Name: 制造淀粉样蛋白-β-分泌阿尔金酸微珠,用于模拟阿尔茨海默氏病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 了解利用海藻酸钙快速凝胶化技术封装7PA2细胞制备微珠的方法，用于控制淀粉样蛋白-β的持续释放。该技术为研究阿尔茨海默病机制和开发治疗策略提供了可靠的体外和体内实验模型。

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作者谨此感谢 Kajen Suresparan 先生、Jonathan Wubetu 博士、Dominik Grudzinski 先生、Chen Zhao 女士以及 Thierry Pilot 博士在海藻酸盐微珠制备、细胞培养和 Aβ 检测的优化过程中提供的帮助，以及富有价值的科学讨论。

1. 准备工作
<ol>
	<li>配制 100 mL 约 4% (w/v) 的海藻酸钠储备溶液。
	<ol>
		<li>称取 4.4 g 海藻酸钠，将干燥粉末加入 100 mL HEPES 缓冲盐水（HBS，含 20 mM HEPES（0.477 g）和 150 mM NaCl（0.877 g）的去离子水溶液）中，使其充分水合。</li>
		<li>使用磁力搅拌器，转速约为 500 转/分钟（rpm），加热至最高 50 °C，以确保海藻酸钠完全水合。 
		注意：海藻酸钠可能需要一到两个小时才能完全水合。为节省时间，可在包封实验前一天配制海藻酸钠溶液，并于 4 °C 保存至次日使用。若溶液已冷藏，请在使用前将其置于水浴或加热板上温和加热至 37 °C，并用磁力搅拌器立即搅拌。</li>
		<li>使用 0.22 µm 孔径的聚醚砜（PES）滤器对海藻酸钠溶液进行无菌过滤后使用。建议在 37 °C 下过滤，以利于海藻酸钠顺利通过滤膜。若温度下降，溶液黏度将升高。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 1,000 mL 的 0.5 M CaCl2 溶液。
	<ol>
		<li>称取 55.49 g 无水 CaCl2，溶于 1,000 mL HBS 溶液（含 20 mM HEPES 和 150 mM NaCl 的 1,000 mL 去离子水溶液）中。</li>
		<li>使用 0.22 µm 孔径的 PES 滤器进行无菌过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 100 mL 溶解液混合物。
	<ol>
		<li>在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中配制含 100 mM HEPES（23.83 g）和 500 mM 二水合柠檬酸三钠（147.05 g）的溶液。</li>
		<li>使用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 建立包封系统
<ol>
	<li>清洁层流罩。
	<ol>
		<li>使用紫外照射对包含封装仪的层流罩进行灭菌，随后喷洒70% v/v乙醇溶液。</li>
		<li>用10 mL 70% v/v乙醇溶液冲洗封装仪系统，再用10 mL无菌去离子水冲洗。</li>
		<li>安装300 µm喷嘴，并重复步骤2.1.2。</li>
		<li>对装有滤过海藻酸钠溶液的瓶子、装有滤过氯化钙溶液的瓶子以及将要使用的任何工具、设备和空的培养板喷洒70% v/v乙醇溶液，并将其放入层流罩中。使用前，再次开启紫外灯照射30分钟，以彻底灭菌。</li>
		<li>准备一个装有生物级消毒液的废液烧杯，并将其放入层流罩内。</li>
		<li>在烧杯中加入100 mL无菌CaCl2（水溶液），并放入磁力搅拌子。将搅拌速度设定为100 rpm。将烧杯置于磁力搅拌平台上，使其液面距离喷嘴尖端18 cm。该烧杯用于收集海藻酸钠微珠并促使其发生胶凝。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于封装的细胞。
	<ol>
		<li>从培养箱中取出细胞，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将接近融合的培养瓶中的细胞解离，并在37 °C孵育5–10分钟。</li>
		<li>取样用于细胞密度测定，然后将剩余细胞在1,000 rpm下离心5分钟，获得细胞沉淀。</li>
		<li>用HBS缓冲液（20 mM HEPES和150 mM NaCl）重悬沉淀，使其浓度为最终所需细胞浓度的两倍（例如，若最终浓度为1.5 × 106 个细胞/mL，则用HBS重悬至3 × 106 个细胞/mL）。</li>
		<li>在50 mL离心管中，将细胞悬液与约4% (w/v)的海藻酸钠溶液按1:1体积比混合，得到最终含有目标细胞浓度（例如1.5 × 106 个细胞/mL）且海藻酸钠浓度约为2% (w/v)的混合悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设定封装参数。
	<ol>
		<li>将封装仪的流速设为最大挤出速度（8.9 mL/min），电压设为1.0 kV，频率设为5,500 Hz。 
		注：这些参数此前已优化，用于制备直径为550 µm的微珠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 制备
<ol>
	<li>制备微珠。
	<ol>
		<li>在20 mL注射器中加入5 mL细胞-海藻酸盐悬浮液，并将注射器连接至包封装置。</li>
		<li>启动包封装置，使液体流动，推动细胞-海藻酸盐悬浮液通过进样器，液滴流将从喷嘴处挤出。</li>
		<li>将最初挤出的1 mL收集至废液烧杯中，以排除初始阶段不均匀的液流。</li>
		<li>继续运行剩余的4 mL，使液滴落入CaCl2凝胶浴中。如有需要，可将每1 mL分别（但连续地）运行并收集至四个不同的凝胶浴中。 
		注意：液滴一旦接触凝胶浴，其中的海藻酸盐会立即与凝胶浴中的钙离子交联，形成球形微珠。</li>
