Name: 人类诱导多能干细胞衍生神经细胞治疗移植小鼠脑损伤控制皮质影响模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学习人类诱导多能干细胞治疗创伤性脑损伤的临床前工作流程，通过控制机械力参数建立可重复的小鼠皮质损伤模型。该方法适用于评估干细胞移植疗效及神经修复机制研究。

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本研究由神经科学与再生医学中心（CNRM，资助号 G170244014）的资助支持。我们感谢Mahima Dewan和Clara Selbrede在黏合剂去除预实验研究中的协助。Kryslaine Radomski完成了初步的脑损伤和细胞移植手术。美国陆军医学大学（USU）CNRM临床前研究核心实验室的Amanda Fu和Laura Tucker分别在动物手术和行为学测试方面提供了宝贵的建议。

本方案中描述的所有实验均经统一服务大学动物护理和使用委员会审查并批准。&#160;
1. 开颅术与控制性皮质撞击
<ol>
	<li>准备可控皮层撞击装置及手术用品。
	<ol>
		<li>用1 mL无菌生理盐水填充一支带滑动接头的1 mL注射器，用于伤口冲洗。在注射器上安装25 G针头以控制冲洗过程。</li>
		<li>将环孢素A（CsA）溶于DMSO中，配制成终浓度为1 mg/mL的稀释溶液。用另一支带滑动接头的1 mL注射器吸取0.5 mL环孢素A（CsA）溶液，用于免疫抑制。在CsA注射器上安装25 G或更大规格的针头。</li>
		<li>将可控皮层撞击活塞连接至立体定位仪的臂上，并调整至15°角。将直径为3 mm的撞击探针连接至活塞上。</li>
		<li>设定撞击速度为1.5 m/s，撞击停留时间为0.1 s，以产生轻度皮层损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行单侧开颅术
	<ol>
		<li>将小鼠放入与异氟烷蒸发器相连的麻醉诱导舱中，氧气流速约为0.7 L/min，使用约3%异氟烷诱导麻醉。通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉深度。</li>
		<li>使用电动剪刀剃除头皮毛发，并用棉签清除松散的毛发。</li>
		<li>将小鼠固定于配备麻醉面罩的立体定位仪中。&#160;
		<ol>
			<li>在立体定位仪上放置设定为37 °C的加热垫，置于小鼠身下以维持麻醉期间的体温。使用耳杆和门齿固定器固定头部，调整头部位置使颅骨额骨保持水平。手术全程维持1.5%-2%异氟烷麻醉。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行术前护理和无菌手术准备：使用无菌棉签将抗生素眼膏涂抹于眼睛表面。用碘伏溶液处理已剃毛的头皮区域，随后用70%乙醇擦拭去除。用带孔的手术巾覆盖动物身体，仅暴露头部顶部，同时遮盖眼睛。</li>
		<li>使用手术刀或剪刀在头皮正中线处做一长度为1.5–2 cm的切口。&#160;使用无菌棉签清洁切口，并清除冠状缝前方中线左侧的筋膜组织。</li>
		<li>使用撞击探针确定开颅部位。
		<ol>
			<li>将立体定位参考点（X = 0，Y = 0）设定为前囟点。&#160;将探针横向移至中线左侧2 mm处。使用细尖外科安全标记笔围绕探针画出直径为5 mm的圆形轮廓。随后抬起并旋转撞击探针使其离开原位。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用高速旋转微型电机手柄，配合圆头0.6 mm或0.8 mm钻头，以最大转速的70%-80%在颅骨上钻出开口。沿5 mm周向轮廓施加轻柔压力进行钻孔，使该区域骨质变薄。
		<ol>
			<li>钻孔时避免施加过大的压力，以免因振动、压迫或意外穿透导致皮层损伤。应依靠钻头转速完成切割工作。</li>
			<li>避免在同一位置持续钻孔过久，以防因摩擦产生过多热量。在钻孔过程中应定期用无菌生理盐水冲洗开颅区域，以清除碎屑并降低旋转工具产生的热量。</li>
			<li>钻至冠状缝区域时需格外小心，该部位易发生出血。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>当开颅轮廓区域骨质已充分变薄后，使用精细镊子移除颅骨瓣。从内侧夹住骨瓣，以径向动作轻柔地向上提起并向外侧牵拉。
		<ol>
			<li>抬起骨瓣时切勿损伤硬脑膜，否则可能导致严重损伤和出血。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实施轻度可控皮层撞击损伤
	<ol>
		<li>使用无菌酒精棉片清洁撞击探针。将探针重新移至暴露的皮层上方并定位。降低探针直至接触硬脑膜表面，将此位置标记为Z = 0。</li>
		<li>回撤活塞至Z = -1.0 mm位置，然后释放活塞以撞击皮层。&#160;</li>
		<li>迅速抬升活塞并将机械臂移开。损伤后立即用大量生理盐水冲洗皮层。根据需要继续用生理盐水清洗手术区域，并使用5.0丝线进行间断缝合关闭头皮切口。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对小鼠进行术后护理
	<ol>
		<li>停止麻醉。通过皮下注射方式在颈背部皮肤皱褶处给予环孢素A（CsA），剂量为10 mg/kg。将小鼠置于清洁且预热的术后恢复笼中。</li>
		<li>在饮水中添加对乙酰氨基酚作为镇痛剂，浓度为1.0 mg/mL。 
		注：应根据相应的IACUC标准操作程序，并结合实验结果变量（如镇静、神经炎症等）提供镇痛治疗。</li>
		<li>在预热的恢复笼中提供湿润饲料，以促进再水化和恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若进行仅开颅术（假手术对照组），则跳过第3节，直接从第2节进入第4节操作。</li>
</ol>
2. 细胞悬液的立体定位移植
<ol>
	<li>在颅骨切除术后约 24 小时开始细胞移植操作。</li>
	<li>准备细胞移植设备和手术用品
	<ol>
		<li>用无菌生理盐水填充一支 1 mL 滑动式针筒，用于冲洗伤口。在针筒上安装 25 G 针头以控制冲洗过程。</li>
		<li>用环孢素 A（CsA）溶液填充一支 1 mL 滑动式针筒，用于免疫抑制。在 CsA 针筒上安装 25 G 或更大规格的针头。根据需要在各次手术之间重新填充 CsA 针筒。</li>
		<li>使用标准方法从外径 1.0 mm 的硼硅酸盐玻璃毛细移液管制备玻璃针头。&#160;</li>
