Name: 使用 CRISPR/Cas9 在 CAR-T 电池中敲除 GM-CSF (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 了解利用CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞制备过程中进行基因编辑的方法，通过敲除GM-CSF基因提高疗效并降低毒性。该方案整合了细胞培养、慢病毒转导和基因编辑技术，为肿瘤免疫治疗研究提供可靠的实验流程。

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本研究获得了以下资助：K12CA090628（SSK）、美国国家综合癌症网络（SSK）、梅奥诊所个体化医学中心（SSK）、Predolin基金会（SSK）、梅奥诊所转化实践办公室（SSK）以及梅奥诊所医学科学家培训项目Robert L. Howell医师-科学家奖学金（RMS）。

本方案遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB）和机构生物安全委员会（IBC）的指南。
1. CART19 细胞的制备
<ol>
	<li>T细胞分离、刺激及体外培养
	<ol>
		<li>在细胞培养超净台中进行所有细胞培养操作，并使用适当的个人防护装备。从去标识化的正常供体血液分离锥中收集外周血单个核细胞（PBMCs），这些血液样本是在单采术期间采集的，已知是PBMCs的有效来源。13</li>
		<li>分离PBMC时，向50 mL密度梯度分离管中加入15 mL密度梯度介质。用等体积含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释供体血液，以避免细胞滞留。
		<ol>
			<li>将锥形容器中稀释后的供体血液加入分离管，注意不要扰动血液与密度梯度介质之间的界面。在1,200 x g 室温下孵育10分钟。</li>
			<li>将上清液倒入一个新的50 mL锥形管中，用PBS + 2% FBS定容至40 mL洗涤，300 × g离心 g 室温孵育8分钟，吸除上清液，加入40 mL缓冲液重悬细胞，计数细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用全自动细胞分离仪，根据制造商说明书，通过负向选择磁珠试剂盒从外周血单个核细胞中分离T细胞。</li>
		<li>为了培养分离的T细胞，需制备T细胞培养基&#160;（TCM）由10%人AB血清（v/v）、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺（v/v）和无血清造血细胞培养基组成。将培养基灭菌&#160;通过0.45 µm无菌真空滤器过滤，随后用0.22 µm无菌真空滤器过滤。</li>
		<li>第0天（T细胞刺激当天），在刺激T细胞前对CD3/CD28磁珠进行洗涤。洗涤时，取所需体积的磁珠（CD3/CD28磁珠用量应达到磁珠：T细胞=3:1的比例）；&#160;注意，磁珠的浓度可能有所不同）置于无菌的1.5 mL微量离心管中，并重悬于1 mL TCM中。</li>
		<li>与磁铁接触放置。</li>
		<li>1分钟后，吸除TCM，加入1 mL新鲜TCM重悬以洗涤磁珠。</li>
		<li>重复此步骤，共洗涤三次。</li>
		<li>第三次洗涤后，将磁珠重悬于1 mL TCM中。</li>
		<li>计数T细胞。</li>
		<li>以3:1的微珠与细胞比例将微珠加入T细胞中。</li>
		<li>将细胞稀释至终浓度为 1 x 106 cells/mL</li>
		<li>37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T细胞转染与转导
	<ol>
		<li>使用增强型生物安全二级（BSL-2+）防护措施进行慢病毒操作，包括在细胞培养生物安全柜中操作、穿戴个人防护装备，以及在处理废弃材料前使用含氯漂白剂进行消毒。</li>
		<li>获取含有CART19的慢病毒载体构建体。 
		注意：此处使用的CART19构建体由研究人员设计并合成 从头合成 使用商业化的蛋白质合成供应商进行制备。随后将CAR结构克隆至由EF-1α启动子调控的第三代慢病毒载体中。该单链可变区片段来源于FMC63克隆，可识别人CD19。CAR19结构包含第二代4-1BB共刺激结构域和CD3ζ刺激结构（FMC63-41BBz）。12</li>
		<li>按照先前所述方法进行慢病毒的制备。12
		<ol>
			<li>简而言之，制备慢病毒时，使用贴壁生长至70-90%汇合度的293T细胞。</li>
