研究B细胞在免疫突触形成过程中的细胞器动力学

在本综述中，我们将讨论用于研究免疫突触形成过程中细胞器定位与组成以及细胞骨架重排的成像和生化技术。活性重塑的初始阶段使B细胞能够增加其细胞表面积，并最大限度地富集抗原BCR复合物于突触区域。另一方面，溶酶体在突触膜局部招募，同时伴随中心体的定位，可与溶酶体分泌过程相偶联，而该过程已知有助于提取固定的抗原。

内吞的抗原在内体-溶酶体区室中进一步被加工成肽段，这些肽段可装载到MHC II类分子上，以呈递给辅助性T细胞。因此，研究与免疫突触相关的细胞器动态对于理解B细胞如何被完全激活至关重要。通过对固定化抗原激活的B细胞进行免疫荧光染色，可以追踪不同细胞组分及其向免疫突触募集的过程。

B细胞可通过固定在微珠表面或盖玻片表面的抗原被激活。通过将特异性配体与经戊二醛处理以活化氨基的氨基微珠共同孵育，制备抗原包被的微珠。用100 µL PBS重悬活化的微珠，并涡旋振荡。

同时，通过在150 µL PBS中加入浓度为100 µg/mL的BCR配体来制备抗原溶液。接着，向抗原溶液中加入50 µL活化磁珠，并在4 °C下孵育过夜。注意，还需使用一种无关配体作为阴性对照。

孵育后，用 PBS 洗涤磁珠。吸去上清液，并替换为 PBS。重复三次。

接下来，将珠子重悬于500微升BSA溶液中，以封闭三个氨基基团。最后，将珠子重悬于70微升PBS中。为计算最终浓度，可使用血细胞计数板对珠子进行计数。

进行B细胞活化时，使用50 mL离心管，将细胞重悬于CLICK培养基中，浓度为每毫升150万个细胞，并添加5%胎牛血清。随后，取100微升细胞-磁珠混合物（含15万个B细胞）加入多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片中，于37摄氏度孵育不同时间点。另一种活化B细胞的方法是将细胞接种至抗原包被的盖玻片上。

为此，用抗-BCR 和 B220 包被载玻片，以增强细胞黏附。通过将抗-BRC 和 B220 分别加入 PBS 中，配制抗原溶液，终浓度分别为每毫升 10 微克和每毫升 0.5 微克。接着，将盖玻片置于包有 Parafilm 膜的 24 孔板盖子上，加入 40 微升抗原溶液。

密封培养板，然后在4度条件下过夜孵育。开始盖玻片上的活化步骤时，首先用PBS洗涤盖玻片，并使其干燥数分钟。接着，加入150,000个B细胞，并在37度条件下孵育不同时间点。

在这两种情况下，无论是使用微珠还是抗原包被的载玻片进行激活，我们都建议从最长的时间点开始，然后依次进行较短的时间点。一旦将干燥的盖玻片安装到显微镜载玻片上，可根据分辨率需求，使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察样品。使用透射光对样品进行聚焦。

应寻找细胞与微珠以1:1比例相互作用的视野。对于在抗原包被的盖玻片上激活的B细胞，建议使用100倍物镜以获得更高的分辨率。在参数设置方面，建议采集涵盖整个细胞的z轴层扫图像。

可以通过标记肌动蛋白来界定细胞的下边界和上边界。对于用抗原包被的微球激活的B细胞，若需对标记局限于一个点的细胞器进行定位，首先界定两个区域：细胞区域和微球区域。接着，通过一个点确定细胞器的位置，并获取其定位坐标。

绘制两个向量：一个位于细胞中心与细胞器之间，另一个位于细胞中心与微珠中心之间。测量两者的长度，并测量这两个向量之间的夹角，该夹角现称为 alpha。利用 alpha 的高斯函数，将中心体与细胞中心之间的向量进行投影，然后通过将投影向量 a 除以 b 来计算细胞器的极性指数。

因此，介于0和1之间的极性指数表示极化表型。介于0和-1之间的数值表示非极化表型。为了确定更分散的细胞器（如溶酶体）的极性指数，可使用前述相同算法，只需将细胞器定位坐标替换为标记物（本例中为溶酶体）质量中心的坐标即可。

与之前所述的分析类似，极性指数在零到一之间表示极化表型，而零到负一之间的数值则表示非极化表型。为了定量分析每种细胞器被募集到新突触附近的程度，可以计算细胞器荧光信号在微珠处所占的百分比。具体方法是：首先界定微珠和细胞区域，测量各自的荧光强度，然后将微珠的荧光强度除以微珠与细胞荧光强度的总和。

您将获得与新突触接触的每种细胞器的数量。或者，在微珠的对侧绘制一个矩形，其宽度相当于细胞长度的四分之一，然后测量该矩形内的荧光强度，并将其除以总荧光强度。

该算法将始终用于获取靠近新突触但不一定直接与界面接触的细胞器所占的百分比。用于量化静息和活化B细胞中与中心体相关组分的含量。简而言之，我们确定三个参数。

细胞和微珠的面积，以及中心体定位的坐标。接下来，我们定义一个围绕中心体的圆，并从之前确定的中心体中心开始进行径向分布分析。获得曲线图后，确定荧光强度保持在最大值70%处的半径。

使用该半径绘制一个围绕中心体的圆。最后，获取目标组分在中心体区域和细胞区域的荧光密度，并将这两个值相除，得到荧光密度比值。为了测量细胞器在免疫突触界面的分布，首先确定与抗原包被的盖玻片接触的B细胞区域。