		<li>使用精细镊子将针尖折断至直径约为 200 µm。确保针头圆柱部分长度不超过 2.5 cm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准针筒泵，使其适用于 10 µL 针筒。&#160;设定流速为 0.2 µL/min，以输送总共 2.0 µL 的体积。</li>
	<li>制备人诱导多能干细胞（iPSC）悬液。
	<ol>
		<li>所有细胞操作均应在细胞培养 BSL-2 级生物安全柜中，采用标准无菌操作技术进行。</li>
		<li>根据细胞类型定义的标准条件提前准备细胞培养物。可参考 Lischka 等人17 的研究作为示例。 
		注：本演示中展示的实验使用了来源于 hiPSCs 的多种神经表型细胞。</li>
		<li>使用细胞解离溶液或其他首选的酶法或化学方法，将细胞轻柔地解离为单细胞悬液。&#160;</li>
		<li>对悬液中的细胞进行计数，然后用最少体积的细胞培养基（例如 DMEM）将悬液稀释至 5 × 104 个细胞/µL，并置于 1.7 mL 旋盖试管中。&#160;</li>
		<li>进行移植时请注意以下事项：
		<ol>
			<li>在整个操作过程中，将细胞悬液保持在 37 °C 条件下。&#160;</li>
			<li>仅在即将进行脑实质内注射（见下文步骤 4.5）前立即装填针筒。 
			注：若将针筒侧放，重力可能导致细胞悬液沉降或附着于针筒壁，从而造成注射细胞数量不均。</li>
			<li>若在一天内进行多次细胞移植操作，每只小鼠分配约 5 × 105 个细胞（即 10 µL 悬液）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行立体定位细胞移植手术
	<ol>
		<li>将小鼠放入连接有异氟烷蒸发器及压缩氧气源的麻醉诱导室中。以约 0.7 L/min 的氧气流速和约 3% 的异氟烷浓度诱导麻醉。</li>
		<li>将小鼠固定于配备麻醉鼻罩的立体定位仪中。&#160;
		<ol>
			<li>使用耳杆和门齿夹固定头部，并调整头部方向，使颅骨额骨处于水平位置。在整个手术过程中维持 1.5%–2% 的异氟烷麻醉浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行术前护理和无菌准备
		<ol>
			<li>使用棉签将含抗生素的保湿眼膏涂抹于眼睛。&#160;</li>
			<li>用无菌生理盐水冲洗切口部位以清洁局部并松解缝线。随后用棉签轻轻涂抹 70% 乙醇以消毒切口区域。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用精细镊子和眼科剪刀拆除缝线。用大量无菌生理盐水冲洗手术区域和颅骨切除部位。
		<ol>
			<li>若皮层出现严重疝出、变色、血管结构破坏或出血等不合格特征，应考虑将该动物排除。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>装填细胞移植针筒
		<ol>
			<li>将细胞悬液从 37 °C 培养箱转移至细胞培养生物安全柜中。轻轻旋转或轻敲试管，确保细胞悬液均匀混合。</li>
			<li>使用微量移液器从活塞端向 Hamilton 针筒中装入约 7.5 µL 细胞悬液。&#160;
			<ol>
				<li>将针筒以约 120° 角度持握，活塞端朝下。插入活塞时注意避免在悬液与活塞尖端之间引入气泡。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将垫圈组件安装到移液针上，然后将针头连接至针筒。</li>
			<li>推动活塞，使细胞悬液进入移液针。 &#160;若悬液流出受阻，可用精细镊子折断针尖以扩大直径。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将针筒连接至立体定位针筒泵。&#160;推进活塞，确认针筒泵组件工作正常。&#160;</li>
		<li>将针头移至注射坐标位置。
		<ol>
			<li>将针尖对准前囟，将 X 和 Y 坐标设为 0。然后将针尖移至颅骨切除区域上方，定位至前囟外侧 2.0 mm、后方 -1.0 mm 处。&#160;使针尖接触硬脑膜表面，并将立体定位 Z 坐标设为 0。&#160;</li>
			<li>推动活塞，确保在将针头插入脑组织前细胞悬液流动通畅。</li>
			<li>将针头插入脑组织至深度 Z = -1.4 mm。该立体定位坐标可将移植物置于深部皮层的灰质-白质交界处20。&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>启动针筒泵以输注细胞悬液。将实验台计时器设为 15 分钟并开始计时。使用长工作距离显微镜监测细胞悬液的流出情况。
		<ol>
			<li>在注射过程中用无菌生理盐水冲洗手术区域，以维持组织湿润。</li>
			<li>15 分钟后，缓慢撤出移植针头。&#160;用生理盐水冲洗手术区域，并用缝线关闭切口。&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行术后护理
		<ol>
			<li>停止麻醉。以 10 mg/kg 剂量经皮下注射方式给予 CsA。将小鼠置于清洁且预热的术后饲养笼中。</li>
			<li>在饮用水中添加对乙酰氨基酚作为镇痛剂，浓度为 1.0 mg/mL。 
			注：镇痛处理应遵循相应的 IACUC 标准操作程序（SOP），并结合实验结果变量综合考虑。</li>
			<li>提供湿润饲料的恢复笼，以帮助小鼠补水和恢复。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在整个小鼠存活期间持续每日注射 CsA，剂量为 10 mg/kg。</li>
</ol>
3. 感觉运动整合的胶带移除测试
<ol>
	<li>使用小型剃刀在进行行为学测试前将电工胶带切成 3 mm × 5 mm 的条状。切割粘性条带时应使用光滑的玻璃表面。 
	注意：请使用黄色和红色胶带，因为小鼠难以区分这两种颜色21.
	<ol>
		<li>选择一个能很好地放入透明塑料盒内的小镜子。 &#160;
		<ol>
			<li>使用油灰或胶带将镜子固定在大约45°角，以便从下方观察动物行为。 &#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将盒子和镜像组件放置在安静的专用行为测试室内的实验台上。 &#160;将圆柱体放置在镜子上方的塑料盒上。</li>
		<li>将操作布、镊子和粘性胶带放置在行为测试箱旁边的实验台上。</li>
		<li>用70%乙醇和纸巾清洁盒子和圆筒。 &#160;让表面彻底干燥。</li>
		<li>将小鼠带入行为测试室，在进行行为测试前，让小鼠在测试室内适应环境至少30分钟。 &#160;</li>