			<li>在室温下孵育30分钟，转染试剂包括：15 µg 目标慢病毒质粒、18 µg gag/pol/tat/rev 包装载体、7 µg VSV-G 包膜载体、111 µL 预复合试剂、129 µL 转染试剂以及9.0 mL 转染培养基&#160;在转染293T细胞前进行处理。随后将转染后的细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2.</li>
			<li>收获&#160;离心（900 × g，10 分钟），过滤（0.45 µm 尼龙滤膜），并在 24 和 48 小时浓缩上清液&#160;通过超速离心在13,028 x g条件下 g 18 小时&#160;或 112,700 × g 2小时。</li>
			<li>-80 °C 冻存以备后续使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第1天，轻轻重悬T细胞，以打散此前已刺激的T细胞形成的玫瑰花结结构，细胞密度为1 × 10⁶6/mL，第0天</li>
		<li>在针对所有慢病毒操作的适当BSL-2+防护条件下，将新鲜或冻存的收获病毒以3.0的感染复数（MOI）加入刺激后的T细胞中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CAR-T细胞扩增
	<ol>
		<li>在扩增阶段，继续将转导的T细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育。2第3天和第5天计数CAR-T细胞，并加入新鲜预温的TCM培养基，以维持CAR-T细胞浓度为1 × 10⁶ cells/mL6/mL</li>
		<li>刺激后第6天（第6天）使用磁铁从转导的T细胞中去除磁珠。将T细胞收集、重悬并转移至50 mL锥形管中，置于磁铁上1分钟。随后收集上清液（含CAR-T细胞），弃去磁珠。</li>
		<li>将收集的CAR-T细胞以1 x 10的浓度重新放入培养6 细胞/mL，以继续扩增。</li>
		<li>第6天，通过流式细胞术检测CAR的表面表达。 
		注意：可采用多种方法检测CAR的表面表达，例如使用山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附的二抗进行染色，或使用与荧光染料偶联的CD19特异性肽段进行染色。取培养物中的等分试样（约100,000个T细胞），用流式缓冲液洗涤，该缓冲液由Dulbecco's磷酸盐缓冲液、2%胎牛血清和1%叠氮化钠配制而成。用抗CAR抗体对细胞染色后，洗涤两次。再用活/死细胞染料和CD3单克隆抗体（OKT3）对细胞染色。洗涤细胞后重悬于流式缓冲液中。上机进行流式细胞仪检测，以确定转导效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CAR-T细胞冻存
	<ol>
		<li>在刺激后第8天（T细胞扩增第8天）收获并冻存CAR-T细胞，从培养物中收获细胞。</li>
		<li>300 × g 离心5分钟 g.</li>
		<li>用冻存液重悬细胞，每管按1000万个细胞/mL的密度分装，冻存液由10%二甲基亚砜和90%胎牛血清组成。</li>
		<li>使用冻存容器冷冻，以实现 -1 °C/min 的冷却速率&#160;在-80 °C冰箱中冷冻，48小时后转移至液氮中。</li>
		<li>在用于体外或体内实验之前，将CAR-T细胞在温热的TCM中解冻。</li>
		<li>洗涤细胞以稀释并去除二甲基亚砜，然后重悬至浓度为 2 x 106 细胞/mL，于37 °C、5% CO₂条件下静置过夜2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.&#160;GM-CSF k/o CART19 的制备
<ol>
	<li>为破坏GM-CSF，使用靶向人GM-CSF（CSF2）第3外显子的向导RNA（gRNA），该gRNA通过筛选先前报道对编码人细胞因子GM-CSF的CSF2基因具有高效率的gRNA获得。14 
	注：使用了一种商业合成的研究级Cas9第三代慢病毒载体，其中包含该gRNA（位于U6启动子下）。该载体含有嘌呤霉素抗性基因。gRNA序列为GACCTGCCTACAGACCCGCC。12</li>
	<li>为生产慢病毒，使用已达到70-90%融合度的293T细胞。</li>
	<li>将15 µg目标慢病毒质粒、18 µg gag/pol/tat/rev包装载体、7 µg VSV-G包膜载体、111 µL预复合试剂、129 µL转染试剂和9.0 mL转染培养基&#160;在室温下孵育30分钟&#160;。</li>
