Name: 蛋白质的表征(按尺寸-排除色谱与多角度光散射相结合(SEC-MALS) (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习尺寸排阻色谱与多角度光散射联用技术（SEC-MALS），用于溶液中蛋白质及复合物的绝对分子量与粒径表征。该方法无需标准品即可准确鉴定寡聚体、糖蛋白等复杂生物大分子的结构特性。

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感谢希伯来大学沃尔夫森应用结构生物学中心的Tsafi Danieli博士提供的建议与合作。同时感谢以色列雷霍沃特市的Daniel Biotech有限公司在本研究中所使用的分析型FPLC-MALS系统的建立与技术支持。

1. 系统的准备
<ol>
	<li>将MALS和dRI检测器连接在FPLC的UV检测器下游。绕过pH和电导检测器，因为它们会显著增加UV检测器与MALS检测器之间的检测器间体积。使用内径为0.25 mm的毛细管将色谱柱连接至各检测器之间，检测器出口则使用内径为0.75 mm的毛细管连接至废液或组分收集器。</li>
	<li>确保FPLC与各检测器之间的必要信号连接已建立，包括将UV检测器的模拟输出连接至MALS的模拟输入端口，以及通过FPLC的I/O盒将FPLC的数字输出连接至MALS的Autoinject接口。</li>
	<li>安装一根适用的分析型SEC色谱柱，其分离范围至少覆盖20 kDa至500 kDa。查阅产品信息，确认该色谱柱是否适用于样品及流动相的分子量范围、pH值及其他理化性质。</li>
</ol>
2. 缓冲液的配制、系统过夜冲洗及清洁度检查
<ol>
	<li>使用高效液相色谱级试剂，配制含 50 - 100 mM NaCl 的 1 L 磷酸盐缓冲液。使用瓶顶式聚醚砜滤器或类似装置将缓冲液过滤至 0.1 µm。先将前 50-100 mL 缓冲液过滤至废液瓶中并弃去，以去除干燥滤器中的颗粒物，然后将剩余缓冲液过滤至已用过滤去离子水彻底清洗并加盖以防止灰尘进入的洁净无菌瓶中。 
	注意：如果需要分析在其他溶剂中溶解性更优的蛋白质，可使用 Tris 缓冲液等其他流动相溶剂。</li>
	<li>以 0.5 mL/min 的流速过夜冲洗，或按照色谱柱制造商的建议进行冲洗，使色谱柱在缓冲液中充分平衡并去除颗粒物。使用 FPLC 的连续流模式，并确保在所有 SEC-MALS 运行完成前流速不中断。
	<ol>
		<li>在过夜冲洗期间，将 dRI 流通池置于清洗模式。在开始样品进样前关闭清洗功能。</li>
		<li>开始冲洗时，应逐步升高流速，以防止因色谱柱内压力突变导致的&#34;柱脱屑&#34;现象（或颗粒释放）。</li>
		<li>若系统已知稳定且无颗粒，且已与目标流动相达到平衡，可用较短的 2-3 小时冲洗替代过夜冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过轻敲柱后端管路以释放积聚的颗粒，并观察 MALS 仪器前面板显示器上 90° 检测器的信号，检查系统清洁度。确认峰-峰值噪声不超过 50 -100 µV。</li>
	<li>进行一次“空白”进样，以确认进样器无颗粒污染。“空白”样品即为新配制于洁净无菌小瓶中的运行缓冲液。
	<ol>
		<li>若颗粒峰体积不超过 1 mL，且峰高不超过基线以上 5 mV，则系统已准备就绪可进行样品分析。否则，需重复进行空白进样直至系统清洁，或执行维护操作以清洁进样器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品的制备与上样
<ol>
	<li>在SEC缓冲液中配制至少200 µL、浓度为1-2 mg/mL的BSA溶液。 
	注意：为防止沉淀，切勿将BSA溶解于纯水中。</li>
	<li>使用注射器滤器将蛋白溶液过滤至0.02 µm。</li>
	<li>弃去滤液的前几滴，以去除干燥滤器中的颗粒物。</li>
	<li>或者，将样品在10,000 × g 条件下离心15分钟，使不溶性聚集体及其他大颗粒沉淀。</li>
	<li>将100 µL BSA溶液注入进样环。 
	注意：此为推荐上样量，可根据样品的稳定性或可获得性适当增减。每次进样所需的蛋白量与其分子量成反比——若蛋白分子量为33 kDa（即BSA分子量的一半），则所需蛋白质量应为BSA的两倍。</li>
</ol>
4. MALS 软件的准备
<ol>
	<li>在 MALS 软件菜单的 方法 中打开 新建 | 实验，然后从 光散射 系统方法文件夹中选择 在线 方法。如果存在 DLS 检测器，请从 光散射 | 含 QELS 文件夹中选择 在线 方法。</li>
	<li>在 配置 部分，设置样品和流动相的参数。
	<ol>
		<li>在 通用泵 视图中，将流速设置为 FPLC 中使用的流速。</li>
		<li>在 通用泵 视图的 溶剂 分支的 名称 字段中，选择 PBS。</li>
		<li>在 进样器 视图的 样品 分支中，将 名称 输入为 BSA，并设置 dn/dc = 0.185（未修饰蛋白质的标准值），A2 = 0，紫外消光系数 = 0.667 mL/(mg-cm)。 
		注：对于其他蛋白质，可在文献中查找其在 UV280 nm 处的消光系数，或使用各种公共软件工具根据其序列进行计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 程序 部分的 基本采集 视图中，勾选 自动进样触发 复选框，并将运行时长设置为 70 分钟，以便在整个洗脱过程中采集数据，直至达到 SEC 柱的总渗透体积。 