		<li>从笼子中移除水源，以减少测试期间的排尿事件，避免影响测试效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行粘附去除测试 
	注意：该行为学实验最好由两到三名研究人员共同完成：一人操作秒表，另外一至两人负责处理小鼠并观察其行为。
	<ol>
		<li>使用每把镊子剥离一条每种颜色的粘性胶带。 &#160;
		<ol>
			<li>选择哪种色带对应哪只前爪，并在整个试验过程中保持一致。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用操作布通过颈部后侧皮肤固定小鼠，使其前肢远离身体和头部。</li>
		<li>使用镊子将粘性胶带贴在每只前爪的足底表面。用轻柔且均匀的手指压力将胶带固定在爪子上。</li>
		<li>迅速将小鼠放入塑料圆筒中。当小鼠四只爪子均接触塑料盒时，启动两个秒表。</li>
		<li>使用两个秒表记录以下四个事件的发生潜伏期：左爪反应、左爪移开、右爪反应、右爪移开。
		<ol>
			<li>当动物通过抖动或抽动爪子或啃咬胶带等方式明确识别出粘性胶带时，记录为一次注意事件。</li>
			<li>当动物有效移除前肢掌面的条带时，记录一次移除事件。 &#160; 
			注意：如果条带重新黏附或黏附在前肢的侧面，移除事件不会被排除。</li>
			<li>如果在120秒时相应的试纸条尚未被移除，则停止计时。&#160;</li>
			<li>在数据表上记录四个事件的持续时间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对每只小鼠进行第二次试验
		<ol>
			<li>每只小鼠两次试验之间应至少间隔5分钟，以减少应激反应，避免影响测试中的表现效率。</li>
			<li>在对同一笼中多只小鼠进行测试时，每次测试小鼠之间需用纸巾清洁仪器，以清除废弃物。 &#160;
			<ol>
				<li>使用70%乙醇和纸巾在测试来自多个鼠笼的小鼠时彻底清洁仪器。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>在该次实验的第二次试验中，调换颜色与爪子放置的顺序，以随机化颜色可能产生的影响。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计算每只动物在每日实验阶段中两次试验间每个事件的平均潜伏期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用清水彻底清洁仪器和操作布，更换笼具中的饮用水，并将小鼠送回饲养设施。</li>
	<li>在重复测量试验设计中，于后续各实验时间点重复执行步骤 3.1–3.2。 
	注意：在开始采集任何数据之前的5天内，每天重复步骤3.2.1–3.2.5.3，以使动物适应任务。建议在手术前获取基线数据。</li>
</ol>
4. 移植物存活与损伤病理的二氨基联苯胺（DAB）免疫组织化学分析
<ol>
	<li>处死动物并进行心脏灌注。
	<ol>
		<li>准备 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）和含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液。将两种溶液的 pH 值均调节至 7.4。</li>
		<li>将上述两种溶液置于通风橱内的冰上。将蠕动泵放置于通风橱中，启动泵以 PBS 充满灌注管路，设置泵流速约为 7 ml/min。&#160; 在泵的出液端连接一根 25 G 针头。</li>
		<li>在通风橱内放置带有柔软基底的引流盘，并将盘的一端略微抬高，使灌注液流向较低一端。</li>
		<li>将小鼠放入麻醉诱导舱中，使用 100% 压缩氧气作为载体气体，通入 4% 异氟烷进行麻醉。</li>
		<li>将麻醉后的小鼠从诱导舱转移至麻醉鼻罩，将异氟烷浓度降至 2%。</li>
		<li>行胸腔切开术暴露心脏。停止麻醉，因胸腔切开术本身可导致动物死亡。</li>
		<li>沿心脏长轴方向小心将灌注泵的出液针插入左心室，避免穿破室间隔，否则会导致灌注不充分。</li>
		<li>使用小剪刀剪开右心耳，随后立即启动蠕动泵。</li>
		<li>持续灌注 PBS，直至从右心耳流出的液体无血色。
		<ol>
			<li>关闭泵，将泵的进液管移至 PFA 容器中，重新启动泵。继续灌注 PFA，直至动物身体变得足够僵硬，或已灌注 20 mL 体积为止。</li>
			<li>关闭泵，将出液针从心脏中取出，将进液管从 PFA 溶液移回 PBS 溶液中，并彻底冲洗管路中的 PFA。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过精细解剖从颅骨中取出脑组织，将脑放入盛有 4% 多聚甲醛的小容器中，在 4 °C 下固定过夜。</li>
	<li>固定过夜后的次日，将 PFA 替换为含 0.1% 叠氮化钠的 PBS 溶液，并将脑组织保存在此溶液中，直至进行组织切片前准备。</li>
	<li>使用冷冻切片机或室温振动切片机，收集 40–50 µm 厚的甲醛固定脑组织切片。</li>
	<li>将组织置于含 0.3% 过氧化氢的水中进行预处理，以灭活内源性过氧化物酶，防止产生非特异性染色。</li>
	<li>使用柠檬酸缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% 吐温-20，pH 6.0）在 60 °C 下进行抗原修复，持续 30 分钟。</li>
	<li>采用标准方法进行抗体标记。&#160; 更多细节请参见本实验室 Lundell 等. 的报告22。
	<ol>
		<li>使用小鼠 IgG 封闭试剂盒（见材料表）以减少与内源性抗体的交叉反应。按照生产商说明，在室温（RT）下用 IgG 封闭缓冲液孵育组织至少 1 小时。</li>
		<li>当移植人源 iPSC 来源细胞时，使用小鼠抗人核抗原一抗（hNA；稀释比 1:500）以定位移植细胞。在 4 °C 下轻柔振荡孵育 48–72 小时。</li>
		<li>洗去一抗溶液后，在室温下以 1:250 稀释比孵育 HRP 标记的抗小鼠二抗，持续 2 小时。</li>
		<li>采用标准方法进行 DAB 显色反应以显示免疫标记，在室温下显色 5 至 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用标准方法将染色后的组织贴附于载玻片，并加盖盖玻片。</li>
	<li>采用无偏倚体视学方法定量标记细胞数量，具体方法如前所述23,24。使用 20 µm 光学切片，切片间隔为 3。</li>
</ol>