		<li>一分钟后，将凝胶烧杯从磁力平台上取下，静置微珠，继续在无搅拌条件下放置4分钟（此时间为室温下确保微珠完全凝胶化所必需）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回收微珠。
	<ol>
		<li>使用无菌镊子去除任何较大的海藻酸盐碎片或杂质，然后用无菌塑料移液管将微珠转移至74 µm孔径的滤网，以从凝胶浴中回收微珠。</li>
		<li>使用适当的培养基将微珠转移至离心管中，并在细胞培养基中平衡5分钟。</li>
		<li>将微珠转移至培养瓶、培养板或培养皿中，用于后续孵育和实验。 
		注意：凝胶浴不应重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 微珠的测试与使用
<ol>
	<li>检测微珠质量。
	<ol>
		<li>为评估包封和培养后细胞的活力（或其他生物学读数），使用溶解液轻柔破坏微珠以释放包封的细胞。 
		注意：所需溶解液体积取决于每次测试所用微珠的数量。建议比例为每1 mL包封细胞使用4 mL溶解液。此步骤仅需对每种微珠群体的一个样本进行。</li>
		<li>将细胞置于含5% CO2的细胞培养箱中，于37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>按照常规方法，用台盼蓝染色并使用血细胞计数板，对现处于溶液中的细胞进行活力估算。 
		注意：若使用自动细胞计数器评估细胞活力，应注意避免海藻酸盐伪影干扰计数结果。在此类情况下，建议采用人工细胞计数。</li>
		<li>为评估微珠稳定性，使用显微镜和成像软件，在一段时间内定期测量每种微珠群体样本的平均直径。直径的显著变化可能提示海藻酸盐降解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用微珠检测分泌的Aβ。
	<ol>
		<li>每隔24小时采集在标准条件（二维培养）下培养的7PA2细胞的培养基，并于-20 °C保存以供后续分析。</li>
		<li>每隔24小时采集在标准条件（三维培养）下培养的包封7PA2细胞的培养基，并于-20 °C保存以供后续分析。</li>
		<li>通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测7PA2细胞向收集的条件培养基中分泌Aβ的情况（图4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将微珠用于相关应用中的进一步研究。 
	注意：包封的7PA2细胞可用于评估持续Aβ分泌在任何模型中的影响。
	<ol>
		<li>为实现微珠在大鼠海马体脑内的移植，制备1 mm厚的大鼠脑冠状切片，并使用手术工具将微珠植入目标区域（图5）。</li>
		<li>按照所述方案，将不同类型细胞包封于海藻酸盐微珠中，以评估目标生物分子的持续释放。可进一步建立相关的体外和体内模型。</li>
		<li>使用流式细胞术和/或免疫荧光法检测包封细胞膜结合标志物的表达。 
		注意：Rios 20 描述了一种类似方法的应用实例，用于构建模拟肿瘤团块早期生长及生物标志物表达的微珠模型。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法可用于包封细胞，从而获得粒径分布较窄的海藻酸盐微珠27。该方法还具有使细胞在免疫隔离环境中生长的优势17,19，从而保护细胞免受外界应激因素的影响。此外，将细胞包封于海藻酸盐中能更真实地模拟生理条件，特别是在细胞间相互作用和基质刚度方面20。这些因素对于后续在相关应用中的使用尤为关键，例如在体内移植时可避免周围组织发生潜在的免疫反应17。此外，本方案的一个主要优势是可根据具体应用需求进行简便调节：可通过修改方案并优化制备参数，以生成更大或更小、更软或更硬的微珠。所描述的方法可用于制备足够小的微珠，以便通过微创方法注射，同时尺寸又足够大，能够容纳一定数量的细胞，并在注入动物模型后释放足量的Aβ，从而产生可观测的行为学和病理学效应。
该方案的成功依赖于多个关键步骤。仔细的细胞操作和优化的细胞培养技术对于维持细胞活力和功能至关重要20,28。采用标准培养条件可确保7PA2细胞正常功能的维持，正如观察结果所示。这使得包封细胞后Aβ1-42的释放谱与二维培养相比具有相似性。此外，为使本方案达到最佳效果，低粘度的海藻酸盐溶液相较于高粘度溶液可获得更优的结果。这可确保通过喷嘴挤出均匀的层流射流，并使细胞在制备的微珠基质中分布均匀27。用于细胞包封的材料必须具备极快的凝胶化机制，以保持形状稳定。
本方案中的另一个关键步骤是凝胶化后对制备的微珠进行处理。此处，我们展示使用大孔径塑料移液管转移微珠以实现微珠回收的方法。 alternatively，也可将含有微珠的氯化钙溶液倒入网状滤器中进行微珠回收。还可使用大容量（5、10 或 25 mL）刻度移液管吸取微珠，然后通过网状滤器冲洗，以替代倾倒方式。这种方法的优势在于与倾倒相比，操作的无菌性更有保障。然而，其局限性在于，移液管挤压可能导致部分微珠发生形变，此外，若大量微珠未能被回收，还可能造成得率降低。
该方法已被用于包封不同的细胞系，以建模和研究多种疾病（例如，从包封的胰岛细胞中释放胰岛素）。我们方法的创新之处在于，将采用本方案生成的微珠进行移植，作为一种在体内建模阿尔茨海默病重要特征的有效手段。与通过团注方式（如其他研究中报道的3,26）产生Aβ的方法相比，包封细胞释放Aβ的模式（图4）可实现更慢性且持续的Aβ释放。图6展示了可能达到的预期趋势。利用该系统进行体内建模更贴近疾病的实际进展过程，在药物发现与开发中具有更高的应用价值。
<img alt="静态平衡图；Aβ 浓度随时间变化；7PA2 藻酸盐微珠与团注给药的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：包封的 7PA2 细胞中 Aβ1-42 的预测释放曲线与团注给药的比较。 植入的含 7PA2 细胞的微珠中 Aβ 的释放曲线可用于在与阿尔茨海默病（AD）相关的动物模型中测试慢性且持续的 Aβ 作用。相反，团注给药会在短时间内引起 Aβ 水平急剧升高，随后 Aβ 会迅速从脑中被清除。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

