蛋白质的表征(按尺寸-排除色谱与多角度光散射相结合(SEC-MALS)
June 20th, 2019
该协议描述了尺寸排除色谱与多角度光散射(SEC-MALS)的结合,用于对溶液中的蛋白质和复合物进行绝对表征。SEC-MALS 确定纯蛋白质、原生寡聚物、异质复合物和修饰性蛋白质(如糖蛋白)的分子量和大小。
SEC-MALS是确定溶液中大分子的分子量、大小和构象的定量方法。它可以识别寡聚物和复合物，并描述困难的样品，如糖蛋白和膜蛋白。SEC-MALS 是一种绝对方法。
它依赖于基础物理，并不依赖于与分子标准、分子的构象或我们如何与分离介质相互作用的协作。SEC-MALS 可应用于许多以秒分隔的系统。从肽和小聚合物到蛋白质、核胶囊、多糖、合成聚合物、病毒类颗粒和小病毒。
验证您的系统和缓冲区是否未满足供应商对低颗粒含量的建议非常重要。请咨询供应商的技术支持代表以确保。从准备 SEC-MALS 系统开始此过程，如文本协议中所述。
使用每个 PLC 级试剂，用 50 至 100 毫摩尔氯化钠准备一升磷酸盐缓冲盐水。使用瓶装聚热电池泡沫过滤器将缓冲液过滤到 0.1 微米，或类似。将前 50 至 100 毫升缓冲液过滤到废瓶中，以消除干滤芯中的颗粒。
然后，将剩余的滤波过滤到一个清洁的无菌瓶中，该瓶以前用过滤、去压的水清洗过，并防止灰尘进入。以每分钟 0.5 毫升的流速通宵冲洗柱，以平衡缓冲液中的柱，并清除颗粒物。使用 FPLC 的连续流模式，并确保流不会停止，直到所有 SEC-MALS 运行完成。
在通宵冲洗期间，将 DRI 流量单元放在净化模式下。开始冲洗时，逐渐提高流速，以防止柱脱落效应，由柱中压力的突然变化引起。在开始示例运行之前关闭清除。
通过轻轻敲击柱子下游的管子以释放积聚的颗粒，检查系统清洁度。观察 MALS 仪器前面板显示屏上 90 度探测器中的信号。验证峰值到峰值噪声不超过 50-100 微伏。
还要验证折射率或 RI 信号稳定到负七折射率单位的 1 倍 10 到负七个折射率单位。执行空白喷射以验证喷油器是否清洁颗粒。空白只是用新鲜无菌小瓶准备的运行缓冲液。
如果粒子峰值的体积不超过一毫升，且基线以上不超过五毫伏，则系统已准备好进行采样。否则，执行额外的空白喷射，直到清洁，或执行维护以清洁喷油器。现在，在 SCC 缓冲液中，以每毫升 1 到 2 毫克的速度准备至少 200 微升 BSA。
使用注射器尖端过滤器将蛋白质过滤到02微米。丢弃前几滴滤液，以消除干滤片中的颗粒。或者，将样品在10，000倍G下离心15分钟，使非可溶性集料和其他大颗粒沉淀。
然后，将 100 微升 BSA 解决方案注入环路。在 MALS 软件菜单中从方法打开新实验。然后，从光散射系统方法文件夹中选择联机方法。
如果存在 DLS 探测器，请从具有 QELS 的光散射中选择联机方法。在配置部分中设置示例和移动相位参数。在通用泵视图中，将流速设置为 FPLC 中使用的流速。
然后，导航到通用泵视图、溶剂分支、名称字段，然后选择 PBS。在喷油器视图中，示例分支，输入名称为 BSA。将 dn/dc 设置为 0.185，将 A2 设置为 0，将紫外线消光系数设置为每毫克 0.667 毫升。
在过程部分的基本收集视图中，选择自动注入时复选框触发器。将运行持续时间设置为 70 分钟，以便为整个表示收集数据，直到达到 SEC 列的总渗透量。单击运行按钮在 MALS 软件中开始实验。
在通过 MALS 探测器从 FPLC 仪器接收脉冲信号后，它将开始读取数据。单击仪器前面板上的自动零按钮，使 DRI 信号归零。在 FPLC 软件中工作，导航到手动，执行手动指令，设置标记，并插入蛋白质和运行的名称。
将喷射阀从手动负载切换到在流道下喷射阀。通过将 0.5 秒脉冲插入 IO 盒脉冲数字输出，包括脉冲信号。这将触发 MALS 软件中的数据收集。
现在，将示例注入循环。单击 FPLC 软件中的执行以开始实验运行。在 MALS 软件中的过程部分下逐步执行分析。
通过检查基本集合视图，验证峰值在 UV、MALS 和 RI 中的表示体积是否大致相同。在基线视图中，定义所有信号的基线。在峰值视图中，通过单击并拖动鼠标定义要分析的峰值。
选择每个峰值的 50% 的中心。首先选择单体峰值，然后选择二元峰。在每个峰值下，验证 BSA 在 280 纳米时 dn/dc 和消光系数的正确值。
在过程对齐视图中，通过单击并拖动鼠标选择峰值的中心区域。单击对齐信号，然后确定。在程序中，带宽的视野，选择中央50%的单体峰。
确保将折射率检测器指定为参考仪器。然后单击"执行拟合"，并应用以将 UV 和光散射信号与折射率信号匹配。放大峰值以验证它们在中央 50 到 70% 内非常紧密地重叠，然后单击"确定"。