<ol><li>Maas, A. I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury%3A+integrated+approaches+to+improve+prevention%2C+clinical+care%2C+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research.</a> The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).</li>
<li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disability-adjusted+life+years+%28DALYs%29+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions%2C+1990-2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).</li>
<li>Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+Brain+Injury-Related+Emergency+Department+Visits%2C+Hospitalizations%2C+and+Deaths+-+United+States%2C+2007+and+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+mortality+weekly+report%3A+Surveillance+summaries%22%5BJournal%5D)">Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013.</a> Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).</li>
<li>Fehily, B., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Mild+Traumatic+Brain+Injury%3A+Potential+Mechanisms+of+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage.</a> Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).</li>
<li>Kulbe, J. R., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy-integration+of+canonical+traumatic+brain+injury+secondary+injury+mechanisms+with+tau+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology.</a> Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).</li>
<li>Romine, J., Gao, X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cortical+impact+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Controlled cortical impact model for traumatic brain injury.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51781(2014).</li>
<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li>
<li>Mishra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+resting+functional+connectivity+after+traumatic+brain+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat.</a> PloS ONE. 9, 95280(2014).</li>
<li>Sours, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Default+mode+network+interference+in+mild+traumatic+brain+injury+-+a+pilot+resting+state+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study.</a> Brain Research. 1537, 201-215 (2013).</li>
<li>Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+contusion+injury+disrupts+olfactory+bulb+neurogenesis+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice.</a> BMC Neuroscience. 14, 142(2013).</li>
<li>Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+Brain+Injury+Severity+Affects+Neurogenesis+in+Adult+Mouse+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus.</a> Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).</li>
<li>Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+CNS+repair+following+TBI%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Strategies for CNS repair following TBI.</a> Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548, 592-596 (2017).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+transplantation+of+human+iPSC-derived+glial-rich+neural+progenitors+improves+lifespan+of+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice.</a> Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).</li>
<li>Tong, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+interneuron+progenitor+transplantation+restores+normal+learning+and+memory+in+ApoE4+knock-in+mice+without+or+with+Abeta+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Lischka, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+mouse+cortical+but+not+isogenic+human+astrocyte+feeder+layers+enhance+the+functional+maturation+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture.</a> Glia. 66, 725-748 (2018).</li>
<li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesive+removal+test%3A+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).</li>
<li>Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+sensorimotor+function+in+mouse+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50303(2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.+Compact+2nd+edn%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn</a>. , Elsevier Academic Press. (2004).</li>
<li>Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+novel+color+vision+in+mice+engineered+to+express+a+human+cone+photopigment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment.</a> Science. 315, 1723-1725 (2007).</li>
<li>Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin1+expression+in+cell+lineages+of+the+cerebellar+cortex+in+embryonic+and+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).</li>
<li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386, 493-495 (1997).</li>
<li>Piltti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+dose+alters+the+dynamics+of+human+neural+stem+cell+engraftment%2C+proliferation+and+migration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury.</a> Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severity+of+controlled+cortical+impact+traumatic+brain+injury+in+rats+and+mice+dictates+degree+of+behavioral+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits.</a> Brain Research. 1287, 157-163 (2009).</li>
<li>Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-percussion-induced+traumatic+brain+injury+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats.</a> Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).</li>
<li>Namjoshi, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+biomechanical+and+biological+threshold+of+murine+mild+traumatic+brain+injury+using+CHIMERA+%28Closed+Head+Impact+Model+of+Engineered+Rotational+Acceleration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration).</a> Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).</li>
<li>Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+dysfunction+and+delayed+neurological+deficits+in+mild+traumatic+brain+injury+induced+by+blast+shock+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232(2014).</li>
<li>Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+mild+traumatic+brain+injury%3A+translation+of+physiological+and+anatomic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury.</a> Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).</li>
<li>Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criteria+to+define+mild%2C+moderate%2C+and+severe+traumatic+brain+injury+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model.</a> Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).</li>
<li>Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Male+and+Female+C57BL%2F6J+Mice+on+Motor+and+Cognitive+Tasks+Commonly+Used+in+Pre-Clinical+Traumatic+Brain+Injury+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research.</a> Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).</li>
<li>Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+long+is+too+long%3F+The+lack+of+consensus+regarding+the+post-concussion+syndrome+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Injury%22%5BJournal%5D)">How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis.</a> Brain Injury. 29, 798-803 (2015).</li>
<li>Hurst, J. L., West, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+anxiety+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Taming anxiety in laboratory mice.</a> Nature Methods. 7, 825-826 (2010).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+behavioral+testing+after+focal+ischemia+in+the+mouse%3A+functional+recovery+and+the+effects+of+gender%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender.</a> Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).</li>
<li>Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+cortical+lesion+effects+and+treatment+with+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine.</a> Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).</li>
<li>Al-Ali, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mTOR+Substrate+S6+Kinase+1+%28S6K1%29+Is+a+Negative+Regulator+of+Axon+Regeneration+and+a+Potential+Drug+Target+for+Central+Nervous+System+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).</li>
<li>Pleasant, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+neurodegeneration+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model+is+influenced+by+impactor+tip+shape%3A+implications+for+mechanistic+and+therapeutic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