由于大脑结构复杂且精细，神经退行性疾病的建模具有挑战性。根据淀粉样蛋白级联假说，阿尔茨海默病（AD）中突触功能进行性丧失以及神经元死亡，被认为是淀粉样前体蛋白（APP）异常加工导致淀粉样β肽（Aβ）持续过量产生并积聚的继发性后果1。
为了理解这种淀粉样蛋白诱导的病理机制，并协助发现新的治疗靶点，科学家们已开发出多种体内临床前模型。其中一类模型采用将合成的 Aβ 多肽一次性注入大鼠脑内的方法2,3,4。此类模型的主要局限在于，其依赖于单次或重复给予高浓度 Aβ 多肽，且所有剂量均一次性沉积。这与疾病过程中 Aβ 慢性、持续释放的特性不一致5。另一类体内模型为转基因动物模型，可表达一种或多种与家族性阿尔茨海默病相关的遗传突变6,7,8,9,10。然而，由于家族性阿尔茨海默病仅占所有阿尔茨海默病病例的不到 5%11，这些模型在向人类散发性阿尔茨海默病转化方面的相关性值得怀疑12。转基因方法的另一个缺点是从出生开始 Aβ 的形成速度加快，导致认知功能缺陷和病理改变出现得过于迅速和剧烈，难以模拟散发性阿尔茨海默病患者的疾病进展过程12。例如，5x FAD 模型在短短 1.5 个月内即可产生斑块13。
有趣的是，这两类模型均会导致与阿尔茨海默病（AD）研究相关的认知功能改变2,3,4,5,6，有时还伴随出现该疾病的病理学特征，例如淀粉样斑块6,8、tau蛋白磷酸化6,7和/或突触及神经元丢失7,9,14。然而，尽管这类模型可帮助我们了解脑内高水平淀粉样蛋白的影响——这通常与AD的晚期阶段相关——但它们未能反映因长期持续暴露于Aβ肽所引发的早期变化12，例如突触标志物表达的改变15以及细胞外基质成分的变化16。因此，目前仍需建立一种慢性模型，以更准确地展示持续Aβ分泌对体内认知功能的影响，并阐明病理学上的相关改变。
为此，我们开发了一种系统，可通过将分泌淀粉样蛋白的细胞固定在水凝胶微珠内，从而以受控方式持续、稳定地分泌 Aβ，并可将该微珠植入成年大鼠脑内，以模拟散发性阿尔茨海默病（AD）的某些方面。
海藻酸盐被选为生物材料，因其具有生物相容性，植入体内后不会引发任何不良反应17。过去四十年中，细胞在海藻酸盐水凝胶中的包封技术已得到充分建立。其首次临床转化应用的报道是用于治疗1型糖尿病17。最早成功包封朗格汉斯胰岛细胞的报道可追溯至1980年。含有胰岛素分泌细胞的微珠移植彻底改变了糖尿病患者的治疗选择，恢复了胰腺功能，从而无需依赖胰岛素注射治疗18。这些研究报道表明，细胞包封可保护细胞免受外界机械或化学因素造成的应激损伤。事实上，海藻酸盐微珠可作为屏障，将细胞与周围环境隔离，维持其表型特征，同时允许营养物质充分进入，并排出细胞代谢产物19。此外，使用海藻酸盐还可实现与软组织力学性能的匹配20。通过简单调节海藻酸盐浓度和交联密度，可将海藻酸盐水凝胶的刚度调控在1–30 kPa范围内20,21。这一特性至关重要，不仅有助于在体外维持包封细胞的表型表达，也有助于在体内移植后避免引发炎症反应22。
本方案中使用7PA2细胞——一种稳定转染了人源APP V717F突变基因的中国仓鼠卵巢细胞系23。这些细胞可持续产生APP的催化产物，包括Aβ1-4224,25，并已被用于在临床前急性体内研究中作为合成制备Aβ的替代方法26。我们描述了一种将7PA2细胞包埋于“软”海藻酸盐微珠内的制备方法，旨在实现生物分子的持续分泌。作为概念验证，我们报道了Aβ1-42肽随时间的释放情况。所使用的海藻酸盐为低黏度海藻酸盐，分子量为120,000–190,000 g/mol，甘露糖醛酸与古洛糖醛酸的比例为1.56（M/G）。
在后续研究中，可将这些微珠安全地移植到与阿尔茨海默病（AD）相关的 大鼠脑区（例如海马体），以研究慢性 Aβ 分泌对体内行为及离体病理的影响。 此外，该系统也可用于研究慢性 Aβ 释放对体外和离体实验的影响。例如，含有 7PA2 的海藻酸盐微珠可在体外与神经元或星形胶质细胞共培养，以评估慢性 Aβ 暴露对与 AD 相关的细胞机制的影响。此外，该方法还可用于在离体电生理实验中探讨慢性 Aβ 产生与长时程增强（LTP）之间的关系。
本实验方案的亮点在于其制备方法的模块化与灵活性，通过精细调节制备参数即可获得具有目标尺寸的海藻酸盐微球。根据具体应用需求，可调整本方案以实现对微球尺寸、包封细胞密度以及微球硬度等参数的定制化控制。本方案可用于多种细胞类型的包封，构建更具生理相关性的三维（3D）体外模型，用于研究不同病理过程。我们近期已报道了海藻酸盐包封细胞可用于模拟癌症进展的早期阶段20。
包埋过程的概念基于将悬浮于海藻酸盐溶液中的细胞以层流形式通过喷嘴挤出。振动喷头以可控频率打断液流，形成大小均一的海藻酸盐基液滴。外加电场可使形成的海藻酸盐基液滴分离，当其接触富含二价离子（如钙离子）的溶液时，可迅速发生交联，保持其球形形态。在凝胶化溶液中孵育，可形成球形微珠，其中包含包埋于均一物理水凝胶内的细胞。

