Name: 研究免疫突触形成过程中B细胞中的细胞动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: 了解免疫突触形成过程中B淋巴细胞的细胞动力学，利用免疫荧光成像和生化分析技术研究细胞器动态与细胞骨架重排。该方法有助于深入理解B细胞激活的分子机制。

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M.-I.Y. 获得智利国家科学与技术研究委员会（FONDECYT）第1180900号研究基金资助。J.I.、D.F. 和 J.L. 获得智利国家科学与技术委员会研究生奖学金资助。我们感谢智利天主教大学的 David Osorio 提供视频录制与编辑工作。

<ol><li>Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+Acquire+Particulate+Antigen+in+a+Macrophage-Rich+Area+at+the+Boundary+between+the+Follicle+and+the+Subcapsular+Sinus+of+the+Lymph+Node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node.</a> Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).</li>
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<li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li>
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<li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li>
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<li>Vascotto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-based+motor+protein+myosin+II+regulates+MHC+class+II+trafficking+and+BCR-driven+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation.</a> Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).</li>
<li>Reversat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+Par3+controls+B-cell+receptor+dynamics+and+antigen+extraction+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse.</a> Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).</li>
<li>Lankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Compartments+during+B+Cell+Receptor%E2%80%93mediated+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).</li>
<li>Duchez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Polarization+of+T+and+B+Cells+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse.</a> The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).</li>
<li>Pérez-Montesinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+intracellular+association+of+selected+rab+small+GTPases+with+MHC+class+II+and+DM+during+dendritic+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation.</a> Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).</li>
<li>Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk-dependent+Actin+Dynamics+Regulate+Endocytic+Trafficking+and+Processing+of+Antigens+Internalized+through+the+B-Cell+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor.</a> Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).</li>
<li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+Isolation+of+Centrosomes+from+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).</li>
<li>Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+centrosomes+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of centrosomes from mammalian cell lines.</a> Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).</li>
<li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vamp-7%E2%80%93dependent+secretion+at+the+immune+synapse+regulates+antigen+extraction+and+presentation+in+B-lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).</li>
<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Events+in+B+Cell+Activation+BCR%3A+B+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor.</a> Annual Review of Immunology. , (2010).</li>
<li>Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+use+conserved+polarity+cues+to+regulate+their+antigen+processing+and+presentation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种全面的方法，用于研究B淋巴细胞如何重组其细胞内结构以促进免疫突触（IS）的形成。该研究包括利用成像技术定量分析B细胞活化过程中细胞器（如中心体、高尔基体和溶酶体）的细胞内分布及其向免疫突触极化的情况。此外，我们还介绍了一种生物化学方法，用于研究B细胞活化后中心体组成的变化。
为了促进B细胞中免疫突触（IS）的形成，我们采用固定化抗原（抗原包被的微珠）而非可溶性免疫复合物，因为前者能够诱导形成明确的接触位点，便于研究细胞骨架的重排和细胞器的极化。在对B细胞活化进行成像时，一个关键环节是样品的制备。理想情况下，所有图像采集应获得1:1的细胞与微珠比例，以便量化细胞器向单一抗原接触位点的极化情况。然而，在某些情况下，B细胞可能捕获两个或更多微珠，从而难以确定唯一的抗原接触位点。为避免微珠聚集，在将抗原偶联的微珠加入细胞前，必须充分涡旋混匀。此外，在免疫荧光实验中，我们建议排除捕获多个微珠的细胞，以防止图像分析过程中出现误判。样品制备中的另一个关键步骤是固定与通透条件的选择。例如，我们推荐使用甲醇固定以优化微管染色效果，而使用4%多聚甲醛（PFA）固定则适用于鬼笔环肽（pha...