轻度 CCI 作为测试实验性再生疗法的模型系统 
CCI 模型是研究皮层机械性损伤后组织功能障碍机制的有力工具。该模型的一个显著优势在于其损伤参数具有可调节性。研究者可通过调整撞击的 Z 轴深度、速度或停留时间，按需增加或减轻损伤程度10,25。当操作正确时，轻度 CCI 脑挫伤模型应仅引起轻度的皮层细胞死亡和极少的空洞形成。开颅及骨瓣移除操作必须极为谨慎。钻取开颅沟槽时施加过大的向下压力，可能因产热和振动导致皮层损伤。在移除颅骨瓣过程中对硬脑膜的机械性破坏，几乎总是预示着严重的皮层损伤。主要皮层血管的破坏很可能导致皮层过度损伤，此类动物应予以排除出实验。遗憾的是，术后当天损伤加重的迹象可能较为隐匿。水肿或小皮层血管破裂并不一定代表不良预后。由缺血引起的血肿和异常着色则是更明确的手术并发症指征。详细记录术中事件，并将并发症与组织病理学结果相关联，对于优化开颅技术至关重要。
必须指出，动物的轻度创伤性脑损伤（mTBI）建模存...

创伤性脑损伤（TBI）是一个泛指术语，用于描述由于头部受到外力冲击引起的间接机械力（如旋转加速度/减速度或对冲伤）或由物体或爆炸冲击波造成的直接损伤所导致的脑部获得性损伤。据估计，TBI 全球范围内约导致9%的死亡病例，每年约有5000万例发生1,2。美国疾病控制与预防中心2017年的一份报告估计，2013年美国因TBI导致的急诊就诊、住院及死亡总数达280万人次3。每年还有大量较轻的TBI未被报告。严重的TBI可导致认知功能、运动功能及整体生活质量的终身损害。近年来，人们才逐渐认识到轻度TBI，尤其是反复发生的运动相关性TBI，具有隐匿性的健康危害4,5。 &#160;
临床前模型对于获得新的创伤性脑损伤（TBI）机制认识并开发潜在的修复疗法至关重要。TBI的可控皮层冲击（CCI）模型是一种作用于皮层的开颅机械挫伤模型。通过调整冲击参数，可产生从轻度到重度不同程度的CCI损伤6。与其他闭合性颅脑损伤模型不同，CCI损伤属于局灶性损伤而非弥散性损伤。CCI可用于诱导单侧损伤，从而以对侧皮层作为内部对照。本方案描述了针对包含初级躯体感觉和运动区域的部分皮层实施轻度CCI损伤的操作特点。选择该皮层区域的原因在于其参与感觉运动行为，而多种行为学检测方法可有效识别损伤引起的缺陷7。此外，也可通过行为学改善来评估TBI治疗干预的效果。
创伤性脑损伤（TBI）的一个典型特征是损伤区域出现广泛的神经功能障碍。受损神经元会发生细胞死亡，神经网络连接被破坏8,9。TBI会干扰内源性干细胞的募集，从而导致进一步的下游行为缺陷10,11。&#160; 移植神经干细胞及干细胞衍生细胞已被探索作为恢复受损大脑功能的一种可能手段。除了具有修复受损神经回路的潜力外，移植的细胞还能产生旁分泌效应，促进神经元存活并推动TBI后的功能恢复12。多种细胞类型已在临床前研究中被移植，以评估其在神经系统疾病模型中的修复潜力13,14,15。近年来诱导多能干细胞技术的广泛应用16，促进了大量可用于实验的人类干细胞系的建立。利用人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生细胞进行临床前测试，是表征特定细胞系对人类疾病潜在治疗效果的重要第一步。本实验室已建立了将hiPSCs分化为神经表型的实验方案17，旨在获得可用于促进创伤性脑损伤后恢复的可移植细胞。
本方案中的实验采用单侧控制性皮质撞击（CCI）方法，对成年小鼠左侧体感皮层和运动皮层诱导创伤性脑损伤（TBI）。轻度CCI损伤会导致小鼠右侧前爪出现持续性的功能缺陷，可用于追踪由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的神经细胞移植对功能恢复的影响。本方案中的前爪感觉运动功能检测方法借鉴自Bouet等人的研究18，并已被Fleming等人先前的研究验证19。&#160; 本方案详细阐述了开展实验性脑损伤、hiPSC细胞治疗性移植以及行为学和组织学结果评估的完整工作流程。