关键词：包埋过程，海藻酸盐，层流挤出，振动喷头，液滴生成，电场分离，二价离子，钙离子，交联，水凝胶，微珠，细胞包封27微珠和海藻酸盐水凝胶的目标尺寸允许营养物质<s>s</s> 以及与细胞培养基进行长时间（数周）的气体交换。 图1A 显示所用封装装置的示意图（图1B).
<img alt="海藻酸盐-细胞包封示意图与装置：注射器、振动喷嘴、液滴生成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：包封系统。（A）包封系统的示意图。将海藻酸盐-细胞悬浮液装入注射器（2）中，并通过注射泵（1）设定的挤出速度送入储液器。在储液器中，振动帽（3）由波形发生器（4）设定频率进行振动，以等时间间隔打断液流，形成大小均一的液滴。当溶液通过喷嘴（5）形成液滴时，由电压发生器（6）设定的电极（7）施加静电势，使液滴表面轻微带电，从而因静电排斥力作用使液流分散。当液滴进入凝胶浴（8）后，海藻酸盐在 Ca2+ 作用下发生交联，形成球形微珠。（B）在制备海藻酸盐微珠前的包封装置照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
微珠的尺寸可根据预期用途进行调整。为了控制微珠的尺寸，需相应地调节图1A及本实验方案中所述的各项参数。所用喷嘴的内径对液滴尺寸具有显著影响；进一步调节包封参数（即挤出速度、振动频率和电压）是实现均匀尺寸分布的关键。表1概述了不同参数如何改变该系统所制备微珠的尺寸。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">参数</td>
			<td>喷嘴尺寸</td>
			<td>振动频率</td>
			<td>流速</td>
			<td>电极电压</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><img alt="向上的箭头符号，矢量插图，方向指示器，导航概念。" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Image 1"></td>
			<td><img alt="向上的箭头符号，矢量插图，方向指示器，导航概念。" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Image 1"></td>
			<td><img alt="向上的箭头符号，矢量插图，方向指示器，导航概念。" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Image 1"></td>
			<td><img alt="向上的箭头符号，矢量插图，方向指示器，导航概念。" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Image 1"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>微球尺寸</td>
			<td><img alt="向上的箭头符号，矢量插图，方向指示器，导航概念。" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Image 1"><img alt="向上的箭头符号，矢量插图，方向指示器，导航概念。" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Image 1"></td>
			<td><img alt="用于受力分析图中的静态平衡箭头符号。" src="/files/ftp_upload/59597/59597img02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Image 2"></td>
			<td><img alt="向上的箭头符号，矢量插图，方向指示器，导航概念。" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Image 1"></td>
			<td>–</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 制备参数及其对微珠尺寸的影响。该表格说明了各个参数如何影响所制备微珠的最终尺寸，而与所用喷嘴及溶液黏度无关。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;Manager 软件</td><td>Vale Lab, UCSF, 美国</td><td>v.1.46</td><td></td></tr><tr><td>0.22 µm PES 滤膜</td><td>Merck, 英国</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>15 mm Netwell 插入式培养小室，74 µm 网格滤膜</td><td>Constar, 美国</td><td>#3477</td><td></td></tr><tr><td>来自褐藻的海藻酸钠</td><td>Sigma-Aldrich, 英国</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich, 英国</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter96&amp;nbsp; AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒</td><td>Promega, 美国</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>包囊仪</td><td>Inotech</td><td>IE-50</td><td>序列号 05.002.01-2005</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, 英国</td><td>H4024</td><td></td></tr><tr><td>人 A&amp;beta; 1-42 ELISA 试剂盒</td><td>ThermoFisher, 英国</td><td>KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>ImageJ</td><td>v1.49p</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Leica 显微镜</td><td>Leica Microsystems, 英国</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS 相机</td><td>Andor, 英国</td><td>5.5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich, 英国</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich, 英国</td><td>433209</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠二水合物</td><td>Sigma-Aldrich, 英国</td><td>W302600-K</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich, 英国</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