	<li>将转染试剂加入293T细胞中，随后在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>在24小时和48小时收集上清液，离心（900 × g，10分钟），过滤（0.45 µm尼龙滤器），并通过超速离心浓缩：可选择13,028 × g离心18小时&#160;或112,700 × g离心2小时&#160;，然后在-80 °C保存以备后续使用&#160;。</li>
	<li>第1天，轻轻重悬T细胞以打散细胞聚集体。</li>
	<li>在符合BSL-2+标准的实验室中，将冷冻或新鲜制备的病毒加入活化的T细胞中以生成CAR-T细胞。使用CAR19慢病毒和靶向GM-CSF的CRISPR慢病毒共同转导T细胞。CAR19慢病毒的感染复数（MOI）为3。由于无法对CRISPR慢病毒进行滴定，因此使用由15 µg质粒制备所得的病毒颗粒转导10&#160;× 106个T细胞。</li>
	<li>有关T细胞活化、扩增及冷冻保存的其余步骤，请参见步骤1中的描述。</li>
	<li>对于携带嘌呤霉素抗性的lentiCRISPR编辑T细胞，在第3天和第5天以每1 mL培养基含1 µg嘌呤霉素二盐酸盐的浓度处理细胞。</li>
</ol>
3.&#160;GM-CSF 敲除效率及 GM-CSF k/o CART19 的功能评估
<ol>
	<li>GM-CSF 基因敲除效率：通过分解法追踪插入缺失（TIDE）测序与分析
	<ol>
		<li>为对 GM-CSF 基因中目标外显子进行测序，请使用以下引物。GM-CSF（CSF2）基因的正向引物序列为 TGACTACAGAGAGGCACAGA，反向引物序列为 TCACCTCTGACCTCATTAACC。</li>
		<li>使用基因组提取试剂盒从最多 500 万个 CAR-T 细胞中提取 DNA。PCR 反应中每反应使用 25 µL Taq 预混液，PCR 反应中每种引物的终浓度为 µM，模板 DNA 用量为 0.1–0.5 µg，用无核酸酶水将 PCR 反应总体积补至 50 µL。</li>
		<li>参见 表 1 中描述的 PCR 循环条件。</li>
		<li>将 PCR 产物在 1–2% 琼脂糖凝胶中以 100 V 电泳 30 分钟&#160;，并使用胶回收试剂盒进行提取。</li>
		<li>对 PCR 扩增产物进行测序。将原始数据上传至合适的 TIDE 软件，计算等位基因修饰频率。15</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GM-CSF 的产生及 GM-CSFk/o CART19 的功能评估
	<ol>
		<li>为测定 CAR-T 细胞的细胞因子分泌情况，将野生型 CART19 细胞与 GM-CSFk/o CART19 细胞以 1:5 的比例与表达 CD19 的急性淋巴细胞白血病细胞系 NALM6 共培养 4 小时&#160;，培养条件为 37 °C、5% CO2，并加入莫能菌素溶液、抗人 CD49d、抗人 CD28 和抗人 CD107a 抗体。</li>
		<li>从培养物中收集细胞用于流式细胞术检测。用流式细胞术缓冲液洗涤细胞。使用活/死细胞染色试剂盒对细胞进行染色。室温避光孵育 15 分钟。使用固定液固定细胞，并在室温避光条件下孵育 15 分钟。</li>
		<li>洗涤后，使用透化缓冲液联合抗人 IFNγ 单克隆抗体、抗人 GM-CSF、抗人 MIP-1β、抗人 IL-2 和抗人 CD3 抗体对细胞进行胞内染色，室温避光孵育 30 分钟。洗涤并重悬样本。使用流式细胞仪采集数据，并分析胞内 GM-CSF 表达的百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
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<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
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<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK 是嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）治疗领域多项专利的发明人，这些专利已授权给诺华公司（由梅奥诊所、宾夕法尼亚大学与诺华公司之间的协议所规定）。本研究部分由 Humanigen 提供的资助支持（SSK）。RMS、MJC、RS 和 SSK 是与本研究相关专利的发明人。该实验室（SSK）收到来自 Tolero、Humanigen、Kite、Lentigen、Morphosys 和 Actinium 的经费支持。

