人类诱导多能干细胞衍生神经细胞治疗移植小鼠脑损伤控制皮质影响模型

我们的方案演示了一个全面的临床前工作流程，用于测试脑损伤后人类诱导多能干细胞的疗效。这种创伤性脑损伤模型通过严格控制机械力的参数，从而提供高度的多功能性和可重复性，从而提供明确的损伤。这些程序可用于研究其他脑区域的损伤和恢复过程，移植方法可用于多种细胞类型。

颅面钻孔具有挑战性，因为该技术需要手动灵巧，以掌握适当的压力、速度、深度和平滑运动。记录所有事件并广泛实践。要进行单方颅骨切除术，请确认麻醉小鼠对手趾捏没有反应，并保护小鼠在立体轴框架中。

使用无菌棉签和碘溶液将抗生素眼科软膏涂抹到眼睛上，以剃光头皮区域。用70%乙醇去除碘，用装饰的手术窗帘盖住动物。在头皮上做一个1.5至2厘米的中线切口，并使用无菌棉签清洁伤口，并清除中线左侧的筋膜。

使用冲击探针识别颅骨切除术位点，将 x 等于零，y 等于为 bregma 的零立体税参考点。横向调整探头到中线左侧两毫米。使用细尖手术安全标记，在假定冲击区域周围地标出一个直径为 5 毫米的圆。

将冲击器从位置升起和旋转，并完成五毫米圆。将撞击器短暂地返回位置，以验证五毫米圆的准确性。然后将冲击器提升和旋转出位置，并使用配备圆尖 0.6 或 0.8 毫米毛刺钻头的高速旋转微型电机套件手动工具，以 70% 至 80% 的最大速度在头骨上打一个开孔。

沿此边界内的五毫米圆周轮廓钻孔时，对头骨施加轻压，并使用钳子抬起生成的骨瓣。钻穿缝合线可能会带来额外的困难，因为骨骼被打断，需要额外的压力。血管可能密切关联，因此出血事件是可能的。

要引起轻度控制的皮质撞击损伤，请用无菌酒精准备垫清洁冲击探针，将冲击探针移回暴露皮层的位置。降低探头，直到它接触杜拉母体表面，并标记此位置为 z 等于零。退出活塞并移动到 z 等于负一毫米，并释放活塞以冲击皮层。

立即抬起活塞，将手臂移出位置，用大量盐水灌溉皮层，并使用简单的中断缝合和 5-0 丝缝来关闭头皮切口。然后通过皮下注射将每公斤环孢素 A 中 10 毫克，放入擦伤中，将鼠标放入清洁的预热后笼中，进行监测，直到完全恢复。大约24小时后，颅骨切除术，把鼠标放回立体轴框架。

用装饰的手术窗帘盖住鼠标。用无菌盐水将切口部位拉下，以清洁部位并松开缝合线。使用 70% 乙醇浸泡棉签轻轻消毒切口部位，并使用细钳子和眼科剪刀去除缝合线。

然后用丰富的无菌盐水灌溉手术和颅骨切除术。在细胞培养生物安全罩中，轻轻旋转或敲击细胞管，以确保细胞均匀悬浮。使用微管通过柱塞端将大约 7.5 微升的细胞加载到汉密尔顿注射器中。

将注射器以 120 度角按住，柱塞端朝下，插入柱塞，注意不要在悬架和柱塞尖端之间引入气泡。将垫片组件连接到移液器针，然后将针头连接到注射器。推动柱塞将细胞悬浮液移入移液器针，将注射器连接到立体税注射器泵。

推进柱塞，确保注射器泵组件正常工作，并将针头移入注射坐标。将针尖对齐到啤酒，然后将 x 和 y 坐标设置为零。将针头翻过颅骨切除术移动到两毫米的横向和负一毫米的后部，然后触摸针头尖到杜拉母体表面。

稍微抬起针头，然后在针头接触的位置的 dura 母体中做一个小切口。将立体轴坐标设置为 z 等于零，然后推柱塞以确认细胞悬浮液在将针头引入大脑之前流动充足。将针头引入大脑的深度为 z 等于负 1.4 毫米，将移植物放在深层皮层的灰质/白色物质边界处。

启动注射器泵，在 15 分钟内注入细胞悬浮液。使用长工作距离显微镜监测细胞悬浮液流出，在注射过程中用无菌盐水灌溉手术部位，以保持组织水化。当所有细胞都已交付后，慢慢提取移植针头，用额外的盐水灌溉手术部位，然后用新的缝合线关闭切口。

然后提供术后护理，如证明。对于胶带去除测试，首先使用一把小剃刀将黄色和红色的电气胶带切割成三条五毫米的胶带，在光滑的玻璃表面。在测试前将小鼠带进行为测试室至少 30 分钟，并使用处理布将小鼠用颈部和背部的擦伤约束小鼠，使小鼠将前爪从身体和头部拉开。

使用钳子在每个前爪的植物表面放置粘合条，并使用细腻且一致的手指压力将胶带固定到爪子上。快速将鼠标放入塑料缸中，当鼠标在塑料测试盒上全部使用四只爪子时，启动两个秒表。然后使用两个秒表记录左爪通知、左爪拆卸、右爪通知和右爪拆卸的延迟。

在这个试验实验中，仅颅切除术、控制皮质撞击损伤和天真小鼠的前肢功能进行了比较。接受手术的小鼠在手术后立即出现一到三天的胶粘剂刺激，并且从伊皮拉特前爪去除胶粘剂时出现暂时性增加的延迟。然而，与术后第28天天真的老鼠相比，受控制皮质撞击的小鼠在手术前与损伤的逆向性相比，在运动性能上表现出显著的缺陷。

人类核抗原小鼠大脑部分的免疫性损伤表明，人体细胞移植物可以清楚地与SHAM损伤和控制皮质冲击大脑中的宿主组织区分开来。在处理培养的人体细胞和处理与啮齿动物或免疫抑制药物接触的注射器针头时，必须遵守标准的实验室安全程序。脑组织部分可以分析神经炎症标记的表达，因为它是有价值的知道移植物如何影响宿主组织损伤反应，反之亦然。

我们惊讶地发现，在受伤后的行为结果中，性别差异微妙的。我们现在正在调查性是否在脑损伤的神经免疫反应中起一定的作用。稳定的手，耐心和实践是发展良好的颅骨切除术技术的关键。

不当颅骨切除术造成的附带损害可能会损害您想要靶向细胞移植的区域。