¹¹C标记SNAP-7941的自动化合成与实时动力学评价的技术要点

碳-11放射性标记技术可使小分子化合物用于正电子发射断层扫描（PET），同时不改变分子结构。这对于研究受体表达水平至关重要。碳-11放射性标记的优势在于，我们能够利用PET实时直接评估SNAP与黑色素浓缩激素受体结合的动力学过程。

作为黑色素浓集激素受体拮抗剂的SNAP将有助于更深入理解该受体及其与肥胖和糖尿病等代谢性疾病之间的关联。血脑屏障上表达的外排转运体可能显著影响放射性药物在中枢受体表达成像中的应用，因此在体外评估其外排情况至关重要。

SNAP的自动化放射性合成广泛适用于带有易于标记甲基的放射性标记小分子化合物。一旦建立，该方法可适用于其他化合物。示范操作将由高级博士生Sarah Pfaff和Theresa Balber协助完成。

开始碳-11 SNAP 合成时，需在洁净的碳-11 自动合成模块中准备好相应的试剂和材料。在模块计算机上启动 SNAP 合成程序，系统将首先进行自检和预处理。在模块准备接收碳-11 前约 30 至 40 分钟，选择回旋加速器上的碳-11 二氧化碳靶，并以 65 微安的束流强度开始辐照。

模块准备就绪后，关闭内窗和外门。确认CO2捕获阱已冷却至至少40摄氏度，且甲烷捕获阱已开始冷却。当回旋加速器产生约120吉贝可的C-11 CO2后，在模块软件中点击“确定”以打开从靶区经CO2捕获阱的通路。

在回旋加速器计算机上开始将 C-11 CO₂ 输送到模块。在模块计算机上监测放射性活度的转移，并确保三分钟后开始进行 CO₂ 还原为甲烷的反应。监测生成的甲烷被吹扫至甲烷捕集阱，并通过在碘炉中循环转化为碘甲烷的过程。

在转化序列结束时等待，直至副产物从碘甲烷捕集阱排至废气中，然后单击“确定”确认反应器已准备就绪以接收放射性。监测系统，使碘甲烷从捕集阱中释放，经三氟甲磺酸甲酯炉冲洗，并捕集至反应器中。当反应器内放射性活度达到平台期时，确认捕集完成。随后等待反应混合物在75摄氏度下反应三分钟。

随后，在反应混合物冷却至35摄氏度以下并用1.5毫升水淬灭时，持续监测系统。当反应混合物被加载至HPLC进样环并注入半制备型HPLC色谱柱时，继续监测系统。在色谱过程进行期间，观察紫外和γ检测器的信号图谱。

当产物峰开始出现时，手动启动模块中的圆底收集烧瓶以收集产物。当伽马信号降至每秒约400计数以下时，手动结束收集。在氦气压力下将产物加载至固相萃取柱时，请注意观察圆底烧瓶中的液位。

当烧瓶排空且液体已通过固相萃取（SPE）柱后，单击“确定”以开始洗涤滞留在柱上的产物。随后监测产物收集瓶中的放射性，观察产物首先从柱上被洗脱进入收集瓶，然后用0.9%生理盐水溶液稀释的过程。观察在氦气压力下，产物溶液如何通过无菌滤器转移至产物瓶中。

当转移完成后，关闭产物输出阀。当放射性示踪剂到达产物小瓶后，测量其绝对放射性产率。然后使用铅屏蔽注射器将100 µL示踪剂转移至一个小瓶中用于质量控制。

将质控样品转移至屏蔽的质控工作区域。用气密注射器吸取40 µL质控样品，注入配备分析柱的预热高效液相色谱仪中，并进样。在HPLC运行期间同时进行其他质控检测。

高效液相色谱（HPLC）运行结束后，对放射性检测器所得色谱图中的所有峰进行积分，以确定 SNAP 放射化学纯度是否大于 95%；同时对紫外（UV）色谱图中的峰进行积分，以确定产物的化学纯度。利用 UV 产物峰下的面积计算其比活度。在确认产物符合使用要求后，将放射性示踪剂释放至实时动力学实验实验室。

实验前至少30分钟，用DPBS洗涤已准备好的野生型或转染细胞，并加入2毫升无血清培养基。为阻断转染细胞，加入0.98 µL浓度为20.4 mmol/L的盐酸维拉帕米外消旋体二甲基亚砜溶液。将细胞置于倾斜平面孵育30分钟。

然后打开实时检测仪器及其连接的计算机。启动控制软件并选择一个目标。将位置数设置为2，检测时间设置为3秒，检测延迟时间设置为2秒，并将第一阶段的名称设为基线。

将细胞培养皿插入装置的倾斜支架中，使细胞极位于底部。确保细胞极被细胞培养基覆盖。开始进行10分钟的背景测量，并设置文件名和路径。

将时间尺度设置为分钟，核素采集设置为碳-11。配置图表以显示背景信号、目标信号以及扣除背景后的目标信号数据。待放射性示踪剂送达并获准使用后，取少量样品进行测定。

计算所需放射性示踪剂溶液的体积，并准备好移液器。在仪器软件中暂停运行，等待培养皿停止旋转。打开设备盖子，将支撑架向左旋转90度，用已准备好的移液器加入放射性示踪剂，然后将设备恢复至初始位置。

关闭设备盖子并立即继续实验。让实验运行20分钟后结束。处理并分析数据以评估细胞对SNAP的摄取情况。

现在可对DMSO处理的对照细胞培养皿和野生型细胞系重复该步骤。实验采用不表达PGP的野生型细胞、预先用维拉帕米（作为PGP抑制剂）阻断的PGP表达细胞以及未阻断的PGP细胞进行实时动力学检测。未处理细胞与载体处理细胞之间未观察到显著差异。

碳-11标记的SNAP在野生型细胞中迅速积累，而在表达PGP的细胞中未观察到积累。使用维拉帕米预先阻断PGP外排转运蛋白后，PGP细胞中的SNAP积累量与野生型细胞相当。结合实时动力学测量，该实验体系可全面了解小分子化合物的药代动力学，因此对放射性药物的临床前研发具有重要意义。

时间安排与组织是成功进行碳-11放射性合成并随后开展实时动力学实验的关键因素，因为碳-11的半衰期仅有20分钟。由于碳-11的半衰期很短，该实验的许多步骤必须同时进行。所有参与人员都必须清楚了解各自职责的范围和时间节点。

药物安全和辐射防护在放射性药物制备过程中均至关重要。所有实验操作必须遵循合理可行尽量低原则（ALARA 原则），以限制操作人员的辐射暴露。