用超高效液相色谱系统（参见材料表）在反相 C8 色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm 填料）上进行分离。两种流动相分别为：含 1% 1 M 醋酸铵和 0.1% 乙酸的水溶液（缓冲液 A），以及含 1% 1 M 醋酸铵和 0.1% 乙酸的乙腈:异丙醇（7:3）混合液（缓冲液 B）。</li>
	<li>按照先前描述的方案14设置梯度参数。</li>
</ol>
9. 叶绿素含量的测定
<ol>
	<li>将100 µL的MTBE相（步骤6.1）与900 µL的90%甲醇混合，用于方法空白以及实验样品。</li>
	<li>使用分光光度计在665 nm和652 nm波长下测定吸光度，以区分叶绿素a和叶绿素b。 
	注意：吸光度应在0.1至1之间，以确保浓度计算有效。如有必要，对样品进行稀释。</li>
	<li>根据以下公式计算叶绿素a和b的含量，以及总叶绿素含量。 
	Chla = 16.82A665 – 9.28A652 
	Chlb = 36.92A652 – 16.54A665 
	Chla=b = 0.28A665 + 27.64A652 
	注意：上述公式由Bar-Nun和Ohad15描述。</li>
</ol>
10. 蛋白质含量的提取、测定、消化与分析
注意：为重悬蛋白质，采用尿素/硫脲缓冲液（6 M 尿素，2 M 硫脲及蛋白酶和磷酸酶抑制剂）进行沉淀，并对先前描述的方案进行了修改16。然而，也可使用任何其他适宜缓冲液进行蛋白质重悬。
<ol>
	<li>使用以下浓度配制蛋白缓冲液：6 M 尿素和 2 M 硫脲。</li>
	<li>将沉淀（步骤 6.5）溶解于 200 µL 蛋白缓冲液（10.1）中。</li>
	<li>将样品在室温下孵育 30 分钟，随后在 20000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>转移含有蛋白质的上清液至新离心管中。</li>
	<li>通过 Bradford 法测定蛋白浓度17。</li>
	<li>选择合适的方案对 50 µg 蛋白进行溶液内消化。此处采用以下方案：
	<ol>
		<li>使用 5 mM DTT 还原 50 µg 蛋白样品，孵育 30 分钟，随后在避光条件下使用 10 mM 碘乙酰胺进行烷基化，孵育 30 分钟。</li>
		<li>按 25:1（质量比）加入胰蛋白酶/赖氨酰内切酶混合物（Trypsin/Lys-C Mix），混匀后于 37 °C 孵育 3 小时。</li>
		<li>使用 50 mM TrisHCl（pH 8）将样品稀释六倍，并于 37 °C 过夜孵育。</li>
		<li>加入三氟乙酸（TFA）至终浓度为 0.5–1%，以终止消化反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化完成后，在进行质谱分析前使用 C18 固相萃取小柱对肽段进行脱盐处理，并洗脱已消化的肽段18。</li>
	<li>在真空浓缩仪（见材料表）中将样品浓缩至近干，保留 2–5 µL 溶液，过程中不加热。</li>