用于阿尔茨海默病建模的β-淀粉样蛋白分泌海藻酸盐微珠的制备

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

根据淀粉样蛋白级联假说，阿尔茨海默病（AD）发病的最初诱因是毒性淀粉样蛋白-β（Aβ）片段的累积，最终导致该疾病的典型特征：淀粉样斑块、神经纤维缠结以及突触和神经元的丢失。目前缺乏能够反映疾病进展的相关非转基因临床前模型，这是阻碍有效药物治疗发现的主要因素之一。为此，我们开发了一种制备含有分泌淀粉样蛋白细胞的海藻酸盐微球的实验方案，可用于研究慢性Aβ生成的影响。
本研究使用了先前转染了人APP基因并分泌Aβ的中国仓鼠卵巢细胞（即7PA2细胞）。通过将7PA2细胞包埋于海藻酸盐中，构建了一种用于持续释放Aβ的三维（3D）体外模型。该制备过程经过优化，目标珠粒直径为500–600 μm，以适用于后续的体内研究。通过改变制备参数（如海藻酸盐浓度、凝胶流速、静电电位、喷头振动频率和凝胶溶液）对7PA2细胞在海藻酸盐中的包封进行了优化。在不同时间点分析并比较了海藻酸盐微珠与标准细胞培养方法所分泌的Aβ水平（最长至96小时）。
细胞浓度为 1.5 × 106 个 7PA2 细胞/mL，海藻酸钠浓度为 2%（w/v），用 HEPES 缓冲，并在 0.5 M 氯化钙中凝胶化 5 分钟，可制备出最稳定的微珠。所制备的微珠具有以下特点：1）粒径均一；2）平均直径为 550 μm；3）每粒微珠含有约 100–150 个细胞；4）能够分泌 Aβ。
综上所述，我们优化的含有产生淀粉样蛋白的7PA2细胞的稳定海藻酸盐微珠制备方法，可能有助于在体外和体内模拟阿尔茨海默病（AD）的重要特征。