	注：所需时间可能因色谱柱和流速而异——对于一根标准的 7.8 mm × 300 mm HPLC-SEC 柱，在 0.5 mL/min 流速下需要采集 35 分钟。</li>
	<li>在 MALS 软件中点击 运行 按钮以启动实验。系统将在通过 MALS 检测器接收到 FPLC 仪器的脉冲信号后开始读取数据。</li>
	<li>点击仪器前面板上的 自动调零 按钮，对 dRI 信号进行调零。</li>
</ol>
5. FPLC 软件的准备
<ol>
	<li>在 FPLC 软件中，进入手动 | 执行手动指令 | 设置标记，输入蛋白名称和运行编号。</li>
	<li>在流路 | 进样阀下，将进样阀从手动上样切换至进样。</li>
	<li>在I/O 模块 | 脉冲数字输出中插入一个 0.5 秒的脉冲信号，以触发 MALS 软件中的数据采集。</li>
</ol>
6. 将样品注入进样环。在FPLC软件中点击“执行”以开始实验运行。
7. SEC-MALS BSA 数据分析
<ol>
	<li>在 MALS 软件的 Procedures 部分中，逐步执行分析。
	<ol>
		<li>通过检查 Basic Collection 视图，确认在 UV、MALS 和 RI 中的峰出现在大约相同的洗脱体积处。</li>
		<li>在 Baseline 视图中，为所有信号（所有 LS 检测器、UV 和 dRI）定义基线。基线应指示纯溶剂的水平，最好从样品峰的一侧延伸至另一侧。</li>
		<li>在 Peaks 视图中，通过单击并拖动鼠标来定义要分析的峰。选择每个峰的中心 50% 区域。首先选择单体峰（“Peak 1”），然后选择二聚体峰（“Peak 2”）。验证 BSA 在每个峰下的 dn/dc = 0.185 和 UV 280 nm 消光系数 = 0.667 的值是否正确。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行峰对齐、峰展宽校正和归一化操作。 
	注：通常，SEC-MALS 方法会定期使用一种均分散蛋白（如 BSA 单体）进行校准，以实现峰对齐、峰展宽校正以及将角度检测器相对于 90° 检测器进行归一化，该蛋白的回转半径 Rg &#60; 10 nm。在本示例中，BSA 既作为校准分子，也是分子量分析的对象。
	<ol>
		<li>在 Procedures | Alignment 视图中，通过单击并拖动鼠标选择峰的中心区域，点击 Align Signals，然后点击 OK。</li>
		<li>在 Procedures | Band Broadening 视图中，选择单体峰的中心 50% 区域。确保将 RI 检测器指定为 Reference Instrument，然后点击 Perform Fit 和 Apply，以使 UV 和 LS 信号与 RI 信号匹配。
		<ol>
			<li>放大峰区域，确认它们在中心 50–70% 范围内高度重叠，然后点击 OK。</li>
			<li>如果重叠不完全，可能需要再次执行拟合并 &#34;Apply&#34; 一到两次，直到重叠效果良好。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 Procedures | Normalization 视图中，选择 Peak 1，输入 3.0 nm 作为 Rg 值，点击 Normalize，然后点击 OK。</li>
		<li>在 Procedures | Molar Mass and Rg from MALS 视图中，查看数据以确定哪些检测角度由于噪声过大应从分析中取消选择。通常，这些是低角度方向，其中灰尘颗粒散射出相对高强度的光。从右侧图中选择峰内的单个片段，并在左侧图中查看逆约化瑞利比的角依赖性。如果最低（有时也包括最高）角度持续显著偏离拟合曲线，则从视图底部的列表中取消选择这些角度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 EASI Graph 视图中查看结果图。从窗口顶部的 Display 下拉菜单中选择 Molar Mass。使用 Ctrl + 单击并拖动以放大峰区域。</li>
	<li>在 Results | Report (summary) 视图下的 Peak Results | Molar mass moments (g/mol) | Mw 中查看单体和二聚体峰的最终加权平均分子量结果。纯度信息位于 Peak Results | Mass fraction(%) 下。 
	注：其他分子量矩也已显示；这些通常适用于异质聚合物，而不适用于具有离散尺寸的蛋白质。软件生成的许多其他结果也可包含在报告中，例如质量回收率百分比（通过浓度检测器洗脱的蛋白占注入量的比例）、峰统计值、多分散性、Rg 和 Rh 矩等。当提供不确定性度量时，其反映的是基于测量序列内噪声对所引用数值的精密度，不应视为代表准确性。报告值的真实准确性取决于多种因素，例如提供的 dn/dc 和消光系数值的准确性、仪器校准等。</li>
	<li>从 File 菜单中选择 Save as Method，将已分析的 BSA 数据保存为未来所有类型蛋白质测量的标准方法。针对 BSA 确定的归一化和峰展宽参数将在后续分析中沿用。</li>
</ol>