<table><tbody><tr><td>1 毫升注射器</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>&amp;nbsp;309659</td><td></td></tr><tr><td>1.7 毫升翻盖式试管</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>10 微升注射器</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>25G Precision Glide 注射针头</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>&amp;nbsp;305122</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>可选产品；因地区而异</td></tr><tr><td>对乙酰氨基酚口服混悬液</td><td>Tylenol (儿童用)</td><td></td><td>用水稀释至 1 mg/ml</td></tr><tr><td>麻醉气体蒸发器</td><td>Vetland</td><td>521-11-22</td><td></td></tr><tr><td>动物操作布</td><td></td><td></td><td>从百货商店购买</td></tr><tr><td>聚维酮碘（Betadine）</td><td>Purdue Products</td><td>NDC-67618-151-32</td><td></td></tr><tr><td>压缩氧气</td><td></td><td></td><td>可选产品；因地区而异</td></tr><tr><td>环孢素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30024-100mg</td><td></td></tr><tr><td>DAB 染色试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-500ml</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG 抗体，HRP 标记</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-035-151</td><td></td></tr><tr><td>电工胶带</td><td>3M Corporation</td><td></td><td>从百货商店购买</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细移液管，外径 1 mm，内径 0.58 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>高速旋转微型电机套件</td><td>Foredom Electric Co.&amp;nbsp;</td><td>K.1070 - K.107018</td><td></td></tr><tr><td>理想微型钻头套装（5 件装）</td><td>Cell Point Scientific&amp;nbsp;</td><td>60-1000</td><td></td></tr><tr><td>Impact One CCI 立体定位撞击器&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>39463920</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>NDC-10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>实验台计时器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>MicroData Instruments, Inc.</td><td>PMP-102</td><td>任意型号均可</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片封片介质</td><td></td><td></td><td>可选产品</td></tr><tr><td>镜子</td><td></td><td></td><td>从百货商店购买</td></tr><tr><td>小鼠抗人核抗原抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on Mouse 封闭试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>持针器止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>Falcon Pharmaceuticals</td><td>NDC-61314-631-36</td><td></td></tr><tr><td>眼科弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>塑料盒</td><td></td><td></td><td>从百货商店购买</td></tr><tr><td>塑料圆筒</td><td></td><td></td><td>从百货商店购买</td></tr><tr><td>QSI 电动注射泵</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>可拆卸针头压缩接头</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>小型啮齿类动物立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td>51925</td><td></td></tr><tr><td>小型剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>无菌酒精棉片</td><td>Fisherbrand</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签/Kendall 棉签</td><td>Tyco Healthcare</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>Hospira</td><td>NDC-0409-1966-07</td><td></td></tr><tr><td>秒表（2 个）</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-662-56</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold 显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>15-188-48</td><td></td></tr><tr><td>缝合线 — 5.0 丝线带弯针</td><td>Oasis</td><td>MV-682</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源神经细胞的治疗性移植

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

创伤性脑损伤（TBI）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。TBI所致的疾病病理过程从最初的机械性损伤逐步发展为继发性损伤，包括细胞凋亡和炎症反应。动物模型在揭示损伤机制和评估潜在神经保护疗法的研究中具有重要价值。本实验方案描述了一种局灶性开放性颅脑创伤的可控皮层冲击（CCI）模型，具体阐述了产生轻度单侧皮层损伤的参数设置。通过双侧感觉运动整合的粘性胶带移除实验，分析CCI后的行为学后果。针对TBI病理的实验性治疗，本方案还展示了一种将培养细胞移植入脑内的操作流程。选用来源于人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的神经细胞培养物，因其在人类TBI患者中可能具有更优的功能恢复潜力。通过改良的DAB免疫组织化学方法，检测hiPSCs在宿主小鼠脑组织中的长期存活情况。

颅骨切除术有助于实验性脑损伤和治疗性细胞移植：脑损伤的控制性皮质冲击模型及后续的细胞移植治疗需要仔细去除覆盖的颅骨。可在颅骨的任何背侧表面进行颅骨切除术，以便对目标脑区进行操作。图1 展示了直径为5 mm的颅骨切除示意图，用于暴露初级躯体感觉皮层和运动皮层（图1A）。在颅骨切除术后24小时，进行第二次手术，将人诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经细胞悬液注射至皮层深层（图1B）。颅骨切除术后第一天出现一定程度的脑水肿属于正常现象，尤其是在实施控制性皮质冲击（CCI）后。然而，在该操作的各个阶段保护脑血管对于皮层存活至关重要。图2 展示了一只小鼠的细胞移植过程，其脑组织仅有轻微脑疝、出血极少且皮层血管化广泛。这些特征是手术成功的重要预后指标。
<s...