7PA2 细胞已成功包封于海藻酸盐微珠中 
制备后，采用本方案成功制得均匀且呈球形的海藻酸盐微珠。图 2A 中的图像展示了改变其中一个参数（即电压）如何影响海藻酸盐液滴流的流动与分散情况。图 2B 展示了凝胶化过程结束后所获得的海藻酸盐微珠示例。
<img alt="电液动力喷射装置与实验结果；包括喷雾形成、颗粒分析、图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：制备方法的优化。（A）显示射流分散状态变化的照片。（B）制备后立即拍摄的海藻酸盐球形微珠的明场图像。（C）优化步骤示例：调节选定的制备参数以获得目标微珠尺寸。所选图表用于说明各参数与所得微珠尺寸之间的关系（数据来自至少 n = 100 个微珠的尺寸分布）。请注意，喷嘴内径、喷射溶液的黏度以及凝胶化条件也会影响所制备微珠的尺寸。误差线表示标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
所述方案具有灵活性，可根据不同应用制备不同尺寸、不同组成的海藻酸盐微珠。图2C展示了使用通过300 μm喷嘴挤出的2% (w/v)海藻酸钠HEPES溶液（pH 7.2），海藻酸钠流速、电压和频率对微珠尺寸的影响。
由于本研究的目标是制备可植入大鼠脑内的微球，我们调整了制备参数，以获得直径在500–600 μm范围内的微球。为确保质量控制，该方法经过优化，使所制备微球群体的变异程度最小（即尺寸分布较窄）。请注意：（1）所制备的微球可通过配备20G针头的哈密尔顿注射器注入大鼠脑内；（2）大鼠单侧脑半球可容纳两至三个该尺寸的微球。
优化后，将7PA2细胞以1.5 × 106 个细胞/mL的浓度包封于含HEPES缓冲的2%（w/v）海藻酸钠溶液中，并滴入0.5 M氯化钙凝胶浴，可获得理想的微珠。图3A显示了在标准细胞培养条件下培养一天后，包封的7PA2细胞在微珠中均匀分布。采用MTS法按照制造商说明书检测7PA2细胞的增殖情况。在七天培养期间，包封与未包封海藻酸钠的7PA2细胞行为之间无显著差异（图3B）。当在标准培养条件下孵育包封细胞时，细胞在整个实验过程中持续增殖，少量细胞逃逸现象亦可能发生，如其他研究中所报道28。通过降低包封时的细胞密度或减少微珠孵育过程中的血清浓度，可减轻此类影响。
<img alt="海藻酸盐微珠显微图像与吸光度图；二维与三维培养中细胞生长的比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：包封的7PA2细胞。（A）包封7PA2细胞的明场图像，显示细胞在海藻酸盐微珠内分布均匀。制备参数设定为每个微珠包封约150个7PA2细胞。在7天培养期间，未观察到海藻酸盐微珠存在显著变化。（B）与未包封在海藻酸盐中的7PA2细胞相比，包封在海藻酸盐中的7PA2细胞总体增殖未见明显差异。7PA2细胞可在海藻酸盐微珠内部生长并迁移；降低血清浓度可考虑用于减缓细胞生长速度。误差棒表示标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
包封7PA2细胞的海藻酸盐微珠在时间推移下保持稳定 
为研究所获得的海藻酸盐微珠的大小和形状，制备并凝胶化后进行了显微镜分析。采用选定方案获得的微珠平均直径为550 ± 2 μm。
理论上，直径为550 μm的微珠中预期的细胞数量可按如下方法计算：
<img alt="球体体积公式，V=4/3πr³，数学方程。" src="/files/ftp_upload/59597/59597eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">
其中 V 体积和 r = 半径。单个微珠的体积为 V = 8.8 x 10-5 mL；因此，包封时每微珠的细胞数 = (1.5 × 106) × (8.8 × 10-5) ≈ 130 个细胞。
实验中，我们在制备后立即对包封的细胞数量进行了计数。使用溶解液轻柔地破坏海藻酸盐微球，并用台盼蓝溶液对细胞进行染色。利用血细胞计数板对细胞活力进行评估和细胞计数；结果显示，每个微球平均含有116 ± 17个活细胞（n = 5，数据未报告）。如预期所示，在包封后立即观察到理论值与实验测得的细胞数量之间存在轻微差异。对于某些应用，特别是为了确定随时间释放的Aβ量，预测每个海藻酸盐微球中包封的细胞数量非常重要。
有趣的是，包封过程对细胞活力没有显著影响。相关结果已在先前的研究中报道，该研究采用类似方法包封了结直肠癌细胞（即 HCT-116），结果显示藻酸盐微珠中的细胞活力与二维对照组相比无差异20。
为测定包封过程中所用海藻酸盐的稳定性，我们测量了14天内微珠直径的变化（n = 100）。包封后14天的平均直径与包封后立即测量的结果相比未观察到明显变化（数据未报道）。
包封的 7PA2 细胞随时间释放 Aβ 
对 7PA2 细胞的二维和三维培养物的条件培养基进行分析，结果显示 Aβ1-42 水平持续升高。细胞培养基每 24 小时取样一次，最长持续四天，并采用 ELISA 进行分析。我们的数据表明，微珠（三维）中 Aβ1-42 的释放速率曲线与二维培养物中的释放曲线相似（图 4）。
<img alt="显示 Aβ_1-42% 增加（A）和细胞数量（B）随时间变化的图表；7PA2，二维与三维海藻酸盐微球。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：7PA2 细胞分泌 Aβ1-42 的速率。（A）二维和三维体外模型中 Aβ 释放量（以培养 4 天后归一化百分比表示）的变化趋势相似。两种模型在四天内 Aβ 水平均持续上升，且如预期所示，未达到稳定浓度。（B）将 Aβ1-42 浓度归一化至初始细胞数量后，显示无论培养方法如何，Aβ1-42 的分泌随时间变化趋势相似。海藻酸盐的存在或包封过程（三维体外模型）均未改变 Aβ1-42 的分泌特性。误差线表示标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
包封7PA2细胞的潜在应用 
我们报道了包埋于海藻酸盐微球中的7PA2细胞可有效用于持续释放Aβ1-42，因此可用于在任何临床前模型中检测慢性Aβ分泌的影响。在下方的图5中，我们展示了海藻酸盐微球的优势，这些微球可轻松注射并定位于大鼠脑内。此处使用离体脑切片进行说明，比较了毫米级海藻酸盐小球与制备的海藻酸盐微球。
<img alt="使用游标卡尺和琼脂培养基测量生物样本尺寸的实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：利用微珠进行相关临床前应用。 用于大鼠脑内移植的微珠必须足够小，以便植入时不会造成过大的损伤，避免对脑实质造成损害并影响正常脑功能。图像（A）显示了毫米级微珠与微米级微珠并列的尺寸对比。(B) 在脑内植入毫米级微珠用于体内实验是不可行的。图像（C）展示了采用本实验方案制备的微珠，其尺寸适合植入大鼠海马体，且不会对正常生理功能产生不利影响。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
上述图像强调了在这些研究中控制微珠尺寸的重要性。在此，我们展示了使用直径小于 600 µm 的微珠的优势。这使得可以采用微创注射（例如，哈密尔顿注射器）以更精确地控制微珠在脑内的注射位置。
综上所述，包封7PA2细胞可实现对微珠尺寸、包封细胞数量以及微珠释放Aβ水平（如浓度、释放曲线）的精确调控。控制微珠尺寸至关重要，原因有二：1）可对释放的Aβ浓度进行精细调节；2）便于在大鼠脑部特定区域进行可控性植入。本研究结果描述了海藻酸盐微珠的简便调控方法，并强调了其在后续研究中的潜在应用价值。