在本报告中，我们描述了一种利用 CRISPR/Cas9 技术在 CAR-T 细胞中诱导二次修饰的方法。具体而言，该方法&#160;使用含有靶向目的基因的gRNA和Cas9的慢病毒载体，通过慢病毒转导生成粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）k/o CART19细胞。我们先前已证明，在异种移植模型中，GM-CSF中和可改善细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NT）。12&#160;如前所述，GM-CSFk/o CAR-T细胞可在制备过程中抑制GM-CSF，有效减少GM-CSF的产生，同时维持其他关键的T细胞功能，与野生型CAR-T细胞相比，体内抗肿瘤活性显著增强。12
由于Cas9在基因组中的永久性整合在转化为临床可用产品时可能带来非预期效应，我们提出这一特定方法，用于生成研究级别的CRISPR/Cas9修饰的CART19，以进行概念验证实验。
尽管CAR-T细胞在癌症治疗中具有前...

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）疗法在癌症治疗中展现出巨大前景。1,2&#160;近期，两种靶向CD19的CAR-T细胞疗法（CART19）已在美国和欧洲获批，用于治疗B细胞恶性肿瘤，其在多中心临床试验中表现出显著疗效。3,4,5&#160;CAR-T细胞更广泛应用的障碍包括在实体瘤中活性有限，以及相关的毒性反应，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NT）。3,5,6,7,8,9&#160;为了提高CAR-T细胞疗法的治疗指数，研究人员利用锌指核酸酶、TALENs和CRISPR等基因组编辑工具对CAR-T细胞进行进一步改造，以期获得毒性更低或疗效更佳的CAR-T细胞。10,11
本文介绍一种生成经CRISPR/Cas9编辑的CAR-T细胞的方法。该方法的具体目标是在CAR-T细胞制备过程中，利用CRISPR/Cas9技术对CAR-T细胞进行基因改造，以获得毒性更低或疗效更佳的CAR-T细胞。开发该方法的理论基础源于CAR-T细胞治疗的临床经验，这些经验表明迫切需要新的策略来扩大CAR-T细胞治疗的治疗窗，并将其应用拓展至其他肿瘤；同时，合成生物学的最新进展也支持这一方向，使得对CAR-T细胞进行多重修饰的技术已开始进入临床应用。尽管目前已有多种基因组编辑工具在不同场景下被开发和应用，如锌指核酸酶、TALENs和CRISPR技术，本文所述方法聚焦于CRISPR/Cas9对CAR-T细胞的修饰。10,11&#160;CRISPR/Cas9是一种基于RNA的细菌防御机制，其功能是清除外源DNA。该技术依赖核酸内切酶，通过向导RNA（gRNA）识别靶序列并进行切割。相较于其他基因组编辑工具，CRISPR对CAR-T细胞的编辑具有多项优势，包括gRNA序列的高特异性、针对目标基因设计gRNA的简便性、高效的基因编辑能力，以及可同时使用多个gRNA实现多基因靶向的潜力。
在本文所述方法中，我们使用编码CRISPR向导RNA和Cas9的慢病毒，在T细胞的CAR转导过程中破坏目标基因。在选择合适的CAR-T细胞编辑技术时，我们建议本文所述技术是一种高效生成科研级CAR-T细胞的方法；但由于Cas9永久整合到基因组中的长期影响尚不明确，因此我们建议将该方法用于开发概念验证型科研级CAR-T细胞，而不适用于制备符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的CAR-T细胞。
特别地，本文描述了靶向人CD19的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）敲除型CAR-T细胞的制备方法。这些CAR-T细胞通过转导编码特异性靶向GM-CSF（基因名CSF2）的向导RNA和Cas9的慢病毒颗粒而生成。我们先前发现，在异种移植模型中，中和GM-CSF可改善细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NT）12&#160;。GM-CSFk/o CAR-T细胞可在制备过程中抑制GM-CSF的产生，从而有效减少GM-CSF的生成，同时相较于野生型CAR-T细胞增强CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性和存活能力12&#160;。因此，本文提供了一种制备CRISPR/Cas9编辑的CAR-T细胞的方法。