	<li>将样品重悬于上样缓冲液（5% 乙腈，0.5% 甲酸）中，并使用连接纳米超高效液相色谱（nano-UPLC）系统的高分辨质谱仪（见材料表）进行 LC-MS/MS 分析。</li>
	<li>使用 UPLC 系统（见材料表）在一根 20 cm 长、内径为 75 μm、粒径为 1.7 μm 的反相带电表面杂化（CSH）色谱柱（见材料表）上分离肽段。</li>
	<li>上样 4 µL 样品，以 300 nL/min 的流速运行 90 分钟梯度洗脱。</li>
	<li>设置梯度程序：采用部分进样环脱机模式，初始等度洗脱阶段保持 3% 缓冲液 B（99.9% 乙腈 + 0.1% 甲酸）持续 14 分钟，随后将进样环切换至在线位置与色谱柱连接，之后在 50 分钟内线性增加缓冲液 B 至 20%。</li>
	<li>接下来的 15 分钟内，将缓冲液 B 浓度升至 30%；再接下来的 15 分钟内升至 40%，并在随后的 4 分钟内达到 90% 缓冲液 B。以 400 nL/min 的流速进行洗涤步骤（用于清洗色谱柱），并保持 10 分钟（详细梯度条件见表 1）。</li>
	<li>最后，在 1 分钟内将系统恢复至 300 nL/min 的流速和 3% 缓冲液 B 的浓度。在注入下一个样品前，平衡色谱柱 15 分钟。 
	注：LC-MS/MS 分析后鉴定出的全部蛋白质列表见表 2。</li>
</ol>
11. 淀粉含量的提取与测定
注意：对于总蛋白和淀粉含量的测定，按照先前所述的两步法10对固体沉淀物进行提取。
<ol>
	<li>向细胞沉淀（步骤 6.5）中加入 500 µL 80% (v/v) 乙醇，在 80 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>在室温下以 4000 × g 离心 10 分钟。随后将沉淀溶解于 250 µL 无菌水中，再加入 250 µL 100 mM 醋酸钠。</li>
	<li>在 99 °C 下加热 3 小时以水解淀粉。通过加入酶混合物（α-淀粉酶，每样品 4.2 单位；α-淀粉葡萄糖苷酶，每样品 10 单位）将溶解的淀粉过夜消化为葡萄糖单体。将试管在 37 °C 下过夜孵育。 
	注意：孵育后，样品可在 -20 °C 冷冻数天，或在 -80 °C 冷冻数月，之后再进行葡萄糖测定。</li>
	<li>将消化后的提取物在 20000 × g 下离心 5 分钟，并收集上清液。将上清液（含淀粉来源的葡萄糖单体）溶解于含有 5 mM MgCl2、60 mg/mL ATP、36 mg/mL NADP 和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（每样品 1 单位）的 100 mM HEPES 缓冲液（pH 7）中。</li>
	<li>为分析淀粉含量，首先在 340 nm 处测定基线吸光度。然后加入己糖激酶（每样品 1 单位）以启动反应。最后使用 96 孔板读板仪在 340 nm 处测定 NADPH+H+ 的增加量（反映淀粉消化为葡萄糖的程度）。 
	注意：340 nm 处最大值（不应超过线性范围 1）与基线之间的差值相当于消化后淀粉的葡萄糖浓度。应制作葡萄糖标准曲线以确定每毫升中葡萄糖浓度（单位为 nmol 葡萄糖/mL）。</li>
</ol>