在过程、规范化视图中，选择峰值一。输入 3.0 纳米作为 RG 值，单击"规范化"，然后单击"正常"。在 EASI 图形视图中查看结果的图形。
从窗口顶部的显示下拉列表中选择摩尔质量。使用控件、单击和拖动可放大峰值区域。要查看单体和二丁峰的最终制表权重平均摩尔质量结果，请导航到峰值结果、摩尔质量时刻、MW，然后选择结果，报表摘要。
在峰值结果下报告纯度，质量分数。从文件菜单中，选择保存为方法，并保存分析的 BSA 数据作为未来测量所有类型的蛋白质的标准方法。分析中将传递为BSA确定的规范化和频带扩大参数。
此处显示的是使用 200 安格斯特罗姆孔径排除列的 BSA 的 SEC-MALS 分析。色谱图轨迹被规范化为单体峰值，并偏移以保持清晰。指出了可以忽略的常见伪影，包括光散射信号开头附近的粒子峰，以及折射率信号中总渗透量附近的盐和溶解空气峰值。
色谱图表现出出色的单体-三色-修剪器分离，光散射信号表现出高噪声信号。单体和二元重量平均摩尔质量值表现出高同质性。以下是低质量的 SEC-MALS 分析示例。
在此示例中，75 Angstrom 孔径排除柱上的分离不足会导致 8 到 9 分钟的粒子峰值，这与蛋白质分离不当。在这里，信号与噪声比不足，在光散射信号中，与蛋白质相邻的大量粒子是明显的。获得良好的 SEC-MALS 结果的关键是选择适当的列，确保系统经过低光散射噪声校准，并预先过滤或离心样品以去除颗粒。
在SEC-MALS之后，蛋白质样品可以进一步分析结合亲和力、生物利扎、表面表面质感、等温滴算、生物耐数量计、微尺度热泳或成分梯度、多角度光散射。蛋白质结构可以通过X射线晶体学、低温电子杂卓术或核磁共振术确定。
概述
该协议描述了将尺寸排阻色谱与多角度光散射（SEC-MALS）相结合，用于溶液中蛋白质和复合物的绝对表征。SEC-MALS可以确定纯蛋白质、天然低聚物、异复合物和修饰蛋白（如糖蛋白）的分子量和大小。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质表征
- 分析化学
背景
- SEC-MALS是一种确定分子量和大小的定量方法。
- 它可以识别低聚物和复合物，包括糖蛋白。
- 该方法不依赖于分子标准。
- 适用于广泛的大分子。
研究目的
- 提供一种可靠的方法来表征溶液中的蛋白质。
- 便于复杂生物样品的分析。
- 增强对蛋白质相互作用和结构的理解。
使用的方法
- SEC-MALS系统和缓冲液的准备。
- 系统的过滤和冲洗以确保清洁。
- 样品准备和注入SEC-MALS系统。
- 使用MALS软件进行数据收集和分析。
主要结果
- 成功表征蛋白质和复合物。
- 验证系统清洁度和样品完整性。
- 准确确定分子量和大小。
- 识别样品中的低聚物和复合物。
结论
- SEC-MALS是一种有效的蛋白质表征方法。
- 它提供了不依赖于标准的绝对测量。
- 该技术可以应用于各种生物大分子。
常见问题
Executive Industry Relevance
SEC-MALS provides absolute molecular weight and size characterization of proteins and complexes in solution, eliminating reliance on molecular standards and reducing analytical uncertainty in early discovery. This capability supports target validation by confirming the biophysical state of therapeutic candidates, including oligomers, aggregates, and modified species such as glycoproteins. By delivering quantitative, conformation-independent data, SEC-MALS enhances predictive confidence in protein behavior, informing go/no-go decisions and reducing late-stage biological risk in biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms homogeneity and molecular weight of protein monomers, oligomers, and complexes, enabling accurate assessment of therapeutic target integrity.