DS 是 Wyatt Technology Corporation 的员工，该公司生产的 MALS 产品在本方案中被使用。AT 是 Danyel Biotech 的员工，该公司是 Wyatt MALS 和 AKTA FPLC 仪器的经销商。

SEC-MALS 实验实现了单体、二聚体和三聚体的良好分离，并对每个峰的摩尔质量及流体力学尺寸提供了定量结果。这进而能够清晰地鉴定和表征每一种存在的组分，同时量化其纯度。通常，所获得的结果准确度在 5% 以内，精密度和重复性在 1–2% 以内3,69。如此高的精密度和重复性使得我们能够可靠地区分分子量相近的组分，只要它们在 SEC 中得以分离（即使在同一峰内存在部分重叠）。该方法在蛋白质质量控制和基础生物物理表征方面的优势显而易见。
验证无颗粒物存在对于灵敏且可重复的SEC-MALS测量至关重要。颗粒物峰通常表现为较大的MALS信号，而无相应的UV或RI信号。应仔细制备流动相和样品，以消除此类颗粒。建议使用HPLC级或更高级别的试剂，将流动相和稀释缓冲液过滤至0.1 - 0.2 µm（使用前先冲洗滤膜，以去除干膜表面始终存在的颗粒），为SEC-MALS专用准备超洁净的流动相瓶及其他玻璃器皿，并在流动条件下延长色谱柱平衡时间（以去除在流速停止或色谱柱未使用期间可能积聚的颗粒物和聚集体）。样品应过滤至不截留目标物质的最小孔径，通常不超过0.1 µm，若条件允许，应使用0.02 µm。若滤膜迅速堵塞，可对样品进行离心处理、采用逐级递减孔径的多步过滤，和/或重新纯化。当系统始终使用高质量、新鲜且经过过滤的流动相，避免色谱柱受到冲击，样品保持洁净且不吸附于色谱柱时，测量结果将不会出现上述颗粒物噪声，并可获得高质量数据。
MALS 对蛋白质常用的 SEC 缓冲液无特殊要求；除 PBS 外，还可使用多种其他缓冲体系，包括多种辅料，以优化分离效果和稳定性71MALS 对具体色谱柱的选择不敏感，色谱柱应根据最佳分离效果和回收率进行选择。对于辅料而言，分析中的主要关注点是其折射率的显著变化，这会导致特定折射率增量的改变。 dn/dc，以及在需要紫外分析时会吸收280 nm波长的辅料。例如，精氨酸是一种常见的减少聚集的辅料，可能显著影响 dn/dc 典型蛋白质的，甚至使其进入负值范围（一种具有负值的蛋白质） dn/dc 如果仍可通过SEC-MALS进行分析 dn/dc 由经验确定，但如果 dn/dc = 0 时，蛋白质散射的光强度将为零，分子量分析将无法进行）。关于该主题的 dn/dc 关于蛋白质的值，赵 et al. 进行了广泛讨论。35 其中显示，对于标准水性缓冲液，绝大多数未经修饰的蛋白质的数值在标准值（在 = 660 nm 时为 0.185 或 0.186 mL/g）的 2–3% 范围内，但分子量低于约 10 kDa 的蛋白质变异性较大，且有少数种类可能高达 0.21 mL/g。
在所提供的数据中，BSA 单体和二聚体峰的分子量（MW）分布均表现出高度均一性，偏差在 2% 或以内，表明为单一分散的物种。峰内分子量数值不均匀可能源于样品异质性或分析不当。特别是，若 BSA 的分子量分布呈凹形（“微笑”状）或凸形（“皱眉”状），可能是由于未正确应用峰展宽校正所致。对于其他蛋白质，凸形分布也可能源于单体与寡聚体之间的动态平衡，此时单体与寡聚体的比例——以及因此表现出的表观分子量值——依赖于峰内浓度（BSA 不表现出此行为，常被用作对照样品以验证峰展宽参数的正确性）。若分子量分布从峰前沿到峰拖尾存在变化，且不随样品浓度改变，则通常表明存在分子量物种的分布，这些物种在尺寸排阻色谱（SEC）中仅被部分分离。通过注入不同总量的蛋白质，可轻易区分动态平衡与其他导致表观非均一性分布的原因：在动态平衡情况下，分布会随进样量变化，而在固定分布或峰展宽校正错误的情况下则不会变化。
根据上述限制，SEC-MALS 不适用于多种任务。它不适合分析粗提样品；样品应通过标准的亲和层析和精细纯化方法进行充分纯化。该方法的准确性和分辨能力不足以识别质量相同或非常接近的蛋白质或单克隆抗体（mAb）的突变体和变体，也不能用于在SEC柱上不洗脱或无法分离的分析物。不过，最近已有研究表明，可将离子交换色谱或反相色谱与MALS联用，以分离和表征SEC无法分辨的物质72,73,74。当蛋白质样品量严重受限时，SEC-MALS可能不可行，因为该方法通常需要10 - 200 µg3的样品量，而在内径大于0.25 mm的FPLC系统中可能需要更多样品；然而，使用UHPLC-SEC-MALS可分析更少量的样品。对于在接触流动相后易于聚集的高度不稳定蛋白质，SEC-MALS也不适用，但通过离线动态光散射优化缓冲液条件，可能克服这一问题75。
尽管SEC-MALS需要额外的操作步骤，但它在蛋白质研究中具有不可估量的价值，已被学术界和生物制药领域广泛使用。除了表征单体、寡聚体和聚集体（如上述实验方案所述）之外，SEC-MALS还可用于表征修饰蛋白，例如糖蛋白（分别测定蛋白质和糖链组分的分子量）、经表面活性剂或脂质增溶的膜蛋白（分别测定蛋白质和增溶剂组分的分子量）、病毒样颗粒等蛋白质组装体、蛋白质-蛋白质复合物和蛋白质-核酸复合物、多糖、蛋白质-多糖偶联物、多肽以及许多其他生物大分子。