本方案通过海藻酸盐的快速物理凝胶化来包封细胞，从而实现细胞的固定化。所获得的微珠能够随时间可控且持续地分泌β-淀粉样蛋白，可用于研究分泌型β-淀粉样蛋白在体外和体内模型中的作用。

根据淀粉样蛋白级联假说，阿尔茨海默病（AD）发病的最初触发因素是毒性...

本方案介绍了微珠的制备方法，这些微珠将用于调控淀粉样蛋白（一种目标蛋白）的释放速率和释放量。微珠可将细胞固定在合适的生物材料中，使其免受周围环境的影响，同时允许细胞与周围环境交换代谢产物和营养物质。采用此技术包封细胞，可通过调节多种制备参数，精确控制微珠的尺寸和细胞数量。因此，将本方案中所述细胞进行包封，可实现淀粉样蛋白的持续释放，从而用于体外和体内实验系统。该方法有助于我们更深入地理解疾病的发生机制，并可用于测试新的治疗方法。此技术可用于构建可控释放系统，研究多种细胞类型单独或联合培养时任何生物分子的释放情况。首先，从培养箱中取出一个接近汇合的培养瓶。用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液处理细胞，在37°C孵育5至10分钟以使细胞脱落。加入DMEM/F12培养基后，将细胞收集至50毫升离心管中。在1000 RPM条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于HEPES缓冲盐溶液中，使细胞终浓度为所需浓度的两倍。在50毫升离心管中，将该细胞悬液与4%（重量/体积）海藻酸钠溶液按1:1比例混合，得到终浓度为所需细胞浓度、含2%（重量/体积）海藻酸钠的细胞悬液。为设定包封参数，先将包封仪的挤出速度调至最大，然后设定电压和频率。制备微珠时，取5毫升细胞-海藻酸盐悬浮液加入20毫升注射器中，并将该注射器连接至包封仪。启动包封仪，开启流体驱动，使细胞-海藻酸盐悬浮液通过进样管，并从喷嘴处挤出液滴流。初始1毫升收集至废液烧杯中，以避免初始阶段液流不均匀。 然后继续注入剩余的四毫升溶液，使液滴落入氯化钙胶凝浴中。液滴一旦接触胶凝浴，其中的海藻酸钠会立即与胶凝浴中的钙离子发生交联，形成球形微珠。一分钟后，将胶凝烧杯从磁力平台上取下，静置微珠，不再搅拌，于室温下继续固化四分钟，以完成胶凝过程。为回收微珠，首先使用无菌镊子去除所有较大的海藻酸盐碎片或杂质。将塑料移液管末端剪去后，用其将微珠从胶化浴转移至置于废液杯上方的74微米网筛中。为确保操作成功，我们每次转移微珠时都会剪去塑料移液管的末端，以避免损伤微珠，此步骤在微囊化后每次将微珠从一个容器转移至另一容器时均需执行。将网状滤器倒置在离心管上。用移液器吸取适量培养基加入其中，冲洗珠子进入离心管，并使其在该培养基中平衡5分钟。随后将珠子转移至预先加入适量培养基的培养瓶中，用于后续孵育和实验。为了评估包封后及培养期间的细胞活力，加入溶解液以轻柔破坏微珠并释放包封的细胞。将细胞置于含5%二氧化碳、37°C的细胞培养孵育箱中孵育10分钟，并伴随轻柔振荡。通过台盼蓝染色并使用血细胞计数板，估算这些细胞的存活率。为评估微珠的稳定性，使用显微镜和成像软件，在一段时间内定期测量各微珠群体样品的平均直径。制备完成后，采用本方案成功生成了均匀且呈球形的海藻酸盐微珠。在标准细胞培养条件下培养一天后，包埋的7PA2细胞在微珠中分布均匀。采用MTS法检测7PA2细胞增殖时，发现在七天培养期间，添加藻酸盐与未添加藻酸盐的7PA2细胞的生长行为无显著差异。对7PA2细胞的二维（2D）和三维（3D）培养条件培养基进行分析，结果显示两种培养条件下淀粉样蛋白-beta 1-42的水平均持续升高。微珠（即3D培养）中淀粉样蛋白-beta 1-42的释放速率曲线与二维培养中的释放曲线相似。包埋在海藻酸盐微球中的7PA2细胞可有效用于持续释放淀粉样β蛋白。用于移植到大鼠脑内的微球必须足够小，以确保植入时不会造成较大的组织损伤。若将毫米级的微球植入脑内用于体内实验则不可行，而采用本方案制备的微球尺寸适宜，可成功插入大鼠海马体中。为了确保最终产品中细胞分布均匀，必须充分混匀细胞-海藻酸盐悬浮液中的细胞，从而保证每个微珠释放的淀粉样蛋白量一致。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