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<li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+evolution+of+brain+lipidome+revealed+by+large-scale+analysis+of+human%2C+chimpanzee%2C+macaque%2C+and+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues.</a> Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).</li>
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<li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exceptional+evolutionary+divergence+of+human+muscle+and+brain+metabolomes+parallels+human+cognitive+and+physical+uniqueness%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001871(2014).</li>
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<li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li>
</ol>

作者无披露信息。

本文介绍了一种稳健且适用性极高的提取方案，可从单个含有10-15×106个细胞的细胞沉淀中，同时实现全面的脂质组学、代谢组学、淀粉及蛋白质组学分析。该方法已在多项研究中成功应用于多种细胞和组织10,14,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36。本文以莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，CC-1690 mt+）培养物中获取的单一生物样本为例，详细展示了一步一步进行多组学分析的操作流程。
该方案提供了一种稳健且可重复的方法，可同时处理多个样品，用于分析多种生物分子。然而，为尽量减少技术变异，必须注意若干关键步骤。首先，细胞收获应尽可能迅速进行，同时保持所有收获样品条件的一致性，以维持细胞的生物学状态。尽管我们采用离心法收获细胞，也可使用其他替代的收获策略。但需注意的是，不同的收获策略已知会影响细胞的代谢状态37，因此所有实验样品必须采用一致的收获方法。其次，应避免含有叶绿素的上层非极性相干燥，因为这可能影响溶剂中溶解叶绿素的水平，进而影响样品的归一化因子。最后，在去除残留的极性相以获得蛋白质和淀粉沉淀时需格外小心，避免扰动沉淀物，否则可能影响淀粉和蛋白质的含量。
上述提取方案为多组学数据分析提供了多种优势。除了减少所需样品分装的份数外，还能降低不同生物分子分析结果之间的变异。这使得来自初级代谢物、脂质和蛋白质组学数据的结果能够直接比较。同样，多种化合物类别的同步提取也允许对不同数据集采用一致且统一的标准化策略。当使用干重或鲜重38或细胞数量难以实现标准化时，该方法尤为适用。
该方案可用于复杂生物样本的常规筛选。这些整体性的代谢组学、脂质组学和蛋白质组学数据集可提供关于代谢系统性变化的全面信息。此外，蛋白质组学分析获得的数据能够揭示蛋白质在定量（丰度）和定性（修饰）方面的变化及其与代谢物的关系。因此，整合组学数据有助于深入揭示由遗传因素或生物及/和非生物扰动所引起的生物系统变化，从而阐明特定代谢通路或细胞过程中的分子变化。类似地，这些高通量数据还可用于识别代谢工程的靶点，并优化或验证基因组尺度代谢模型的预测结果37,39。

微藻是天然产物（如燃料、人类和动物营养、化妆品以及药理学物质）的丰富来源。目前已有大量研究致力于提高从微藻中生产高价值产物的效率1,2,3,4。要提升天然产物的质量和产量，必须首先在系统水平上理解其代谢过程5,6,7。随着功能基因组学技术的发展以及质谱分析方法的改进，现已能够同时监测成千上万的基因、转录本、蛋白质和代谢物。然而，深入的蛋白质组学、脂质组学和代谢组学研究通常需要多个样品，这在单细胞生物中往往难以实现，尤其是在进行时间序列研究时。此外，结合不同实验方案采集和处理多个样品，并获取高度复杂的组学数据（即蛋白质组、脂质组和代谢组数据），会引入实验变异性，从而使数据整合成为一项具有挑战性的任务。
衣藻 不仅为细胞过程的研究提供了优良的微生物系统，也为细胞周期与代谢协调机制的研究提供了便捷的模型。因此，通过对同步培养的衣藻进行高分辨率转录组分析，已证实转录本的表达与细胞周期之间存在显著的协调性。8约80%的分析转录本在24小时细胞周期中表现出显著的周期性8同样，两种不同品系的干重、蛋白质、叶绿素、氨基酸和脂肪酸 衣藻 在一项每4小时采样一次的研究中，这些结果被证明与细胞分裂相关。9最近有报道称，细胞的代谢物和脂质动态会根据细胞周期的特定阶段而发生变化。10. 利用稳健的甲基化方法，可监测不同生物分子中的细微变化 叔丁基甲基叔丁基醚（MTBE）：甲醇：水相萃取法，为全面的多组学分析提供了理想的起始方案10,11.