对溶液中蛋白质分子量（MW）进行可靠分析对于生物分子研究至关重要1,2,3,4。分子量分析可帮助科研人员判断是否成功表达了目标蛋白质，并确定其是否适用于后续实验5,6。正如蛋白质研究网络P4EU7和ARBRE-Mobieu8网站所述，蛋白质质量控制不仅需要评估终产物的纯度，还需表征其寡聚状态、均一性、身份、构象、结构、翻译后修饰及其他性质。
在非变性溶液中进行的分子量测定可确定蛋白质在水环境中存在的形式，即单体或寡聚体。尽管对于许多蛋白质而言，目标是获得单体形式，但对于另一些蛋白质来说，特定的天然寡聚体是其生物学活性的关键9,10,11,12。其他类型的寡聚体及非天然聚集体会影响结构解析的准确性，导致X射线晶体学、核磁共振（NMR）或小角X射线散射分析出现缺陷，同时也会在功能检测中引发假象或误差，例如在等温滴定量热法或表面等离子共振技术中对结合能力的定量分析2,13。
对于单克隆抗体（mAbs）等生物治疗药物而言，基于溶液的分子量分析在质量控制和产品表征方面具有类似作用。过量的聚集体和片段表明产品不稳定，不适合用于人体。监管机构不仅要求对治疗分子本身进行细致表征，还要求对最终产品中可能存在的潜在降解产物进行充分分析14,15,16,17。
分析蛋白质分子量（MW）最常用的方法包括十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、毛细管电泳（CE）、天然PAGE、质谱法（MS）、尺寸排阻色谱（SEC）和分析型超速离心（AUC）。在这些方法中，SDS-PAGE、CE和MS并非在天然状态下进行，通常会导致寡聚体和聚集体解离，因此不适合用于确定天然寡聚状态或定量聚集体。尽管天然PAGE理论上可保持蛋白质的天然状态，但根据我们的经验，该方法对许多蛋白质难以优化，结果可靠性较差。AUC无论是通过沉降速度还是沉降平衡方式，均可实现定量分析，并能基于第一性原理确定分子量，但操作十分繁琐，需要大量人工操作、较高的数据分析专业知识、较长的实验时间以及价格昂贵的仪器。
分析型尺寸排阻色谱（SEC）是一种定量、相对稳健且简单的分离方法，可在大分子流经填充柱时实现分离。尺寸排阻色谱的原理和应用已在多篇综述18,19,20以及手册《尺寸排阻色谱：原理与方法》21中得到充分阐述。保留时间的差异源于不同分子在从柱末端洗脱前，扩散进入并离开固定相孔隙所花费的时间不同。这种差异（理论上）由分子的相对大小及其扩散系数决定22。通过一系列参考分子建立校准曲线，将分子的分子量（MW）与洗脱体积关联起来。对于蛋白质而言，参考分子通常为性质良好、呈球状且不通过电荷或疏水性表面残基与色谱柱发生相互作用的蛋白质。洗脱体积通过紫外（UV）吸收检测器进行测定。若已知紫外消光系数（通常由氨基酸序列计算获得），还可对蛋白质峰的总质量进行定量分析。
值得注意的是，通过尺寸排阻色谱法（SEC）分析分子量（MW）依赖于对被测蛋白质的两个关键假设：1）它们与参考标准品具有相同的构象和比容（即扩散性质与分子量之间的关系相同）；2）与参考标准品类似，它们除了通过空间位阻效应外，不会与色谱柱发生其他相互作用——即不会通过电荷或疏水相互作用吸附到色谱柱填料上。若偏离这些假设，校准曲线将失效，导致分子量测定结果错误。例如，内在无序蛋白质由于含有大量无结构区域，其斯托克斯半径较大23,24；又如非球形或线性寡聚组装体10，均不符合上述假设。糖基化蛋白质的斯托克斯半径通常大于非糖基化形式，即使已计入所添加碳水化合物的质量19。去垢剂增溶的膜蛋白的洗脱行为也不同于校准蛋白质，因为其在SEC中的洗脱取决于多肽-去垢剂-脂质复合物的总体尺寸，而非蛋白质的寡聚状态和摩尔质量25,26。色谱柱的化学性质、pH值和盐浓度均会影响带有带电或疏水性表面残基的蛋白质的洗脱体积27,28。
当尺寸排阻色谱（SEC）与多角度光散射（MALS）和差示折光指数（dRI）检测器联用时，其在分子量（MW）测定方面的适用性和可靠性显著提高3,4,11,29,30,31,32。dRI 检测器通过检测分析物存在时溶液折光指数的变化来确定其浓度。MALS 检测器则测量分析物相对于入射激光束在多个角度散射光的比例。这种联用技术统称为 SEC-MALS，其测定分子量不依赖于洗脱时间，因为分子量可直接基于第一性原理通过公式 1 计算得出，
<img alt="分子量测定公式，M=R(0)/Kc(dn/dc)^2，用于聚合物分析。" src="/files/ftp_upload/59615/59615eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1">  (1)
其中 M 是分析物的分子量， R(0) 由MALS检测器测定并外推至零角度的减小瑞利比（即分析物散射光强度相对于激光强度的比值）， c 由紫外检测器或示差折光检测器测定的重量浓度 dn/dc 分析物的折射率增量（本质上是分析物与缓冲液折射率之间的差值），以及 K 一个依赖于系统特性（如波长和溶剂折射率）的光学常数29.
在SEC-MALS中，SEC色谱柱仅用于分离溶液中的不同组分，使其依次单独进入MALS和浓度检测器的检测池。实际保留时间对分析本身并无意义，其作用仅在于对蛋白质组分的分辨效果。仪器的校准独立于色谱柱，且不依赖于标准参照物。因此，SEC-MALS被视为基于基本物理方程的分子量（MW）测定的“绝对”方法。若样品具有异质性且未能被色谱柱完全分离，则每个洗脱体积所提供的数值将代表在每段时间间隔（约75 μL）流经流通池的各洗脱体积中分子的重量平均值。
通过分析散射强度的角变化，多角度静态光散射（MALS）还可测定几何半径大于约12.5 nm的生物大分子和纳米颗粒的尺寸（均方根回转半径，Rg）29。对于单体蛋白和寡聚体等较小的物质，可在MALS仪器上加装动态光散射（DLS）模块，以测量低至0.5 nm及以上的流体力学半径33。
尽管紫外（UV）检测或示差折光（dRI）浓度分析均可用于获得公式1中的c值，但优先选用dRI检测基于以下两个原因：1）dRI是一种通用浓度检测器，适用于分析不含紫外发色团的分子（如糖类或多糖）34；2）几乎所有纯蛋白在水相缓冲液中的浓度响应dn/dc值在1%至2%范围内相同（0.185 mL/g）35，因此无需知晓其紫外消光系数。
尺寸排阻色谱-多角度光散射联用技术（SEC-MALS）在蛋白质研究中的应用十分广泛。目前最常见的用途是确定纯化后的蛋白质是单体还是寡聚体，以及其寡聚化程度，并评估蛋白质聚集体的存在情况3,10,11,17,31,36,37,38。该方法特别适用于无法通过传统手段表征的去垢剂增溶膜蛋白，相关详细实验方案已有发表31,39,40,41,42,43。其他常见应用包括确定糖蛋白、脂蛋白及类似偶联物的翻译后修饰程度和多分散性4,31,44,45,46,47；检测异源复合物（如蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸及蛋白质-多糖复合物）的形成（或未形成）情况及其绝对化学计量比（而非相对化学计量比）24,46,48,49,50,51,52；测定单体-二聚体平衡解离常数49,53,54；以及评估蛋白质构象55,56。除蛋白质外，SEC-MALS 在肽段57,58、高度异质性的天然聚合物（如肝素59、壳聚糖60,61）、小型病毒62以及大多数类型的合成或加工聚合物63,64,65,66的表征中也具有重要价值。相关文献的详尽参考书目可参见已发表资料67及在线资源（http://www.wyatt.com/bibliography）。
本文介绍了一种进行和分析SEC-MALS实验的标准方案。以牛血清白蛋白（BSA）为例，演示蛋白质单体和寡聚体的分离与表征。该BSA方案可确定某些系统常数，为后续的SEC-MALS分析（包括复合物、糖蛋白以及表面活性剂结合的膜蛋白）提供基础。
我们注意到，SEC-MALS 可使用来自多家供应商的标准高效液相色谱（HPLC）或快速蛋白液相色谱（FPLC）设备进行。本方案描述了一种在从事蛋白质研发的实验室中常见的 FPLC 系统的使用方法（参见材料表）。在运行本方案之前，应已完成 FPLC 系统、MALS 和 dRI 检测器的安装，并根据制造商的说明安装相应的控制、数据采集和分析软件，同时将必要的校准常数或其他设置参数输入软件中。应在泵与进样器之间安装一个带有亲水性、孔径为 0.1 µm 滤膜的在线过滤器。