B淋巴细胞是适应性免疫系统的重要组成部分，负责针对不同威胁和入侵病原体产生抗体。抗体产生的效率取决于B细胞获取、加工并呈递可溶性或表面锚定形式抗原的能力1,2。当B细胞受体（BCR）识别呈递细胞表面附着的抗原时，会形成一种紧密的细胞间接触结构，称为免疫突触（IS）3,4。在此动态平台上，既发生BCR依赖性的下游信号传导，也进行抗原向内体-溶酶体区室的内化。摄入的抗原被加工处理后，装载到MHC-II类分子上，并进一步呈递给T淋巴细胞。有效的B-T细胞相互作用，即B-T细胞协作，使B淋巴细胞获得适当信号，从而促进其分化为抗体分泌型浆细胞或记忆细胞8。
B细胞提取抗原涉及两种机制。第一种机制依赖于溶酶体来源的蛋白酶的分泌，这些蛋白酶被招募并融合至免疫突触间隙5,6。第二种机制依赖于肌球蛋白IIA介导的牵拉力，促使含有抗原的膜发生内陷，并被内吞至网格蛋白包被的小窝中7。抗原提取的方式取决于抗原所在膜的物理特性。然而，在这两种情况下，B细胞均经历两个主要的重塑过程：肌动蛋白细胞骨架的重组以及细胞器向免疫突触（IS）的极化。肌动蛋白细胞骨架的重塑包括初始的铺展阶段，在此阶段，突触膜上依赖肌动蛋白的突起增加与抗原接触的表面积；随后是收缩阶段，通过分子马达与肌动蛋白细胞骨架重塑的协同作用，将与抗原结合的BCR集中到IS的中心区域8,9,10,11。细胞器的极化也依赖于肌动蛋白细胞骨架的重塑。例如，中心体通过其周围肌动蛋白的局部去聚合而与细胞核解偶联，从而使得该细胞器重新定位至IS5,12。在B细胞中，中心体向细胞一极（即IS）的重新定位可引导溶酶体募集至突触膜，溶酶体一旦分泌，便可促进表面锚定抗原的提取和/或加工6。募集到IS的溶酶体富含MHC-II，有利于在内体区室中形成肽-MHC-II复合物，进而呈递给T细胞13。此外，已有研究观察到高尔基体也被紧密募集至IS14，提示分泌途径中来自高尔基体的囊泡可能参与了抗原的提取和/或加工过程。
B细胞中细胞内细胞器与细胞骨架的重排&#160;在突触形成过程中，高效获取和加工抗原以实现后续活化的关键步骤。本文介绍了用于研究B细胞中与免疫突触（IS）形成相关的细胞器内部重塑的成像和生化分析的详细方案。这些技术包括：（i）利用抗原包被的微珠或抗原包被的盖玻片激活B细胞后进行免疫荧光染色及图像分析，以实现对迁移至IS的细胞内组分的可视化与定量；（ii）通过蔗糖梯度超速离心法分离B细胞中富含中心体的组分，从而鉴定可能参与调控中心体功能的相关蛋白。&#160;细胞极性