本方案介绍了一种可重复且高效的策略10，可从单一样品等分试样中同时提取脂质、代谢物、蛋白质和淀粉，用于同步生长的小球藻（Chlamydomonas）培养物的时间分辨代谢组学和脂质组学研究。除了展示该方法所获得的稳健且可重复的代谢组和脂质组数据10外，本文还验证了从同一沉淀物中获得的蛋白质组样品的质量。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂与标准品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-二十七烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (17:0 PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850360P</td><td>脂质内标</td></tr><tr><td>13C 山梨醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605514</td><td>代谢物内标，ISOTEC&amp;reg; 稳定同位素</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td>代谢物内标</td></tr><tr><td>皮质酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27840-500MG</td><td>代谢物内标，HPLC 级</td></tr><tr><td>甲醇 (MeOH)</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>13684102</td><td>ULC-MS 级</td></tr><tr><td>甲基叔丁基醚 (MTBE)</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>13890602</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/Lys-C 混合酶</td><td>Promega</td><td>V5072</td><td>蛋白质酶解</td></tr><tr><td>水</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>23214102</td><td>ULC-MS 级</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 安全锁微型离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>用于分馏</td></tr><tr><td>2 ml 安全锁微型离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td>用于样品提取</td></tr><tr><td>天平</td><td>Sartorius Corporation</td><td>14 557 572</td><td></td></tr><tr><td>发酵系统</td><td>Glasbl&amp;auml;serei M&amp;uuml;ller, Berlin, Germany</td><td></td><td>定制 800 ml 容量发酵罐</td></tr><tr><td>Q-exactive HF Orbitrap 质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td><td></td></tr><tr><td>制冷型微型离心机</td><td>Eppendorf, 型号 5427R</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>反相（RP）桥接乙基杂化（BEH）C8 色谱柱（100 mm&amp;times;2.1 mm，含 1.7 &amp;mu;m 直径颗粒）</td><td>Waters, Machester, UK</td><td>186002878</td><td>脂质分析</td></tr><tr><td>反相（RP）带电表面杂化（CSH）色谱柱（Waters），内径 75 &amp;mu;m，粒径 1.7 &amp;mu;m</td><td>Waters, Machester, UK</td><td>186007477</td><td>蛋白质分析</td></tr><tr><td>反相（RP）高强度硅胶（HSS）T3 色谱柱（100 mm&amp;times;2.1 mm，含 1.8 &amp;mu;m 直径颗粒）</td><td>Waters, Machester, UK</td><td>186003539</td><td>代谢物分析</td></tr><tr><td>振荡器</td><td>Eppendorf Thermomixer 5436</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>USC 300 TH</td><td>142-0084</td><td>标准预设超声功率，45 kHz</td></tr><tr><td>UPLC 系统</td><td>Waters Acquity UPLC 系统 (Waters, Machester, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td><td>7.008.500.002</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Vortex-Genie 2, 型号 G560</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Z2 库尔特颗粒计数与粒径分析仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605700</td><td>颗粒（细胞）体积与数量分析仪</td></tr></tbody></table>