<table><tbody><tr><td>CD3 单克隆抗体（OKT3），PE，eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CD3 单克隆抗体（UCHT1），APC，eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 系统 B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14190-144&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S（磁性颗粒浓缩器）</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep 磁铁</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 T 细胞分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>阴性选择磁珠；17951RF 包含吸头和缓冲液</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记小鼠抗人 CD107a&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>固定液（溶液A）</td><td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA 载体：名称：CSF2&lt;br/&gt; CRISPR 指导 RNA 1；物种：人，载体：&lt;br/&gt; pLentiCRISPR v2；抗性：氨苄青霉素；拷贝数：&lt;br/&gt; 高；质粒制备：标准递送：4 &amp;mu;克（游离）&lt;br/&gt; 免费</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>定制订单</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG（H+L）山羊多克隆二抗，经交叉吸附，Alexa Fluor 647 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl</td><td>Desktop Genetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人AB型血清；男性供体；AB型；美国</td><td>康宁</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFNγ 单克隆抗体（4S.B3），APC-eFluor 780，eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒（适用于 405 nm 激发）</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>莫能菌素溶液，1000倍浓缩液</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD28 克隆 CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD49d 单克隆抗体 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人MIP-1&amp;beta; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Frosty先生冷冻容器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6，克隆 G5&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>急性淋巴细胞白血病细胞系</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯真空过滤系统，500 mL，PES膜，0.22 μm，无菌</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 快速流速无菌一次性滤器（CN 膜，0.45 μm）</td><td>赛默飞世尔科技 Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基（1X），液体</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 小鼠抗人 IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓缩液），液体</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>破膜液（B液）</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td>0210055210</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗人 GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>全自动细胞分离仪</td></tr><tr><td>SepMate-50（IVD）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠，5%（w/v）</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 crispr/cas9 在 car-t 细胞中敲除 gm-csf

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法是一种前沿且可能具有革命性的癌症治疗新方法。然而，该疗法在癌症治疗中的广泛应用仍存在显著局限性。这些局限性包括出现独特的毒性反应，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NT），以及在实体瘤中CAR-T细胞扩增能力有限、效应功能不足和抗肿瘤活性较弱。一种提高CAR-T疗效和/或控制其毒性的策略是在CAR-T细胞制备过程中对CAR-T细胞自身的基因组进行编辑。本文描述了通过慢病毒载体转导携带靶向粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的向导RNA和Cas9的构建体，实现CRISPR/Cas9基因编辑技术在CAR-T细胞中的应用。以敲除GM-CSF为例，我们阐述了CRISPR/Cas9介导的GM-CSF基因敲除方法。我们已证实，与野生型CAR-T细胞相比，GM-CSFk/o CAR-T细胞能够有效减少GM-CSF的产生，同时保持关键的T细胞功能，并在体内表现出更强的抗肿瘤活性。

图1 显示了GM-CSFk/o CART19细胞中GM-CSF的减少。为验证T细胞基因组已被编辑以敲除GM-CSF，对GM-CSFk/o CART19细胞进行了TIDE测序分析（图1A）。通过门控活CD3+细胞进行CAR-T细胞表面染色，证实T细胞在体外成功表达了CAR表面受体（图1B）。通过流式细胞术对GM-CSF进行胞内染色，门控活CD3+细胞后显示GM-CSFk/o CART19细胞中GM-CSF表达显著降低，验证了基因敲除的功能性成功（图1C）。与野生型抗CD19 CAR-T细胞（CART19）相比，GM-CSFk/o CAR-T细胞通过胞内染色检测显示GM-CSF水平降低（图1B）...