<table><tbody><tr><td>IIA1.6（A20 变体）小鼠 B 淋巴瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>来源于 Balb/c 小鼠的 B 细胞淋巴瘤，其表面表达含 IgG 的 BCR，但不表达 Fc&amp;gamma;IIR</td></tr><tr><td>100% 甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>直径 10 mm、厚度为 1 号圆形盖玻片</td><td>Marienfield-Superior</td><td>111500</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 荧光标记驴抗兔 IgG&amp;nbsp;</td><td>LifeTech&amp;nbsp;</td><td>A21206</td><td>推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 标记的山羊抗兔 &amp;nbsp;IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;A-11071</td><td>推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;A21238</td><td>推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化</td></tr><tr><td>Amaxa 核转染试剂盒 V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>按照制造商说明将转染试剂与 DNA 混合</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector 2b 型仪器</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>使用程序 L-013</td></tr><tr><td>氨基磁珠（Amino-Dynabeads）</td><td>ThermoFisher</td><td>14307D</td><td></td></tr><tr><td>抗中心粒周围蛋白抗体（Anti-pericentrin）</td><td>&amp;nbsp;Abcam</td><td>ab4448&amp;nbsp;</td><td>推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化</td></tr><tr><td>抗 rab6 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab95954</td><td>推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化</td></tr><tr><td>抗 sec61 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15575</td><td>推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>&amp;nbsp;Winkler</td><td>&amp;nbsp;BM-0150</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Winkler</td><td>CA-0520</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>BD</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 软件</td><td>Fiji col.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G 封片剂</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G7651&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Winkler&amp;nbsp;</td><td>BM-0820</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG 抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-005-003</td><td>IIA1.6 阳性配体</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgM 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31186</td><td>IIA1.6 阴性配体</td></tr><tr><td>HyClone 胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>在 56 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 下灭活 30 分钟</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Winkler</td><td>PO-1260</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS 显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Winkler</td><td>SO-1455</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E 正置荧光显微镜</td><td>&amp;nbsp;Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>M</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td>在生物安全柜中用 PBS 稀释至 4%，现配现用</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>液体</td></tr><tr><td>Polybead 氨基微球，直径 3.00&amp;mu;m</td><td>Polyscience</td><td>17145-5</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>用无菌水稀释</td></tr><tr><td>兔抗 α-微管蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>推荐稀释比例为 1:1000，但应进行优化</td></tr><tr><td>兔抗小鼠 lamp1 抗体</td><td>Cell signaling</td><td>3243</td><td>推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化</td></tr><tr><td>兔抗 cep55 抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab170414</td><td>推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化</td></tr><tr><td>兔抗 γ-微管蛋白抗体</td><td>&amp;nbsp;Abcam</td><td>ab16504</td><td>&amp;nbsp;用于 Western Blot 时稀释比例为 1:1000</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Biological Industries</td><td>01-104-1A</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>&amp;nbsp;Merck</td><td>558255</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Winkler&amp;nbsp;</td><td>SA-1390&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>&amp;nbsp;Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr></tbody></table>

研究b细胞在免疫突触形成过程中的细胞器动力学

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

表面锚定抗原的识别&#160;通过B细胞受体（BCR）&#160;触发免疫突触（IS）的形成，其中包含信号传导&#160;并且抗原摄取是协调进行的。免疫突触（IS）的形成涉及动态的肌动蛋白重塑，同时伴随着中心体及与其相关的细胞内细胞器（如溶酶体和高尔基体）向突触膜的极化募集。肌动蛋白重塑的初始阶段使B细胞能够增加其细胞表面积，从而最大限度地富集突触处的抗原-BCR复合物。在某些条件下，当B细胞识别与刚性表面相关的抗原时，该过程会伴随溶酶体的局部募集与分泌，进而促进抗原的提取。被摄取的抗原&#160;被内化到特化的内体-溶酶体区室中，加工成肽段，随后装载于主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）上，进一步呈递给辅助性T细胞。因此，研究与免疫突触（IS）形成相关的细胞器动态对于理解B细胞的活化机制至关重要。本文将讨论用于研究B细胞中免疫突触形成过程中细胞内细胞器定位变化及细胞骨架重排的成像技术和生物化学方法。

本文介绍了如何利用固定在微珠或盖玻片上的抗原激活B细胞，以诱导免疫突触（IS）的形成。我们提供了通过免疫荧光识别和定量不同细胞器极性的方法信息，并介绍了如何采用生物化学方法，对在中心体（极化至免疫突触）定位发生动态变化的蛋白质进行表征。
通过免疫荧光成像观察B细胞，可追踪中心体、高尔基体和溶酶体等细胞器在B细胞活化后向免疫突触（IS）募集的动态过程。通过该方法可获得定量参数，用于测量这些细胞器向IS极化的程度，并可在不同条件下进行比较。如图1A所示，B细胞活化后，中心体和高尔基体会被募集至IS。而在仅使用BCR配体刺激的B细胞中未观察到此类募集现象，表明BCR的结合是驱动中心体和高尔基体向IS移动所必需的（图1A）。为了获得用于衡量各细胞器接近IS程度的极性指数，我们考虑了三个参数：细胞器与细胞中心之间的距离、微珠中心与细胞中心之间的...