一种用于深入分析绿色藻类chlamydomonas reinhardtii同步培养物的多组学提取方法

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

微藻因其在高价值化合物、食品和燃料生产中的应用而成为研究焦点。此外，它们是重要的光合作用研究模型，有助于理解基本的细胞过程。系统层面的研究能够全面深入地揭示生物体的分子功能。然而，蛋白质组学、脂质组学和代谢组学研究需要多个独立样本和不同实验方案，从而引入更高的误差和变异性。本文介绍了一种稳健的高通量提取方法，可从单一样本的绿藻Chlamydomonas reinhardtii中同时提取叶绿素、脂质、代谢物、蛋白质和淀粉。所展示的实验设计针对采用12小时光照/12小时黑暗条件同步化的衣藻培养物。在24小时细胞周期内连续采集样本，以证明利用多种分析平台获得的代谢物、脂质和淀粉数据具有良好一致性。此外，使用相同提取方案获得的蛋白质样本被用于开展详细的蛋白质组学分析，以评估其质量和可重复性。根据实验数据可以推断，该方法提供了一种稳健且可重复的技术路径，能够更可靠地推动基础与应用研究中对多种生物化学通路及其功能的理解。

Chlamydomonas reinhardtii CC-1690 培养物同步化 
为了展示本实验方案的代表性结果，我们提供了从同步化培养的 Chlamydomonas reinhardtii 中采集样本并提取后获得的多组学数据示例10。同步化培养的衣藻群体在特定时间点具有统一的生长阶段。本实验中，衣藻培养物在12小时光照/12小时黑暗循环、34 °C、光照强度为200 µmol·m-2·s-1、CO2 浓度为2%（v/v）的条件下进行同步化，该条件已被证实为CC-1690 mt+菌株的最优培养条件10。这些条件此前已通过多种细胞周期参数进行了优化和验证10。图1展示了使用库尔特计数器在同步化培养不同时间点测得的细胞大小分布。在光照期，细胞体积逐渐增大，至光照期末（约10小时）开始释放子代细胞，此时可观察到细胞体积分布的变化。当所有子代细胞释放完毕后，新释放的子代细胞进入下一细胞周期，细胞体积分布再次发生偏移10（图1）。
样品采集、处理与提取 
样品通过离心快速收集，弃去上清液后，沉淀可在 -80 °C 保存至提取前。如上所述（步骤 5），甲基叔丁基醚（MTBE）提取产生三个不同相：a）有机相用于测定脂质及叶绿素含量（归一化因子）；b）极性相用于气相色谱-质谱（GCMS）检测代谢物；c）沉淀用于测定淀粉含量和蛋白质。不同相的分布及其用途概览见图 2。
极性与非极性代谢物 
基于对极性组分的气相色谱-质谱（GCMS）分析，共注释了65种代谢物，涵盖氨基酸、核酸、糖酵解、糖异生、三羧酸循环、磷酸戊糖途径以及多胺类的中间产物（图3A）。对含有脂质的中性相进行液相色谱-质谱（LCMS）分析，鉴定出204种不同的脂质分子，覆盖多种脂质类别，包括磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磺基醌糖基二酰基甘油、单半乳糖基二酰基甘油、双半乳糖基二酰基甘油、二酰基甘油三甲基高丝氨酸、脂肪酸、二酰基甘油和三酰基甘油。为了可视化细胞周期中代谢物和脂质的整体变化趋势，采用了主成分分析（PCA）。PCA结果显示，代谢组学和脂质组学数据均呈现出光相与暗相的明显分离。此外，两组数据均显示出半周期性（部分开放的环状）模式（图3C、D）。该环状模式中的部分缺口可归因于细胞周期24小时时间点的样品是在黑暗条件下采集的，而细胞周期起始阶段（光照0.25小时后）的样品则是在光照条件下采集的（图3C、D）。
蛋白质和淀粉分析 
为了评估通过MTBE提取获得的蛋白质沉淀的质量，使用了6个样品进行蛋白质组学分析。通过消化每样品50 µg蛋白质所获得的蛋白质组学数据质量，采用计算性质控工具——蛋白质组学质量控制（Proteomics quality control, PTXQC）19进行评估，结果表明所有重复样本产生的蛋白质组学数据均具有良好的可重复性和高质量（补充图1）。使用REVIGO20对蛋白质的分子功能覆盖情况进行分析。共鉴定出2463种蛋白质的功能富集概况（见表2）如图4A所示。蛋白质提取后剩余的沉淀物用于淀粉的可重复定量分析，不同重复样本之间的标准偏差较低，表明定量结果具有良好的一致性（图4B）。
