一种对绿色藻原体同步文化进行深入分析的多表率提取方法

全系统的研究对于深入了解生物功能至关重要。但是，不同的 omics 平台需要多个独立的样本，为数据引入大量的可变性。此方法为同时从模型绿色藻类（Chlamydomonas reinhardtii）的单个样品中提取叶绿素、脂质、代谢物、蛋白质和淀粉提供了稳健和高通量策略。

对于叶绿素、脂质和代谢物提取，在液氮中排列收获的氯生多纳细胞颗粒管。将颗粒重新用一毫升20度萃取缓冲液重新填充每个管中的颗粒。为避免低粘度萃取缓冲液蒸发，快速涡流管，直到提取混合物中细胞均匀均匀，将溶液等同成两毫升微离心管。

在冰冷水中的声波浴中，声波培养10分钟，然后以每分钟1000次旋转的速度在轨道摇床上孵育，在4摄氏度下旋转60分钟。在孵化结束时，加入650微升的萃取缓冲液2，并在离心前短暂地旋转样品。要将分数等分，请将上MTBE脂质相的500微升转移到标有1.5毫升的管中。

使用 200 微升移液器去除脂质相位，将下极极和半极极代谢石相的 650 微升转移到新的标记管中。吸制多余的体积，去除剩余的下相，将液氮中的固体颗粒冷冻80度储存。为确定极性代谢物，在甲氧胺盐酸丙胺溶液中重新排放极相的干颗粒，用于碳基组甲氧化，并在30摄氏度下加热样品90分钟。

在孵育结束时，根据标准协议，在37摄氏度下用n-甲基-n-三氟乙酰胺推导样品30分钟。使用气相色谱与飞行时间质谱法耦合来分析初级代谢物。为确定非极性代谢物，将非极相的干颗粒重新悬浮在七至三体积的混合物中，以体积化为异丙醇，通过离心沉淀颗粒。

然后将样品分离到超性能液相色谱系统中的反向相位 C8 列上。对于叶绿素含量测定，将MTBE相的100微升与900微升的90%甲醇混合，用于方法空白和实验样品。然后测量655和652纳米波长的分光光度计的吸收度，以区分叶绿素 a 和叶绿素 b，并计算叶绿素 a 和 b 含量和总叶绿素含量。

对于蛋白质提取，将下相颗粒溶解在200微升蛋白质缓冲液中，并在室温下孵育样品30分钟。在孵育结束时，将样品离心，将含蛋白质的上清液转移到新管中。使用布拉德福德测定测量蛋白质浓度。

要消化蛋白质，在5毫摩尔二甲醚中减少15微克样品30分钟，然后用10毫摩尔碘多乙酰胺进行烷基化，在室温下30分钟，免受光线影响。在烷基化结束时，以25比1的蛋白质与蛋白酶的比例混合 Trypsin/Lys-C 溶液，并在37摄氏度下孵育样品3小时。将样品在50毫摩尔三叶草中稀释六倍，在37摄氏度下进行过夜孵育。

第二天早上，用三氟乙酸终止消化，最终浓度为0.5至1%后消化，将样品浓缩到接近干燥，将2至5微升溶液留在真空浓缩器中，无需加热。在加载缓冲区中重新暂停样本。使用连接到纳米超压液相色谱系统的高分辨率质谱仪，通过液相色谱串联质谱分析肽混合物。

为了分离肽，将四微升样品加载到20厘米的逆相带电表面混合柱上，内径为75微米，粒径为1.7微米。使用部分循环脱机设置，将等向梯度设置为缓冲区 B 的 3%，在循环转移到带列的联机位置之前保持 14 分钟，之后梯度将线性增加 50 分钟，直到达到 20% 缓冲区 B。当细胞在整个光相中大小增长时，可以观察到细胞体积的变化，然后从10小时开始，从光相结束时释放子细胞。

一旦所有子细胞被释放，就可以观察到细胞体积的变化，因为新释放的子细胞被处置开始下一个周期。基于对极分的气相色谱质谱分析，在这个代表性实验中，对65种代谢物进行了注释。液相谱质谱分析含脂中性相，导致识别204种不同的脂质物种，涵盖各种脂质等级。

主要成分分析可用于可视化代谢物和脂质在整个细胞周期中的全局变化，分离光和暗相以及代谢组学和脂质数据观察到的半循环相。在这里，概述了2，463种已识别的富集蛋白的功能浓缩。蛋白质提取后的剩余颗粒可用于淀粉的可重复定量，如各种复制之间的低标准偏差所示。

避免上叶绿素有机相干燥非常重要，因为这会影响溶剂中的叶绿素水平，影响样品的正常化因子。对于提取的分子物种的生化特性，可以实施各种分析程序。