本文介绍了两种用于表征B淋巴细胞在免疫突触（IS）形成过程中细胞极化事件的方法。第一种方法涉及对细胞器向突触膜募集以及细胞骨架在突触膜处重排的定量分析。第二种为生化方法，用于表征发生向免疫突触极化的中心体在组成上的变化。

研究B细胞在免疫突触形成过程中的细胞器动力学

通过B细胞受体（BCR）识别表面锚定的抗原会触发免疫突触（IS）的形成，在该突触中……

在本综述中，我们将讨论用于研究免疫突触形成过程中细胞器定位与组成以及细胞骨架重排的成像和生化技术。活性重塑的初始阶段使B细胞能够增加其细胞表面积，并最大限度地富集抗原BCR复合物于突触区域。另一方面，溶酶体在突触膜局部招募，同时伴随中心体的定位，可与溶酶体分泌过程相偶联，而该过程已知有助于提取固定的抗原。内吞的抗原在内体-溶酶体区室中进一步被加工成肽段，这些肽段可装载到MHC II类分子上，以呈递给辅助性T细胞。因此，研究与免疫突触相关的细胞器动态对于理解B细胞如何被完全激活至关重要。通过对固定化抗原激活的B细胞进行免疫荧光染色，可以追踪不同细胞组分及其向免疫突触募集的过程。B细胞可通过固定在微珠表面或盖玻片表面的抗原被激活。通过将特异性配体与经戊二醛处理以活化氨基的氨基微珠共同孵育，制备抗原包被的微珠。用100 µL PBS重悬活化的微珠，并涡旋振荡。同时，通过在150 µL PBS中加入浓度为100 µg/mL的BCR配体来制备抗原溶液。接着，向抗原溶液中加入50 µL活化磁珠，并在4 °C下孵育过夜。注意，还需使用一种无关配体作为阴性对照。孵育后，用 PBS 洗涤磁珠。吸去上清液，并替换为 PBS。重复三次。接下来，将珠子重悬于500微升BSA溶液中，以封闭三个氨基基团。最后，将珠子重悬于70微升PBS中。为计算最终浓度，可使用血细胞计数板对珠子进行计数。进行B细胞活化时，使用50 mL离心管，将细胞重悬于CLICK培养基中，浓度为每毫升150万个细胞，并添加5%胎牛血清。随后，取100微升细胞-磁珠混合物（含15万个B细胞）加入多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片中，于37摄氏度孵育不同时间点。另一种活化B细胞的方法是将细胞接种至抗原包被的盖玻片上。为此，用抗-BCR 和 B220 包被载玻片，以增强细胞黏附。通过将抗-BRC 和 B220 分别加入 PBS 中，配制抗原溶液，终浓度分别为每毫升 10 微克和每毫升 0.5 微克。接着，将盖玻片置于包有 Parafilm 膜的 24 孔板盖子上，加入 40 微升抗原溶液。密封培养板，然后在4度条件下过夜孵育。开始盖玻片上的活化步骤时，首先用PBS洗涤盖玻片，并使其干燥数分钟。接着，加入150,000个B细胞，并在37度条件下孵育不同时间点。在这两种情况下，无论是使用微珠还是抗原包被的载玻片进行激活，我们都建议从最长的时间点开始，然后依次进行较短的时间点。一旦将干燥的盖玻片安装到显微镜载玻片上，可根据分辨率需求，使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察样品。使用透射光对样品进行聚焦。应寻找细胞与微珠以1:1比例相互作用的视野。对于在抗原包被的盖玻片上激活的B细胞，建议使用100倍物镜以获得更高的分辨率。在参数设置方面，建议采集涵盖整个细胞的z轴层扫图像。可以通过标记肌动蛋白来界定细胞的下边界和上边界。