<table><tbody><tr><td>AKTA pure</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-26</td><td>快速蛋白液相色谱仪（FPLC）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AKTA UNICORN</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC 控制软件</td></tr><tr><td>ASTRA</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>多角度光散射（MALS）数据采集与分析软件</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（纯度 &gt;97%）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A1900</td><td>分析物</td></tr><tr><td>DAWN 或 miniDAWN</td><td>Wyatt Technology</td><td>WH2 或 WTREOS</td><td>多角度光散射（MALS）检测器</td></tr><tr><td>Increase 200 10/300</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>尺寸排阻色谱柱，200 &amp;Aring; 孔径，内径 10 mm，长度 300 mm</td></tr><tr><td>Optilab</td><td>Wyatt Technology</td><td>WTREX</td><td>差示折光指数（RI）检测器</td></tr><tr><td>氯化钠 NaCl</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>71382</td><td>高效液相色谱级 NaCl</td></tr><tr><td>Stericup 瓶顶滤器 聚醚砜 0.1 &amp;micro;m 1000 mL&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCVPU11RE</td><td>流动相过滤器</td></tr><tr><td>Whatman Anotop 10 注射器滤器 0.02 &amp;micro;m</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1002</td><td>样品过滤器</td></tr><tr><td>Whatman Anotop 10 针头式滤器，0.1 &amp;micro;m 孔径，直径 10 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1012</td><td>样品过滤器</td></tr><tr><td>Whatman Anotop 25 注射器滤器 0.1 &amp;micro;m</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-2012</td><td>流动相过滤器</td></tr><tr><td>WyattQELS</td><td>Wyatt Technology</td><td>WIQ</td><td>动态光散射检测器</td></tr></tbody></table>