- Operational Value: Distinguishes between static and dynamic protein equilibria, clarifying whether observed species represent stable assemblies or transient interactions.
- Predictive Value: Detects aggregates and heterogeneous populations early, supporting risk-adjusted prioritization of candidates before downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables analysis of modified proteins such as glycoproteins and detergent-solubilized membrane proteins, expanding the range of tractable targets for screening campaigns.
- Operational Value: Provides quantitative, absolute molecular weight measurements at each elution volume, facilitating assay standardization and reproducibility across laboratories.
- Platform Utility: Generates reference data for BSA and other standards that can be saved as methods for future SEC-MALS runs, promoting enterprise-wide reuse and consistency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports characterization of protein complexes and modified forms relevant to disease mechanisms, bridging discovery and preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Determines whether observed species arise from covalent modification, non-specific aggregation, or specific oligomerization, clarifying mechanism of action and formulation risks.
- Preclinical Alignment: Delivers solution-based size and conformation data that complement structural techniques like cryo-EM or NMR, enabling integrated target profiling.
Pipeline & Workflow Integration
SEC-MALS functions as a foundational analytical step in the discovery continuum, positioned after protein expression and purification but before functional assays or structural determination, ensuring that only properly characterized molecules advance in the pipeline.
- Discovery Biology: Validates the oligomeric state and monodispersity of purified proteins, reducing false positives in target engagement and signaling assays.
- Screening: Ensures that protein ligands or analytes used in screening assays are well-defined and homogeneous, improving data quality and hit confirmation rates.
- Analytics: Delivers weight-average molar mass, size, and mass fraction outputs that enable direct comparison of protein variants, mutants, or formulation conditions.
- Translational Research: Characterizes glycoproteins and membrane protein complexes in near-native conditions, supporting biomarker relevance and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Allows laboratories to save validated methods (e.g., BSA-based) for broad application across projects, reducing method development time and increasing analytical throughput.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides absolute, conformation-independent molecular weight determination, increasing confidence in target identity and reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enables system suitability checks via blank injections and particle monitoring, ensuring reproducible runs and minimizing failed experiments due to contamination.
- Strategic Value: Supports early detection of aggregation and heterogeneity, informing formulation development and reducing risk of late-stage failure due to instability.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on biophysical quality, improving capital efficiency and advancing only well-characterized candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, buffer preparation, and SEC-MALS system operation, including MALS detector alignment and normalization procedures.
- Dependent on access to a calibrated SEC-MALS system with low-noise light scattering and refractive index detectors, and appropriate columns (e.g., 200 Å pore size for BSA).
- Necessitates rigorous sample and buffer filtration (0.1–0.2 μm) and system flushing to eliminate particulates that can scatter light and compromise data quality.
- Requires accurate input of protein-specific parameters such as dn/dc and UV extinction coefficient in the MALS software for valid molecular weight calculations.
- Limited by the need for monodisperse, soluble samples; precipitates or large aggregates must be removed via centrifugation or filtration prior to injection to avoid column clogging and signal artifacts.