对于用抗原包被的微球激活的B细胞，若需对标记局限于一个点的细胞器进行定位，首先界定两个区域：细胞区域和微球区域。接着，通过一个点确定细胞器的位置，并获取其定位坐标。绘制两个向量：一个位于细胞中心与细胞器之间，另一个位于细胞中心与微珠中心之间。测量两者的长度，并测量这两个向量之间的夹角，该夹角现称为 alpha。利用 alpha 的高斯函数，将中心体与细胞中心之间的向量进行投影，然后通过将投影向量 a 除以 b 来计算细胞器的极性指数。因此，介于0和1之间的极性指数表示极化表型。介于0和-1之间的数值表示非极化表型。为了确定更分散的细胞器（如溶酶体）的极性指数，可使用前述相同算法，只需将细胞器定位坐标替换为标记物（本例中为溶酶体）质量中心的坐标即可。与之前所述的分析类似，极性指数在零到一之间表示极化表型，而零到负一之间的数值则表示非极化表型。为了定量分析每种细胞器被募集到新突触附近的程度，可以计算细胞器荧光信号在微珠处所占的百分比。具体方法是：首先界定微珠和细胞区域，测量各自的荧光强度，然后将微珠的荧光强度除以微珠与细胞荧光强度的总和。您将获得与新突触接触的每种细胞器的数量。或者，在微珠的对侧绘制一个矩形，其宽度相当于细胞长度的四分之一，然后测量该矩形内的荧光强度，并将其除以总荧光强度。该算法将始终用于获取靠近新突触但不一定直接与界面接触的细胞器所占的百分比。用于量化静息和活化B细胞中与中心体相关组分的含量。简而言之，我们确定三个参数。细胞和微珠的面积，以及中心体定位的坐标。接下来，我们定义一个围绕中心体的圆，并从之前确定的中心体中心开始进行径向分布分析。获得曲线图后，确定荧光强度保持在最大值70%处的半径。使用该半径绘制一个围绕中心体的圆。最后，获取目标组分在中心体区域和细胞区域的荧光密度，并将这两个值相除，得到荧光密度比值。为了测量细胞器在免疫突触界面的分布，首先确定与抗原包被的盖玻片接触的B细胞区域。可以通过标记肌动蛋白来帮助界定该区域。接下来，测量细胞与载玻片接触的面积、细胞的高度和宽度。面向抗原包被盖玻片的区域是B细胞活化后B细胞扩散程度的测量指标。利用高度和宽度值在细胞内划定一个中心区域，该区域与边界之间的距离分别为高度值和宽度值的四分之一。通常，该区域大约占细胞总面积的三分之一。最后，通过将中心区域的荧光密度除以整个细胞的荧光密度，计算新突触中心的细胞器募集情况。该指数的正值表示细胞器在新突触中心富集。相反，负值表示细胞器呈外周分布。为测量B细胞在抗原包被的盖玻片上激活后细胞器在z平面的分布情况，首先需界定突触界面及细胞的上边界。接下来，画一条穿过细胞中心的线，并对图像进行重新切片以获得XZ图像。测量细胞的头部，并将图像从免疫突触到细胞上边界均分为10个面积相等的部分。测量每个z轴分段中的荧光强度，并将每个z轴分段的荧光强度除以细胞的总荧光强度，计算出各部分荧光所占的百分比。最后，绘制每个 z 分数的荧光强度百分比。分数一和分数二代表突触界面。以下是中心体分离步骤的工作流程。每个条件使用2000万个B细胞。根据所需方案，用细胞松弛素D和诺考达唑预处理细胞，以促进中心体脱离。接着，将细胞重悬于5 mL TBS缓冲液中进行观察。用1 mL含8%蔗糖的0.1x TBS缓冲液重复上述步骤。用150 µL裂解缓冲液重悬细胞沉淀。在4°C下以10,000 ×g离心10分钟，以分离胞质与细胞器和细胞核。小心回收细胞上清液，并置于1.5 mL离心管中。