本文介绍了一种通过CRISPR/Cas9系统对CAR-T细胞进行基因编辑的实验方案。

使用 CRISPR/Cas9 在 CAR-T 细胞中敲除 GM-CSF

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法是一种前沿且具有潜在革命性的新型癌症治疗方案。然而，目前仍存在……

本方案描述了在CAR-T细胞制备过程中利用CRISPR技术对其进行基因改造，以生成更有效且毒性更低的产品。该技术的一个优势在于，CAR-T细胞的制备与基因操作可在同一细胞中高效完成。本实验操作将由本实验室的医学博士生Rosalie Sterner、技术员兼研究生Michelle Cox以及博士后研究员Reona Sakemura进行示范。从采集的外周血单个核细胞中分离T细胞后，开始进行培养：首先配制T细胞培养基，然后通过0.45微米无菌真空滤器过滤，再用0.22微米无菌真空滤器过滤以完成灭菌。在T细胞刺激当天（即第0天）刺激前，将CD3/CD28磁珠洗涤：取所需体积的磁珠置于无菌的1.5毫升微量离心管中，加入1毫升TCM重悬。将离心管紧贴磁铁放置1分钟。然后吸除TCM，并加入一毫升新鲜TCM重悬磁珠，再次洗涤，共洗涤三次。最后，将磁珠重悬于一毫升TCM中。计数T细胞后，按磁珠与细胞3:1的比例将磁珠转移至T细胞中。然后将细胞稀释至终浓度为每毫升一百万个细胞，并在37摄氏度、5% CO2条件下培养24小时。获得携带CART19构建体的慢病毒载体后，进行慢病毒生产：首先将慢病毒质粒、包装载体、包膜载体、预复合试剂、转染试剂和转染培养基在室温下孵育30分钟。进行慢病毒操作时应采取BSL2+级防护措施，包括使用细胞培养生物安全柜、个人防护装备，以及在处理废弃物前用漂白剂对使用过的材料进行消毒。孵育后，将这些转染试剂加入已达到70%至90%汇合度的293 T细胞中，并在37摄氏度、5% CO2条件下培养转染后的细胞。转染后24小时和48小时，收集细胞，离心、过滤，并通过超速离心浓缩含病毒的上清液，随后于-80摄氏度冷冻保存以备后续使用。第一天，将第零天已激活的T细胞以每毫升一百万个细胞的密度轻柔重悬，以打散细胞聚集体。在适当的BSL2+防护条件下，将新鲜或冻存的收获病毒以感染复数3.0加入模拟T细胞中。将转导后的T细胞继续在37摄氏度、5%CO2条件下培养。在第3天和第5天，计数CAR-T细胞，并向培养物中添加新鲜预热的TCM，以维持CAR-T细胞浓度为每毫升一百万个细胞。转导T细胞后第六天，首先收集并重悬细胞，将细胞转移至50毫升锥形管中，置于磁铁中静置1分钟，从而去除磁珠。收集含有CAR-T细胞的上清液，弃去磁珠，将细胞重新置于培养瓶中继续培养，培养浓度为每毫升100万个细胞。使用细胞样品进行流式细胞术，以评估CARs的表面表达。将剩余细胞继续培养以恢复扩增，随后在第8天按照文中所述方法收获并冻存细胞。为破坏粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，使用文中所述的向导RNA。将转染试剂在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，将其加入已达到 70% 至 90% 汇合度的 293 T 细胞中，并在 37°C、5% CO₂ 条件下培养转染后的细胞，以产生慢病毒。在转染后 24 小时和 48 小时，分别收集含病毒的上清液，使用 50 毫升超速离心管通过超速离心浓缩，并于 -80°C 冻存，以备后续使用。然后在第1天，轻轻重悬T细胞以打散玫瑰花环结构。在符合BSL2+标准的实验室中，为生成CAR-T细胞，向模拟T细胞中加入CAR19慢病毒和靶向GMCSF的CRISPR慢病毒。在第3天和第5天，对成功转导并经lentiCRISPR编辑、携带嘌呤霉素抗性的T细胞，以每毫升含1微克嘌呤霉素的嘌呤霉素二盐酸盐浓度处理细胞。通过长读长测序技术确认了GM-CSF基因敲除的CART19细胞中GM-CSF表达降低，基因编辑效率约为71%。对活体CD3阳性细胞进行CAR-T细胞表面染色的流式图显示，野生型CART19细胞与GM-CSF基因敲除的CART19细胞在体外均成功且以相似水平表达了CAR表面受体。另一方面，通过流式细胞术对活体CD3阳性细胞进行细胞内GM-CSF染色，结果显示与野生型CART19细胞相比，基因敲除细胞中GM-CSF的表达显著降低，证实了基因敲除的功能性成功。在本实验流程中，转导步骤需格外谨慎操作，因其对基因修饰CAR-T细胞的制备最为关键。所述方法有望应用于多种基因，通过CRISPR/CAS9技术修饰CAR-T细胞，从而帮助生成毒性更低、疗效更佳的产品。CRISPR/CAS9技术提供了直接靶向CAR-T细胞基因组的策略，以构建解决当前临床局限性的工程化方案。