可以通过标记肌动蛋白来帮助界定该区域。接下来，测量细胞与载玻片接触的面积、细胞的高度和宽度。面向抗原包被盖玻片的区域是B细胞活化后B细胞扩散程度的测量指标。

利用高度和宽度值在细胞内划定一个中心区域，该区域与边界之间的距离分别为高度值和宽度值的四分之一。通常，该区域大约占细胞总面积的三分之一。最后，通过将中心区域的荧光密度除以整个细胞的荧光密度，计算新突触中心的细胞器募集情况。

该指数的正值表示细胞器在新突触中心富集。相反，负值表示细胞器呈外周分布。为测量B细胞在抗原包被的盖玻片上激活后细胞器在z平面的分布情况，首先需界定突触界面及细胞的上边界。

接下来，画一条穿过细胞中心的线，并对图像进行重新切片以获得XZ图像。测量细胞的头部，并将图像从免疫突触到细胞上边界均分为10个面积相等的部分。测量每个z轴分段中的荧光强度，并将每个z轴分段的荧光强度除以细胞的总荧光强度，计算出各部分荧光所占的百分比。

最后，绘制每个 z 分数的荧光强度百分比。分数一和分数二代表突触界面。以下是中心体分离步骤的工作流程。

每个条件使用2000万个B细胞。根据所需方案，用细胞松弛素D和诺考达唑预处理细胞，以促进中心体脱离。接着，将细胞重悬于5 mL TBS缓冲液中进行观察。

用1 mL含8%蔗糖的0.1x TBS缓冲液重复上述步骤。用150 µL裂解缓冲液重悬细胞沉淀。在4°C下以10,000 ×g离心10分钟，以分离胞质与细胞器和细胞核。

小心回收细胞上清液，并置于1.5 mL离心管中。加入300 µL含有60%蔗糖的梯度缓冲液。在4°C条件下，以10,000 ×g离心30分钟。

此离心步骤对于浓缩中心体至关重要。离心后，小心移除上清液，直至达到界面。涡旋管中剩余的样品。

在超速离心管中制备不连续蔗糖梯度：先加入0.45 mL 70%蔗糖溶液，再小心叠加0.27 mL 50%蔗糖溶液，然后叠加0.27 mL 40%蔗糖溶液（均溶于梯度缓冲液中）。将中心体富集样品置于不连续梯度上，并在相应转子适配器中校准每个样品的重量。在4°C条件下，以40,000 g离心1小时，采用最低加速度且不启用刹车程序，以避免扰动梯度。

离心后，小心收集12个等体积的组分。用上样缓冲液重悬样品，并进行SDS-PAGE电泳。为了研究B细胞在免疫突触形成过程中细胞器的分布情况，我们使用了经抗原包被的微珠在不同时间点激活的2A1.6 B细胞。

作为对照，使用含有无关B细胞受体配体的微珠激活B细胞。随后通过免疫荧光染色检测不同细胞器，这些细胞器在固定化抗原激活后会发生定位改变。此处展示的是以α-微管蛋白标记的中心体和以Rab6a标记的高尔基体。

在该图中，我们展示了中心体和高尔基体在激活各个时间点的极性指数，其中每个点代表一个细胞。在激活过程中，我们可以观察到这些细胞器的极性指数趋近于1，表明它们向免疫突触（IS）的募集增加。对于分布较为弥散的细胞器（如溶酶体），也可使用极性指数进行量化。我们可以观察到，溶酶体的极性指数在激活后呈现更高的正值，这是由于其向免疫突触募集所致。我们展示了一种量化溶酶体向免疫突触募集的互补方法。

采用相同的抗原包被珠激活方案，通过定量珠周围区域或突触区域内募集的溶酶体荧光标记，计算溶酶体向免疫突触（IS）的募集情况。我们可以观察到开放性激活状态下，与突触位点偶联的溶酶体数量增加。

本文展示了用特异性及非特异性抗原包被的微珠激活的B细胞中中心体处肌动蛋白的定量结果。肌动蛋白池以箭头指示。中心体相关组分（如此处的肌动蛋白）的定量可通过点图表示，其中每个点代表一个细胞。

活化后，B细胞在中心体周围的肌动蛋白含量减少。此步骤对于使中心体脱离核周区域，进而实现其向新突触的极化至关重要。对于在抗原包被表面活化的B细胞，可研究肌动蛋白的重塑过程以及细胞器向突触膜的募集。

在此，我们展示了对细胞器的分析，例如高尔基体和内质网，它们分别呈现中心分布和外周分布。此外，我们还可以计算B细胞在不同激活时间点后的扩散面积。为此，我们对肌动蛋白进行标记，以便能够在XY平面上界定细胞的边界。

在图中，您可以观察到细胞在激活 30 和 60 分钟后面积的增加。细胞器在 XZ 平面上相对于突触界面的分布也可以被计算。该图表示肌动蛋白在 z 平面上的分布，其中前两个平面对应于突触界面。

我们可以观察到，激活后肌动蛋白在此区域富集。除了成像分析外，还可以采用生物化学方法来研究B细胞激活后中心体组成的变化。此处展示了一张具有代表性的蛋白印迹图，其中浅褐色矩形框标示出含有中心体的组分。

通过非连续蔗糖梯度分离中心体组分，并通过γ-微管蛋白水平检测。以下蛋白质印迹显示静息B细胞中心体组分中的肌动蛋白和Arp2，这些蛋白在细胞活化后减少。B淋巴细胞在膜界面发生动态变化，以形成功能性的免疫突触。

可通过本视频中介绍的成像和生化技术来研究该过程。我们相信，该分析可为B细胞如何被有效激活所涉及的分子机制提供有价值的信息。