通过尺寸排阻色谱-多角度光散射联用技术（sec-mals）对蛋白质进行表征

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

分析型尺寸排阻色谱法（SEC）常用于测定溶液中蛋白质及蛋白质-蛋白质复合物的分子量，是一种相对技术，依赖于待测物的洗脱体积来估算分子量。当蛋白质并非球状分子或在色谱柱中发生非理想相互作用时，基于蛋白质标准品建立的校准曲线将不再适用，由此通过洗脱体积确定的分子量也会出现错误。多角度光散射（MALS）是一种绝对测量技术，可通过基本物理方程直接测定溶液中待测物的分子量。将SEC用于分离与MALS用于分析相结合，构成了一种多功能且可靠的手段，可用于表征含有一种或多种蛋白质组分的溶液，包括单体、天然寡聚体或聚集体以及异源复合物。由于该测量在每一个洗脱体积下均可进行，SEC-MALS能够判断洗脱峰是否均一，并可区分固定的分子量分布与动态平衡状态。该方法还可用于分析修饰蛋白（如糖蛋白或脂蛋白）以及偶联物（如去垢剂增溶的膜蛋白）。因此，对于需要确认用于生物学或生物技术研究的分子之生物物理性质和溶液行为的蛋白质化学研究者而言，SEC-MALS是一项关键工具。本SEC-MALS实验方案用于分析纯化蛋白质单体及其聚集体的分子量和尺寸。所获得的数据可为后续更复杂的SEC-MALS分析（如复合物、糖蛋白及表面活性剂结合的膜蛋白分析）奠定基础。