<img alt="随时间变化的细胞体积分布；多张图表显示了在不同时间点的延时细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：Chlamydomonas reinhardtii 细胞周期不同阶段细胞体积变化的示意图。 横轴表示细胞体积，纵轴表示细胞数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="代谢物提取过程示意图；叶绿素、脂质、代谢物、蛋白质、淀粉分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：多组学提取细胞沉淀物过程中不同相位应用的示意图。 该图改编自 Juppner, J.et al.10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="GCMS、LCMS 分析图谱；代谢物、脂质鉴定，PCA 图，组分分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：使用所述方案鉴定出的代谢物和脂质的代表性示例。（A）通过 GCMS 分析鉴定出的代谢物类别。（B）通过 LCMS 分析鉴定出的属于不同类别的脂质种类。（C）24 小时细胞周期中代谢物水平的主成分分析。（D）24 小时细胞周期中脂质的主成分分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质功能富集LCMS分析热图；随时间变化的淀粉代谢；图表；研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：蛋白质和淀粉数据的代表性示例。A) 利用LCMS分析鉴定出的蛋白质的分子功能富集结果，使用REVIGO20绘制的树状图；B) 代表性淀粉数据，展示本实验方案的可重复性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：用于温度和通气控制下莱茵衣藻培养物同步生长的发酵系统定制设计。 该图改编自 Juppner, J.等10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S1.eps">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：蛋白质组学数据质量的代表性结果。 使用计算工具PTXQC生成的热图19。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S2.eps">请点击此处下载该文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间（分钟）</td>
			<td>缓冲液B相对于缓冲液A的百分比</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 至 15 分钟</td>
			<td>从 0 到 3% 的线性梯度</td>
			<td>缓冲液A：含 0.1% 甲酸的超高效液相色谱级水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 至 75 分钟</td>
			<td>从 3% 到 30% 的线性梯度</td>
			<td>缓冲液B：含 0.1% 甲酸的 60% 超高效液相色谱级乙腈</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 至 90 分钟</td>
			<td>从 30% 到 40% 的线性梯度</td>
			<td>流速 300 nL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 至 94 分钟</td>
			<td>从 40% 到 90% 的线性梯度</td>
			<td>进样体积 4 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>94 至 104 分钟</td>
			<td>用 90% 缓冲液B清洗色谱柱</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>105 至 120 分钟</td>
			<td>在 3% 条件下平衡色谱柱 15 分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：肽样品的液相色谱梯度参数。
表2：LCMS/MS分析后鉴定出的蛋白质列表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/Table_2.xlsx">请点击此处下载该文件。</a>