本方案展示了开颅小鼠创伤性脑损伤模型的建立方法，以及将体外培养的人诱导多能干细胞来源的细胞移植至损伤部位的技术。同时简要描述了对这些操作结果进行的行为学和组织学检测。

创伤性脑损伤（TBI）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。TBI引起的疾病病理过程从原发性机械性损伤开始……

本方案展示了一种在脑损伤后测试人诱导性多能干细胞治疗效果的综合性临床前工作流程。这种创伤性脑损伤模型通过严格控制机械力参数，实现了高度的灵活性和可重复性，从而产生明确界定的损伤。这些操作可用于研究其他脑区的损伤与恢复过程，且该移植方法适用于多种细胞类型。颅骨钻孔具有挑战性，因为该技术需要操作者具备一定的手法技巧，以掌握适当的压力、速度、深度以及平稳的动作。请详细记录所有操作步骤并进行充分练习。进行单侧颅骨切除术时，需确认麻醉小鼠对脚趾夹捏无反应，并将小鼠固定于立体定位仪中。使用无菌棉签将抗生素眼膏涂抹于眼睛，并将含碘溶液涂抹于剃净的头皮区域。用70%乙醇去除碘液，并用带孔手术单覆盖动物。在头皮正中做1.5至2厘米的切口，使用无菌棉签清洁伤口，并清除冠状缝左侧中线处的筋膜。使用撞击探针确定颅骨切除部位，并将立体定位参考点 x 等于零、y 等于零设定为前囟。将探针横向调整至中线左侧 2 毫米处。使用细尖的外科安全标记笔，在假定撞击区域周围标记一个直径为 5 毫米的圆形区域。抬起并旋转冲击器使其离开原位，完成直径五毫米的环形切口。短暂地将冲击器复位，以确认五毫米环形切口的准确性。随后再次抬起并旋转冲击器使其离开原位，使用配备圆形尖端、直径为0.6或0.8毫米的高速旋转微型电机套件手动工具，在70%至80%最大转速下于颅骨上钻出一个开放孔洞。沿此边界内5毫米的环形轮廓钻孔时，对颅骨施加轻柔压力，并使用镊子抬起形成的骨瓣。钻透缝合线时可能遇到额外困难，因为骨质在此处不连续，需要施加更大压力。血管可能与骨质紧密相邻，因此可能发生出血事件。为诱导轻度可控的皮质撞击损伤，使用无菌酒精棉片清洁撞击探针，并将探针移回暴露的皮质上方位置。降低探针直至接触硬脑膜表面，并将此位置标记为 z 等于零。撤回活塞，移动至 z 等于负一毫米处，然后释放活塞以撞击皮质。立即抬起活塞，将机械臂移出位置，用大量生理盐水冲洗皮层，并使用5-0丝线间断缝合关闭头皮切口。随后，通过皮下注射向小鼠颈背部注入10毫克/千克的环孢素A，并将小鼠置于清洁且预先加温的术后笼中，持续监测直至完全恢复。颅骨切除术后约24小时，将小鼠重新放入立体定位仪框架中。用带窗手术巾覆盖小鼠。用无菌生理盐水冲洗切口部位，以清洁局部并松解缝线。使用浸有70%乙醇的棉签轻轻消毒切口部位，并用精细镊子和眼科剪去除缝线。然后用大量无菌生理盐水冲洗手术区域和颅骨切除部位。在细胞培养生物安全柜中，轻轻旋转或轻敲细胞管，以确保细胞悬液均匀。使用微量移液器从哈密尔顿注射器的推杆端吸入约7.5微升细胞悬液。将注射器以120度角持握，针筒推杆末端朝下，插入推杆时注意避免在悬液与推杆尖端之间引入气泡。将垫圈组件连接到移液针上，并将针头连接至注射器。推动推杆，使细胞悬液进入移液针，然后将注射器安装到立体定位注射泵上。推进活塞，确保注射泵组件正常工作，并将针头移至注射坐标位置。将针尖对准前囟，设定 x 和 y 坐标为零。将针尖移至颅骨开窗处，位于前囟外侧 2 毫米、后方 1 毫米处，并使针尖接触硬脑膜表面。将针头略微抬起，然后在针尖接触处的硬脑膜上做一个小切口。将立体定位坐标设为 z 等于 0，推动针栓以确认细胞悬液流动通畅，然后再将针头插入脑组织。将针头插入脑组织至深度 z 等于 -1.4 毫米，以将移植物置于深部皮层的灰质/白质交界处。启动注射泵，在15分钟内输注细胞悬液。使用长工作距离显微镜监测细胞悬液的流出情况，并在注射过程中用无菌生理盐水冲洗手术部位，以维持组织的水合状态。当所有细胞输送完毕后，缓慢撤出移植针头，再用额外的生理盐水冲洗手术部位，然后使用新的缝线关闭切口。然后按照演示的方法进行术后护理。对于粘性胶带移除测试，首先使用小型剃刀将黄色和红色的电工胶带在光滑的玻璃表面上切割成 3 × 5 毫米的条状。在测试前至少 30 分钟将小鼠带入行为测试室，并使用操作布通过颈背部皮肤固定小鼠，使其前肢远离身体和头部。使用镊子将粘性胶带贴在每只前爪的掌面，并用轻柔且均匀的指压将胶带固定在爪子上。迅速将小鼠放入塑料圆筒中，当小鼠的四只爪子均接触塑料测试箱时，立即启动两个秒表。随后用这两个秒表分别记录左爪感知、左爪移除、右爪感知和右爪移除的潜伏期。在本项初步实验中，比较了仅行开颅术、控制性皮质冲击损伤以及未处理小鼠的前肢功能。接受手术的小鼠在术后立即出现短暂的对粘附刺激反应潜伏期延长，持续一至三天，并伴有术后短暂的同侧前爪粘附物清除能力下降。然而，与未处理小鼠相比，接受控制性皮质冲击损伤的小鼠在术后第28天起，表现出显著的对侧前肢运动功能缺陷。对小鼠脑切片进行人源核抗原免疫染色显示，在假手术损伤和可控皮层撞击脑组织中，人源细胞移植物可清晰地与宿主组织区分开来。在处理培养的人源细胞以及接触过啮齿类动物或免疫抑制药物的注射器针头时，必须遵守标准的实验室安全操作规程。脑组织切片可进一步分析神经炎症标志物的表达，了解移植物对宿主组织损伤反应的影响以及宿主反应对移植物的反向影响具有重要意义。我们惊讶地发现，损伤后行为学结果存在细微的性别差异。目前我们正在研究性别是否在脑损伤的神经免疫反应中发挥作用。稳定的手法、耐心和反复练习对于掌握良好的开颅技术至关重要。不正确的开颅手术所造成的附带损伤可能会影响你希望进行细胞移植的目标区域。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人类诱导多能干细胞衍生神经细胞治疗移植小鼠脑损伤控制皮质影响模型