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使用 CRISPR/Cas9 在 CAR-T 电池中敲除 GM-CSF

该视频概述了通过CRISPR-Cas9系统制备基因修饰CAR T细胞的流程。将CRISPR和CAR慢病毒共同感染T细胞，可实现对目标基因的修饰，并合成嵌合抗原受体（CAR），最终生成基因修饰的CAR...

使用 CRISPR-Cas9 系统基因改造 CAR T 细胞

本视频演示了使用 CRISPR-Cas9 技术在人 T 细胞中进行基因编辑的实验方法。将原代 CD4+ 和 CD8+ T 细胞与靶向特定基因以实现基因敲除的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物混合。通过电穿孔后，sgRNA 引导 Cas9 至目标 DNA...

一种用于T细胞基因编辑的CRISPR-Cas9技术

利用CRISPR/Cas9进行靶向基因编辑极大地促进了对基因生物学功能的理解。在此，我们采用CRISPR/Cas9技术在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

传统的利用基因敲除动物进行的基因功能缺失研究通常成本高昂且耗时。基于电穿孔的CRISPR介导体细胞突变技术是研究基因功能的强大工具。...

使用CRISPR介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞 子宫内 基于电穿孔的基因转移

人源CRISPR基因编辑CAR-T细胞的制备

为了更深入地研究造血干细胞生物学及血液系统恶性肿瘤，有必要建立能够真实模拟造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的新型策略。本文介绍了一种结合使用CRISPR/Cas9与双rAAV供体转导技术，在HSPCs中模拟杂合功能获得性突变的实验方案。...

在人类造血干细胞和祖细胞中构建致癌性杂合功能获得突变

本文介绍了一种选择性改变脉络丛基因表达的方法，同时避免对大脑其他区域产生任何影响。...

脉络丛中基因的靶向敲低

本文描述了一种应用于 体外 健康供体嵌合抗原受体T细胞中用于耗竭模型的全基因组CRISPR敲除筛选...

在嵌合抗原受体T细胞中进行体外全基因组CRISPR敲除筛选

改进CAR T细胞中CRISPR-Cas9筛选：一种优化的文库构建方法

了解利用CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞制备过程中进行基因编辑的方法，通过敲除GM-CSF基因提高疗效并降低毒性。该方案整合了细胞培养、慢病毒转导和基因编辑技术，为肿瘤免疫治疗研究提供可靠的实验流程。

使用 CRISPR/Cas9 在 CAR-T 细胞中敲除 GM-CSF

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