图 1a、b 显示，BSA 的三种寡聚形式（单体、二聚体和三聚体）在 200 Å 孔径的色谱柱上实现了良好分离，其中单体与二聚体达到基线分离；而 图 2a 显示，在 75 Å 孔径色谱柱上的分离未能实现良好的单体-二聚体分辨。后一示例用于说明一种“较差”的结果；根据厂商提供的分离范围，这两种色谱柱在分离效果上的差异实际上是可预期的。三聚体与二聚体未能完全分离，更高阶的寡聚体之间以及与三聚体之间也未能良好分离。图 2b 是光散射信号噪声较大且色谱图中全程存在颗粒物的示例，这会妨碍分子量的准确测定。
此后，我们将重点放在 图 1b单体在13.8分钟时洗脱，表现出重均摩尔质量 Mw 64.1 ± 0.4 kDa（通过MALS测定）及流体动力学半径 Rh 3.54 ± 0.01 nm。这些结果与牛血清白蛋白（BSA）的序列分子量和已知水动力学半径（分别为66.4 kDa和3.5 nm）相符。68在尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）的常规准确度范围内，即5%以内3,69二聚体在12分钟时洗脱，表现出 Mw 通过MALS测定的值为127 ± 1 kDa，与预期一致，在实验精度范围内为单体分子量的两倍—— Rh 5.68 ± 0.06 nm。在11分钟时也观察到三聚体峰 Mw 由MALS测定为194 ± 9 kDa，约为单体分子量的三倍，符合预期，在实验精度范围内。 Rh 由于DLS信号强度较低，无法确定三聚体的尺寸。
在整个单体峰范围内计算的摩尔质量点之间差异在2-5%以内，表明样品均一。常可观察到拖尾肩峰，其摩尔质量范围为38-50 kDa，对应于BSA片段70。二聚体和三聚体峰的摩尔质量点不均一，表明存在异质性。二聚体峰的异质性部分源于少量三聚体渗入二聚体峰，而三聚体峰的异质性则是由于未能很好分离的更高级寡聚体共洗脱所致。
在所有三个信号中，单体峰的信噪比均相当理想，超过100:1，二聚体峰的信噪比也达到40:1。色谱图中除蛋白峰以外的区域基线平坦，仅在LS信号中靠近全排阻（空体积）处因颗粒物出现一个峰，在dRI信号中靠近全渗透体积处出现一个（正向）盐峰和一个（负向）溶解空气峰。这些峰已在图1a中指出。
纯度水平也可通过SEC-MALS实验进行计算：报告中单体峰的质量分数代表单体形式的纯度百分比。对于BSA单体，计算得到的纯度为88%。
<img alt="显示分析物峰、摩尔质量与洗脱时间关系的尺寸排阻色谱数据分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：使用200 Å孔径的尺寸排阻色谱柱对牛血清白蛋白（BSA）进行SEC-MALS分析。色谱图曲线已相对于单体峰归一化，并为清晰起见进行了偏移。（A）指出了可忽略的常见伪影，包括光散射信号起始处附近的颗粒峰，以及折射率信号中接近总渗透体积时的盐峰和溶解空气峰。（B）色谱图显示出优异的单体-二聚体-三聚体分离效果，且光散射信号具有高信噪比。单体和二聚体的分子量值表现出高度均一性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="尺寸排阻色谱图；单体分离，LS/UV/RI 检测，摩尔质量分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：低质量 SEC-MALS 分析示例。 色谱图曲线已根据单体峰归一化，并为清晰起见进行偏移。（A） 在孔径为 75 Å 的尺寸排阻色谱柱上分离效果不佳；8–9 分钟之间的颗粒峰与蛋白质峰未充分分离。（B） 光散射（LS）信号中明显表现出信噪比不足，且在蛋白质附近存在大量颗粒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了尺寸排阻色谱与多角度光散射联用技术（SEC-MALS），用于溶液中蛋白质及其复合物的绝对表征。SEC-MALS 可测定纯化蛋白质、天然寡聚体、异源复合物以及糖蛋白等修饰蛋白质的分子量和尺寸。