来源：Furmanski, O., et al. 小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源的神经细胞治疗性移植. J. Vis. Exp.

立体定向移植神经细胞悬液至创伤性脑损伤小鼠

本视频演示了通过开颅方式在小鼠中诱导创伤性脑损伤的操作步骤：沿颅骨中线做切口，钻透颅骨并移除骨瓣以暴露脑皮层，施加高压以造成损伤。随后缝合伤口，制备可用于后续实验的小鼠模型。...

使用撞击探针建立小鼠创伤性脑损伤模型

来源：Shahror, R. A. et. al., 利用磁共振成像追踪经鼻递送后在创伤性脑损伤小鼠模型中分布的超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞。J. Vis. Exp. (2019)本视频展示了在小鼠模型中进行鼻内间充质干细胞（MSC）递送的方法。MSC...

小鼠创伤性脑损伤模型中的鼻内间充质干细胞递送

来源：Parajuli, B., et.al. 通过无创经鼻途径将人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞移植到免疫活性小鼠脑内。 J. Vis. Exp.

经鼻移植人诱导性多能干细胞来源的小胶质细胞至小鼠脑内

脊髓损伤是一种导致严重发病率和高死亡率的创伤性疾病。在本研究中，我们详细描述了一种小鼠脊髓损伤的挫伤模型，随后进行神经干细胞移植。...

脊髓损伤实验性挫伤模型中的神经干细胞移植

本文介绍了一种实验方案，旨在利用化学遗传学工具调控移植到新生期小鼠大脑皮层中的皮层中间神经元前体细胞的活性。...

化学遗传学改造的皮层中间神经元前体细胞移植至新生小鼠脑内

我们描述了将经携带双报告基因载体（表达荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP））转导的人类神经前体细胞移植至小鼠脑实质内的方法。移植后，利用活体成像系统反复检测荧光素酶信号。 体内 利用荧光显微镜在脑组织切片中鉴定表达生物发光和GFP的移植细胞。...

颅内移植与 体内 小鼠大脑中人神经前体细胞的生物发光示踪

本文介绍的实验方案允许通过鼻腔途径将诱导多能干细胞来源的人小胶质细胞（iPSMG）移植到免疫功能健全的小鼠脑内。文中展示了细胞的制备与鼻腔移植方法，以及为维持iPSMG存活而给予细胞因子混合物的操作步骤。...

通过无创经鼻途径在免疫功能健全小鼠脑内移植人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞

本方案描述了成年人大脑皮层的长期器官型培养，结合诱导多能干细胞来源的皮层前体细胞的ex...

成人人类大脑皮层的器官型培养作为一种 离体 人类干细胞移植模型及验证

通过神经元编程方法获得的人多能干细胞来源的GABA能神经元移植，可能成为治疗神经发育障碍的一种潜在治疗策略。本方案描述了将人干细胞来源的GABA能神经前体细胞生成并移植至新生小鼠脑内的方法，可用于对移植物神经元进行长期研究，并评估其治疗潜力。...

将人干细胞来源的GABA能神经元移植至出生后早期小鼠海马以缓解神经发育障碍

本文介绍了一种将标记的神经细胞移植并追踪其在人脑类器官中分布的实验方案。...

一种人脑类器官神经细胞移植模型

学习人类诱导多能干细胞治疗创伤性脑损伤的临床前工作流程，通过控制机械力参数建立可重复的小鼠皮质损伤模型。该方法适用于评估干细胞移植疗效及神经修复机制研究。

小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源神经细胞的治疗性移植

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