通过尺寸排阻色谱-多角度光散射联用技术（SEC-MALS）对蛋白质进行表征

SEC-MALS 是一种用于测定溶液中大分子分子量、尺寸和构象的定量方法。该方法可鉴定寡聚体和复合物，并表征难以处理的样品，如糖蛋白和膜蛋白。SEC-MALS 是一种绝对测定方法。

它基于基本的物理原理，不依赖于分子标准品、分子构象或与分离介质相互作用方式的协作。SEC-MALS 可应用于通过 SEC 分离的多种体系，从小肽和小分子聚合物到蛋白质、核衣壳、多糖、合成聚合物、病毒样颗粒以及小型病毒等。

必须确认您的系统和缓冲液符合厂商对低颗粒物含量的建议要求。请咨询厂商的技术支持代表以确保符合要求。按照文本方案中的描述，开始准备SEC-MALS系统。

使用每种色谱级试剂，配制含有 50 至 100 毫摩尔氯化钠的一升磷酸盐缓冲液。使用瓶装聚醚砜滤膜或类似滤器将缓冲液过滤至 0.1 微米。为去除干燥滤器中的微粒，先将前 50 至 100 毫升缓冲液滤入废液瓶中弃去。

然后，将剩余液体过滤至一个洁净的无菌瓶中，该瓶子此前已用过滤的去离子水清洗，并保持密封以防止灰尘进入。以每分钟0.5毫升的流速过夜冲洗色谱柱，使色谱柱在缓冲液中充分平衡，并去除颗粒物。使用FPLC的连续流模式，并确保在完成所有SEC-MALS运行之前，流速不中断。

在过夜冲洗期间，将 DRI 流通池置于吹扫模式。开始冲洗时，应逐步提高流速，以防止因色谱柱内压力突然变化导致的柱填料脱落现象。在开始进样前，关闭吹扫功能。

通过轻轻敲击色谱柱下游的管路，释放积聚的颗粒，以检查系统的清洁度。观察MALS仪器前面板显示屏上90度检测器的信号。确认峰-峰值噪声不超过50-100微伏。

同时确认折光率（RI）信号的稳定性优于1 × 10⁻⁷折光率单位。进行空白进样以确认进样器无颗粒物污染。空白样品即为在全新无菌小瓶中配制的流动缓冲液。

如果颗粒峰的体积不超过一毫升，且峰高不超过基线以上五毫伏，则系统已准备好进行样品分析。否则，需继续进行空白进样直至系统洁净，或执行维护程序以清洗进样器。现在，用 SCC 缓冲液配制至少 200 微升、浓度为每毫升一至二毫克的 BSA 溶液。

使用注射器滤器将蛋白质溶液过滤至0.2微米。弃去最初几滴滤液，以去除干燥滤器中的颗粒。或者，将样品在10,000 × g下离心15分钟，使不溶性聚集体及其他较大颗粒沉淀。

然后，向进样环中注入 100 微升 BSA 溶液。在 MALS 软件菜单中，从方法中新建实验。接着，从光散射系统的方法文件夹中选择在线方法。

如果存在DLS检测器，请从带QELS的光散射文件夹中选择在线方法。在配置部分设置样品和流动相的参数。在通用泵界面中，将流速设置为FPLC中所用的流速。

然后，进入通用泵视图，选择溶剂分支的名称字段，并选择 PBS。在进样器视图中，进入样品分支，将名称设为 BSA。将 dn/dc 设为 0.185，A2 设为 0，紫外消光系数设为 0.667 毫升每毫克厘米。

在程序部分的“基本采集视图”中，选中自动进样上的复选框触发。将运行时间设置为 70 分钟，以便在整个洗脱过程中收集数据，直至达到 SEC 柱的总渗透体积。在 MALS 软件中点击“运行”按钮以开始实验。

在通过MALS检测器接收到来自FPLC仪器的脉冲信号后，系统将开始读取数据。点击仪器前面板上的自动调零按钮，将DRI信号归零。在FPLC软件中，进入手动模式，执行手动指令，设置标记，并输入蛋白质名称和运行编号。

将进样阀在流路中的位置从手动上样切换至进样状态。在IO盒的数字脉冲输出中插入一个持续0.5秒的脉冲信号，以触发MALS软件中的数据采集。

现在将样品注入进样环。在FPLC软件中点击“执行”以开始实验运行。在MALS软件的“操作步骤”部分，逐步进行分析。

通过检查基础收集视图，确认紫外（UV）、多角度激光散射（MALS）和示差折光（RI）信号的峰出现在近似相同的洗脱体积处。在基线视图中，为所有信号定义基线。在峰视图中，通过单击并拖动鼠标来定义需要分析的峰。

选择每个峰中央的50%区域。首先选择单体峰，然后选择二聚体峰。在每个峰下方，验证BSA的dn/dc值以及280纳米处的消光系数是否正确。

在操作步骤的峰对齐视图中，通过单击并拖动鼠标来选择峰的中心区域。单击“对齐信号”，然后单击“确定”。在操作步骤的峰展宽视图中，选择单体峰中心区域的50%。

确保将折光率检测器指定为参考仪器。然后单击“执行拟合”，并应用该设置以使紫外光和光散射信号与折光率信号相匹配。放大峰图，确认它们在中心区域50%至70%范围内高度重叠，然后单击确定。

在操作步骤中，选择归一化视图，选中第一个峰。输入 3.0 纳米作为 RG 值，点击归一化，然后点击确定。在 EASI 图形视图中查看结果图表。

在窗口顶部的下拉菜单中选择摩尔质量。按住 control 键，点击并拖动以放大峰区域。要查看单体和二聚体峰的最终列表化重均摩尔质量结果，请导航至峰结果、摩尔质量矩、MW，然后选择结果报告摘要。

纯度以峰结果中的质量分数表示。从文件菜单中选择“另存为方法”，并将分析得到的 BSA 数据保存为标准方法，用于今后所有类型蛋白质的测定。针对 BSA 确定的归一化和谱带展宽参数将在后续分析中沿用。

此处展示的是使用200埃孔径排阻色谱柱对牛血清白蛋白（BSA）进行的SEC-MALS分析。色谱图曲线已相对于单体峰进行了归一化处理，并为清晰起见进行了偏移。图中指出了可忽略的常见伪影，包括在光散射信号起始处附近的颗粒峰，以及在折射率信号中接近总渗透体积时的盐峰和溶解空气峰。

色谱图显示出优异的单体-二聚体-三聚体分离效果，且光散射信号具有较高的信噪比。单体和二聚体的重均摩尔质量值表现出高度均一性。以下是低质量SEC-MALS分析的示例。

在此示例中，使用孔径为75埃的尺寸排阻色谱柱分离效果不佳，导致在8到9分钟之间出现一个颗粒峰，该峰与蛋白质峰未能良好分离。此处信噪比不足，且在光散射信号中明显可见大量与蛋白质相邻的颗粒。获得良好SEC-MALS结果的关键在于选择合适的色谱柱，确保系统经过校准且光散射噪声较低，并对样品进行预过滤或离心处理以去除颗粒物。

在完成尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）后，可进一步通过结合亲和力分析、生物层干涉技术、表面等离子共振、等温滴定 calorimetry、生物发光共振能量转移、微尺度热泳动或组成梯度多角度光散射等方法对蛋白质样品进行分析。蛋白质结构可通过X射线晶体学、冷冻电子显微镜技术或核磁共振（NMR）来确定。