制造淀粉样蛋白-β-分泌阿尔金酸微珠,用于模拟阿尔茨海默氏病

阿尔茨海默病的一个特征是Aβ1-42肽水平升高。本文提供了一种合成Aβ1-42寡聚体的实验方案，该寡聚体可损害海马区的长时程增强作用（Long-Term...

制备寡聚态β-淀粉样蛋白1-42并诱导海马脑片突触可塑性损伤

在以下章节中，我们概述了用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备方法。我们重点介绍一种用于制备多层海藻酸盐微球的技术，该技术可同时包封细胞和蛋白质，有望用于治疗1型糖尿病。...

用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备

本视频演示了将单体淀粉样肽注射到成年斑马鱼前脑以产生淀粉样毒性，模拟阿尔茨海默病中观察到的神经元损伤。...

通过淀粉样肽注射在斑马鱼脑内建立阿尔茨海默病模型

本视频演示了注射淀粉样蛋白β肽、氯化铝和一种神经炎症性生长因子的操作步骤，这些物质共同促进海马区毒性淀粉样斑块的形成。这会导致大鼠出现记忆障碍，具有阿尔茨海默病的典型特征。...

通过淀粉样蛋白-β肽注射建立阿尔茨海默病大鼠模型

本视频演示了一种制备包封分泌神经毒性β-淀粉样蛋白细胞的聚合物微珠的方法。将细胞-聚合物悬浮液通过微珠制备装置处理，通过钙离子交联实现聚合物凝胶化，从而在细胞周围形成球形微珠。该聚合物可支持细胞增殖，同时允许可控且长期地释放β-淀粉样蛋白，模拟其在阿尔茨海默病中的累积过程。...

用于模拟阿尔茨海默病的β-淀粉样蛋白释放型聚合物微球的制备

此处介绍一种直接立体定位脑内灌注淀粉样蛋白β的实验方案。该方法提供了一种替代性策略 体内 用于研究淀粉样蛋白-beta...

小鼠海马内立体定位注射寡聚化β-淀粉样蛋白

通过渗透泵输注抗体治疗可抵消慢性β-淀粉样蛋白寡聚体灌注动物模型中的神经退行性变

我们开发了一种定量三维方法 计算机模拟 脑部建模（q3DISM） 淀粉样蛋白-β（Aβ） 阿尔茨海默病啮齿类动物模型中单核吞噬细胞的吞噬作用。该方法可广泛用于几乎任何吞噬事件的定量分析 体内.

阿尔茨海默病啮齿类动物模型中脑内淀粉样蛋白-β吞噬作用的定量三维in silico建模（q3DISM）

本实验方案旨在通过评估空间记忆障碍、神经元病理学改变、神经元内淀粉样β蛋白（Aβ）沉积以及神经纤维缠结的聚集情况，建立一种模拟大鼠阿尔茨海默病的模型。该模型通过联合注射Aβ25-35、三氯化铝及重组人转化生长因子-β1诱导而成。...

通过脑室内注射复合β-淀粉样蛋白建立大鼠阿尔茨海默病动物模型的有效模拟方法

关键词：阿尔茨海默病，动物模型，大鼠，脑室内注射，β-淀粉样蛋白，Aβ，神经退行性疾病，认知功能障碍，病理模拟

本方案描述了如何从合成肽制备Aβ寡聚体 体外...

A11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

本文描述了一种重建人源γ-分泌酶的酵母系统。该系统可用于鉴定和研究影响酶活性的突变，并可用于筛选γ-分泌酶抑制剂（GSIs）。利用家族性阿尔茨海默病突变体的功能丧失特性，还可用于筛选γ-分泌酶调节剂（GSMs）。...

Saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

了解利用海藻酸钙快速凝胶化技术封装7PA2细胞制备微珠的方法，用于控制淀粉样蛋白-β的持续释放。该技术为研究阿尔茨海默病机制和开发治疗策略提供了可靠的体外和体内实验模型。

用于阿尔茨海默病建模的β-淀粉样蛋白分泌海藻酸盐微珠的制备

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