对多种生物分子进行全系统分析，对于深入了解生物过程的功能与作用机制至关重要。本文详细描述了一种高通量提取方法，可从同步培养的衣藻（Chlamydomonas）单一样本中同时提取脂质、代谢物、蛋白质和淀粉。

一种用于深入分析绿色藻类Chlamydomonas reinhardtii同步培养物的多组学提取方法

微藻因其在高价值化合物、食品和燃料生产中的应用而成为研究焦点。此外，它们具有重要的……

全系统范围的研究对于深入理解生物学功能至关重要。然而，不同组学平台需要多个独立样本，这会为数据引入较高的变异性。本方法提供了一种稳健且高通量的策略，可从模式绿藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的单个样品中同时提取叶绿素、脂质、代谢物、蛋白质和淀粉。为提取叶绿素、脂质和代谢物，将收获的衣藻细胞沉淀管置于液氮中。每管中加入1 mL 20度提取缓冲液1，重悬细胞沉淀。为避免低黏度提取缓冲液蒸发，迅速涡旋振荡各管，使细胞在提取液中充分匀浆，然后将溶液分装至2 mL微量离心管中。在冰浴中超声处理培养物10分钟，然后在4摄氏度下以每分钟1,000转的速度于摇床中孵育60分钟。孵育结束后，加入650微升提取缓冲液二，短暂涡旋混匀样品，随后进行离心。分装各组分时，将上层MTBE脂质相500微升转移至已标记的1.5毫升离心管中。使用 200 微升移液器去除脂相，并将 650 微升下层极性和中等极性代谢物相转移至新的已标记试管中。吸除多余体积以去除残留的下层相，并将固体沉淀物在液氮中速冻，用于 -80 度保存。对于极性代谢物的测定，将极性相的干燥沉淀物重悬于甲氧胺盐酸盐吡啶溶液中，以对羰基进行甲氧基化，并在 30 摄氏度加热样品 90 分钟。孵育结束后，根据标准操作流程，在37摄氏度下用N-甲基-N-三氟乙酰胺对样品进行30分钟的衍生化处理。采用气相色谱-飞行时间质谱联用技术分析初级代谢物。对于非极性代谢物的测定，将非极性相的干燥沉淀物重悬于体积比为7:3的乙腈-异丙醇混合液中，然后通过离心沉淀颗粒。然后在超高效液相色谱系统上使用反相C8色谱柱分离样品。为测定叶绿素含量，将实验样品以及方法空白的MTBE相100微升与90%甲醇900微升混合。随后在分光光度计上于655纳米和652纳米波长处测定吸光度，以区分叶绿素a与叶绿素b，并计算叶绿素a、叶绿素b含量及总叶绿素含量。进行蛋白质提取时，将下层相沉淀物溶解于200微升蛋白缓冲液中，在室温下孵育样品30分钟。孵育结束后，离心样品并将含蛋白质的上清液转移至新离心管中。使用Bradford法测定蛋白质浓度。为消化蛋白质，先将15微克样品在5毫摩尔二硫苏糖醇中还原30分钟，随后在避光条件下用10毫摩尔碘乙酰胺烷基化30分钟。烷基化结束后，按蛋白质与蛋白酶25:1的比例加入胰蛋白酶/Lys-C溶液，在37摄氏度孵育3小时。然后用50毫摩尔Tris HCl将样品稀释六倍，在37摄氏度继续孵育过夜。第二天早晨，加入三氟乙酸终止消化反应，终浓度为0.5%至1%。消化完成后，在真空浓缩仪中将样品浓缩至近干，残留2至5微升溶液，过程中不加热。用上样缓冲液重新悬浮样品。使用连接纳米超高压液相色谱系统的高分辨质谱仪，通过液相色谱-串联质谱法分析肽段混合物。为分离肽段，将四微升样品加载至一根长20厘米、内径为75微米、粒径为1.7微米的反相带电表面杂化柱上。采用部分进样环的离线模式，以等度梯度（含3%缓冲液B）维持14分钟，随后将进样环切换至在线位置并与色谱柱连接，之后在50分钟内线性增加梯度，直至缓冲液B达到20%。随着细胞在光照阶段逐渐增大，可观察到细胞体积的变化，随后在光照阶段结束时（约10小时）开始释放子代细胞。当所有子代细胞释放后，可观察到细胞体积发生变化，因为新释放的子代细胞倾向于启动下一个细胞周期。根据本代表性实验中对极性组分进行的气相色谱-质谱分析，共注释了65种代谢物。对含脂质的中性相进行液相色谱-质谱分析，鉴定出204种不同的脂质分子，涵盖多种脂质类别。主成分分析可用于可视化细胞周期中代谢物和脂质的整体变化趋势，代谢组学和脂质组学数据均显示出光相与暗相的分离，以及部分周期性变化阶段。此处展示了对2,463种鉴定出的富集蛋白进行功能富集分析的概览。蛋白质提取后的剩余沉淀物可用于淀粉的可重复定量分析，不同重复样本间的低标准差表明该方法具有良好的重复性。必须避免上层叶绿素有机相干燥，因为这会影响溶剂中叶绿素的含量，进而影响样品的归一化因子。可采用多种分析方法对提取的分子物质进行生化表征。

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一种对绿色藻原体同步文化进行深入分析的多表率提取方法

衣藻（Chlamydomonas reinhardtii） 的交配与四分孢子分离用于遗传学分析

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体外重建植物与绿藻的光捕获复合物

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Agrobacterium tumefaciens介导的绿色微藻Chlorella vulgaris遗传工程

本方案为共培养体系的建立和定量监测提供了全面的指导，包括光能自养型分泌糖类的蓝细菌与异养型酵母的共培养。...

异养酵母与光合产糖蓝细菌共培养体系的构建与定量分析

了解从单一样本同时提取叶绿素、脂质、代谢物、蛋白质和淀粉的高通量方法。该技术使用模式绿藻莱茵衣藻，通过气相色谱和液相色谱分析，实现多组学综合研究并减少数据变异性。

一种用于深入分析绿色藻类Chlamydomonas reinhardtii同步培养物的多组学提取方法

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