制造淀粉样蛋白-β-分泌阿尔金酸微珠,用于模拟阿尔茨海默氏病

该协议解释了微珠的制造，这将有助于控制释放率和淀粉样蛋白的含量，这是一种感兴趣的蛋白质。微珠将固定细胞在合适的生物材料，它会保护他们远离其周围环境，以及允许他们交换副产品和营养物质与周围的环境。使用这种技术封装细胞可确保严格控制微珠大小和细胞数，我们通过调整各种制造参数来做到这一点。

因此，封装本协议中描述的细胞将给我们更多的淀粉样蛋白的慢性释放，用于体外和体内系统，这个想法是，这将让我们更好地了解疾病的机制，也使我们能够测试新的治疗方法。这种方法可用于制定控制系统，并研究许多细胞类型的任何生物分子的释放，无论是单独还是组合。首先，从培养箱中取出一个近汇的烧瓶。

用0.25%的三辛-EDTA溶液治疗细胞，并在37C孵育5至10分钟，分离细胞。添加DMEM/F12介质后，将细胞收集到50毫升管中。以 1000 RPM 的速度将电池离心五分钟。

去除上流剂，重新悬浮在 HEPES 缓冲盐水中的颗粒，使最终所需的细胞浓度翻倍。在50毫升离心管中，将该细胞悬浮液与4%的重量和体积藻酸盐溶液以一比一的比例混合，以获得含有2%重量和体积藻酸盐溶液所需细胞浓度的最终悬浮液。要设置封装参数，请将封装机的速度设置为最大挤出速度，然后设置电压和频率。

为了制造微珠，在20毫升注射器中，加载5毫升的细胞-藻酸盐悬浮液，并附在封装器上。要启动封装器，请激活将细胞-藻酸盐悬浮液通过进纸器的流量，水滴流将挤出喷嘴。在废杯中收集第一毫升，以避免最初的不均匀流。

然后继续运行剩余的四毫升，让液滴落入氯化钙凝胶浴。与凝胶浴接触后，液滴中的藻酸盐会立即与凝胶浴中的钙离子交叉连接，形成球形微珠。一分钟后，从磁性平台上取出凝胶烧杯，让微珠再休息四分钟，无需搅拌，即可在室温下完成凝胶。

要取回微珠，首先使用一对无菌钳子清除任何大型藻酸盐碎屑或伪物。切割塑料移液器末端后，使用它将微珠从凝胶浴转移到 74 微米网状过滤器中，该过滤器被固定在废杯上。为了确保成功，我们总是切割塑料移液器的末端，以避免损坏微珠，我们这样做，每次我们转移珠子从一个容器到另一个容器后封装。

在离心管上反转网状过滤器。将适当的培养基移掉，将珠子向下管中冲洗，并允许它们在该培养基中平衡五分钟。然后将它们转移到以前充满适当介质的烧瓶中，用于孵化和进一步实验。

要评估封装和培养后细胞的可行性，添加溶解混合物以轻轻破坏微珠并释放封装的细胞。在细胞培养培养箱中孵育细胞，在37摄氏度下补充5%二氧化碳，10分钟，轻轻搅拌。通过用锥蓝染色和使用血细胞计室来估计这些细胞的细胞生存能力。

要评估微珠稳定性，请使用显微镜和成像软件测量每个微珠群体样本的平均直径。经过制备，使用本协议成功生成均匀和球面藻酸盐微珠。在标准细胞培养条件下一天后，封装的7PA2细胞均匀分布于微珠中。

当使用MTS测定测试7PA2细胞增殖时，在7天期间生长有或没有藻酸盐的7PA2细胞的行为没有显著差异。从 7PA2 细胞的 2D 和 3D 培养物分析的有条件介质显示，两种培养物中的淀粉样蛋白-1-42 水平持续增加。从微珠（或 3D 培养子）释放淀粉样蛋白-β 1-42 的速率与 2D 培养素释放的轮廓相似。

封装在藻酸盐微珠中的7PA2细胞可有效用于淀粉样蛋白-β的持续释放。用于大鼠大脑的微珠必须足够小，才能嵌入而不产生大病变。将一毫米大小的珠子植入大脑供体内使用不起作用，而使用该协议制造的微珠具有合适的大小，可以插入大鼠的海马体内。

为了确保我们最终产品中的细胞分布均匀，在细胞藻酸盐悬浮液中彻底混合细胞非常重要，这保证了每个微珠中淀粉样蛋白的均匀释放。