通过尺寸排阻色谱-多角度光散射联用技术（SEC-MALS）对蛋白质进行表征

分析型尺寸排阻色谱法（SEC）常用于测定蛋白质及蛋白质-蛋白质复合物的分子量……

SEC-MALS 是一种用于测定溶液中大分子分子量、尺寸和构象的定量方法。该方法可鉴定寡聚体和复合物，并表征难以处理的样品，如糖蛋白和膜蛋白。SEC-MALS 是一种绝对测定方法。它基于基本的物理原理，不依赖于分子标准品、分子构象或与分离介质相互作用方式的协作。SEC-MALS 可应用于通过 SEC 分离的多种体系，从小肽和小分子聚合物到蛋白质、核衣壳、多糖、合成聚合物、病毒样颗粒以及小型病毒等。必须确认您的系统和缓冲液符合厂商对低颗粒物含量的建议要求。请咨询厂商的技术支持代表以确保符合要求。按照文本方案中的描述，开始准备SEC-MALS系统。使用每种色谱级试剂，配制含有 50 至 100 毫摩尔氯化钠的一升磷酸盐缓冲液。使用瓶装聚醚砜滤膜或类似滤器将缓冲液过滤至 0.1 微米。为去除干燥滤器中的微粒，先将前 50 至 100 毫升缓冲液滤入废液瓶中弃去。然后，将剩余液体过滤至一个洁净的无菌瓶中，该瓶子此前已用过滤的去离子水清洗，并保持密封以防止灰尘进入。以每分钟0.5毫升的流速过夜冲洗色谱柱，使色谱柱在缓冲液中充分平衡，并去除颗粒物。使用FPLC的连续流模式，并确保在完成所有SEC-MALS运行之前，流速不中断。在过夜冲洗期间，将 DRI 流通池置于吹扫模式。开始冲洗时，应逐步提高流速，以防止因色谱柱内压力突然变化导致的柱填料脱落现象。在开始进样前，关闭吹扫功能。通过轻轻敲击色谱柱下游的管路，释放积聚的颗粒，以检查系统的清洁度。观察MALS仪器前面板显示屏上90度检测器的信号。确认峰-峰值噪声不超过50-100微伏。同时确认折光率（RI）信号的稳定性优于1 × 10⁻⁷折光率单位。进行空白进样以确认进样器无颗粒物污染。空白样品即为在全新无菌小瓶中配制的流动缓冲液。如果颗粒峰的体积不超过一毫升，且峰高不超过基线以上五毫伏，则系统已准备好进行样品分析。否则，需继续进行空白进样直至系统洁净，或执行维护程序以清洗进样器。现在，用 SCC 缓冲液配制至少 200 微升、浓度为每毫升一至二毫克的 BSA 溶液。使用注射器滤器将蛋白质溶液过滤至0.2微米。弃去最初几滴滤液，以去除干燥滤器中的颗粒。或者，将样品在10,000 × g下离心15分钟，使不溶性聚集体及其他较大颗粒沉淀。然后，向进样环中注入 100 微升 BSA 溶液。在 MALS 软件菜单中，从方法中新建实验。接着，从光散射系统的方法文件夹中选择在线方法。如果存在DLS检测器，请从带QELS的光散射文件夹中选择在线方法。在配置部分设置样品和流动相的参数。在通用泵界面中，将流速设置为FPLC中所用的流速。然后，进入通用泵视图，选择溶剂分支的名称字段，并选择 PBS。在进样器视图中，进入样品分支，将名称设为 BSA。将 dn/dc 设为 0.185，A2 设为 0，紫外消光系数设为 0.667 毫升每毫克厘米。在程序部分的“基本采集视图”中，选中自动进样上的复选框触发。将运行时间设置为 70 分钟，以便在整个洗脱过程中收集数据，直至达到 SEC 柱的总渗透体积。在 MALS 软件中点击“运行”按钮以开始实验。在通过MALS检测器接收到来自FPLC仪器的脉冲信号后，系统将开始读取数据。点击仪器前面板上的自动调零按钮，将DRI信号归零。在FPLC软件中，进入手动模式，执行手动指令，设置标记，并输入蛋白质名称和运行编号。将进样阀在流路中的位置从手动上样切换至进样状态。在IO盒的数字脉冲输出中插入一个持续0.5秒的脉冲信号，以触发MALS软件中的数据采集。现在将样品注入进样环。在FPLC软件中点击“执行”以开始实验运行。在MALS软件的“操作步骤”部分，逐步进行分析。通过检查基础收集视图，确认紫外（UV）、多角度激光散射（MALS）和示差折光（RI）信号的峰出现在近似相同的洗脱体积处。在基线视图中，为所有信号定义基线。在峰视图中，通过单击并拖动鼠标来定义需要分析的峰。选择每个峰中央的50%区域。首先选择单体峰，然后选择二聚体峰。在每个峰下方，验证BSA的dn/dc值以及280纳米处的消光系数是否正确。在操作步骤的峰对齐视图中，通过单击并拖动鼠标来选择峰的中心区域。单击“对齐信号”，然后单击“确定”。在操作步骤的峰展宽视图中，选择单体峰中心区域的50%。确保将折光率检测器指定为参考仪器。然后单击“执行拟合”，并应用该设置以使紫外光和光散射信号与折光率信号相匹配。放大峰图，确认它们在中心区域50%至70%范围内高度重叠，然后单击确定。在操作步骤中，选择归一化视图，选中第一个峰。输入 3.0 纳米作为 RG 值，点击归一化，然后点击确定。在 EASI 图形视图中查看结果图表。在窗口顶部的下拉菜单中选择摩尔质量。按住 control 键，点击并拖动以放大峰区域。要查看单体和二聚体峰的最终列表化重均摩尔质量结果，请导航至峰结果、摩尔质量矩、MW，然后选择结果报告摘要。纯度以峰结果中的质量分数表示。从文件菜单中选择“另存为方法”，并将分析得到的 BSA 数据保存为标准方法，用于今后所有类型蛋白质的测定。针对 BSA 确定的归一化和谱带展宽参数将在后续分析中沿用。此处展示的是使用200埃孔径排阻色谱柱对牛血清白蛋白（BSA）进行的SEC-MALS分析。色谱图曲线已相对于单体峰进行了归一化处理，并为清晰起见进行了偏移。图中指出了可忽略的常见伪影，包括在光散射信号起始处附近的颗粒峰，以及在折射率信号中接近总渗透体积时的盐峰和溶解空气峰。色谱图显示出优异的单体-二聚体-三聚体分离效果，且光散射信号具有较高的信噪比。单体和二聚体的重均摩尔质量值表现出高度均一性。以下是低质量SEC-MALS分析的示例。在此示例中，使用孔径为75埃的尺寸排阻色谱柱分离效果不佳，导致在8到9分钟之间出现一个颗粒峰，该峰与蛋白质峰未能良好分离。此处信噪比不足，且在光散射信号中明显可见大量与蛋白质相邻的颗粒。获得良好SEC-MALS结果的关键在于选择合适的色谱柱，确保系统经过校准且光散射噪声较低，并对样品进行预过滤或离心处理以去除颗粒物。在完成尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）后，可进一步通过结合亲和力分析、生物层干涉技术、表面等离子共振、等温滴定 calorimetry、生物发光共振能量转移、微尺度热泳动或组成梯度多角度光散射等方法对蛋白质样品进行分析。蛋白质结构可通过X射线晶体学、冷冻电子显微镜技术或核磁共振（NMR）来确定。

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科研

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生物化学

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