加入300 µL含有60%蔗糖的梯度缓冲液。在4°C条件下，以10,000 ×g离心30分钟。此离心步骤对于浓缩中心体至关重要。离心后，小心移除上清液，直至达到界面。涡旋管中剩余的样品。在超速离心管中制备不连续蔗糖梯度：先加入0.45 mL 70%蔗糖溶液，再小心叠加0.27 mL 50%蔗糖溶液，然后叠加0.27 mL 40%蔗糖溶液（均溶于梯度缓冲液中）。将中心体富集样品置于不连续梯度上，并在相应转子适配器中校准每个样品的重量。在4°C条件下，以40,000 g离心1小时，采用最低加速度且不启用刹车程序，以避免扰动梯度。 离心后，小心收集12个等体积的组分。用上样缓冲液重悬样品，并进行SDS-PAGE电泳。为了研究B细胞在免疫突触形成过程中细胞器的分布情况，我们使用了经抗原包被的微珠在不同时间点激活的2A1.6 B细胞。作为对照，使用含有无关B细胞受体配体的微珠激活B细胞。随后通过免疫荧光染色检测不同细胞器，这些细胞器在固定化抗原激活后会发生定位改变。此处展示的是以α-微管蛋白标记的中心体和以Rab6a标记的高尔基体。在该图中，我们展示了中心体和高尔基体在激活各个时间点的极性指数，其中每个点代表一个细胞。在激活过程中，我们可以观察到这些细胞器的极性指数趋近于1，表明它们向免疫突触（IS）的募集增加。对于分布较为弥散的细胞器（如溶酶体），也可使用极性指数进行量化。我们可以观察到，溶酶体的极性指数在激活后呈现更高的正值，这是由于其向免疫突触募集所致。我们展示了一种量化溶酶体向免疫突触募集的互补方法。采用相同的抗原包被珠激活方案，通过定量珠周围区域或突触区域内募集的溶酶体荧光标记，计算溶酶体向免疫突触（IS）的募集情况。我们可以观察到开放性激活状态下，与突触位点偶联的溶酶体数量增加。本文展示了用特异性及非特异性抗原包被的微珠激活的B细胞中中心体处肌动蛋白的定量结果。肌动蛋白池以箭头指示。中心体相关组分（如此处的肌动蛋白）的定量可通过点图表示，其中每个点代表一个细胞。活化后，B细胞在中心体周围的肌动蛋白含量减少。此步骤对于使中心体脱离核周区域，进而实现其向新突触的极化至关重要。对于在抗原包被表面活化的B细胞，可研究肌动蛋白的重塑过程以及细胞器向突触膜的募集。在此，我们展示了对细胞器的分析，例如高尔基体和内质网，它们分别呈现中心分布和外周分布。此外，我们还可以计算B细胞在不同激活时间点后的扩散面积。为此，我们对肌动蛋白进行标记，以便能够在XY平面上界定细胞的边界。在图中，您可以观察到细胞在激活 30 和 60 分钟后面积的增加。细胞器在 XZ 平面上相对于突触界面的分布也可以被计算。该图表示肌动蛋白在 z 平面上的分布，其中前两个平面对应于突触界面。我们可以观察到，激活后肌动蛋白在此区域富集。除了成像分析外，还可以采用生物化学方法来研究B细胞激活后中心体组成的变化。此处展示了一张具有代表性的蛋白印迹图，其中浅褐色矩形框标示出含有中心体的组分。通过非连续蔗糖梯度分离中心体组分，并通过γ-微管蛋白水平检测。以下蛋白质印迹显示静息B细胞中心体组分中的肌动蛋白和Arp2，这些蛋白在细胞活化后减少。B淋巴细胞在膜界面发生动态变化，以形成功能性的免疫突触。可通过本视频中介绍的成像和生化技术来研究该过程。我们相信，该分析可为B细胞如何被有效激活所涉及的分子机制提供有价值的信息。

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