Name: 使用 Ever 设计自动化、高通量、连续细胞生长实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 了解如何使用eVOLVER平台建立自动化高通量连续微生物培养实验。该方法支持实时监测光密度和温度，实现动态参数控制，帮助研究人员分析不同菌株的生长速率和适应性差异。

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感谢 B. Stafford 在系统设计方面的协助，以及 H. Khalil、A. Soltanianzadeh、A. Sun、S. Pipe 和 A. Cavale 在系统构建过程中提供的帮助。我们感谢波士顿大学哈里里计算研究所的电子设计设施（Electronics Design Facility, EDF）、工程产品创新中心（Engineering Product Innovation Center, EPIC）以及软件与应用创新实验室（Software &amp;#38; Application Innovation Lab, SAIL）所提供的服务支持。本研究得到了美国国家科学基金会职业奖（NSF CAREER Award，MCB-1350949，授予 A.S.K.）以及美国国防高级研究计划局（DARPA）资助项目 HR0011-15-C-0091 和 HR0011-18-2-0014（授予 A.S.K.）的支持。A.S.K. 还获得了美国国立卫生研究院院长新创新者奖（NIH Director’s New Innovator Award，1DP2AI131083-01）、DARPA 青年教员奖（D16AP00142）以及 NSF 计算探索项目（NSF Expeditions in Computing，CCF-1522074）的资助。

1. 准备培养基、小瓶和接种物
注意：本方案假设用户已完成 eVOLVER 系统的校准，并正在使用先前研究中描述的 Smart Sleeve 配置16。Smart Sleeve 可轻松重新设计或修改，但不同配置下的体积和控制参数设置细节可能有所不同。
<ol>
	<li>实验前一天，在30 °C、转速至少为300 r.p.m.的摇床培养箱中，用YPD培养基（酵母浸出粉胨葡萄糖培养基）制备2 mL的酿酒酵母（S. cerevisiae）BY4741参考菌株及变异菌株的过夜液体培养物。</li>
	<li>将无菌YPD培养基转移至洁净且已高压灭菌的、配有导管的瓶中。或者，也可将培养基直接装入预先安装导管的瓶中进行高压灭菌。 
	注意： 通过在瓶盖上钻孔，并将导管穿入孔中，再用接头固定，即可完成瓶体与导管的装配。参见材料表。</li>
	<li>向每个小瓶中加入搅拌子，并拧上配有进液和出液吸管的瓶盖。通过目视检查，确保所有组件均清洁无污染。</li>
	<li>将小瓶放入可高压灭菌的支架中，用铝箔覆盖，并在重力或真空灭菌程序中进行高压灭菌，灭菌步骤保持20分钟。</li>
</ol>
2. 实验设置
<ol>
	<li>在三个大烧杯中，分别准备 500 mL 的 10% 次氯酸钠溶液、200 mL 的 10% 次氯酸钠溶液和 300 mL 的 70% 乙醇溶液。</li>
	<li>使用 eVOLVER 设备上的开关，先打开 eVOLVER 的 5 V 电源，等待 5 秒后，再打开 12 V 电源。</li>
	<li>若从同一瓶培养基中为多个小瓶供液，请使用管路分流器连接多条培养基输入管路。可使用鲁尔接头组件自制管路分流器。</li>
	<li>将培养基输入管路浸入第一个次氯酸钠溶液烧杯中，将培养基流出管路浸入第二个次氯酸钠溶液烧杯中。将培养基输入管路的下游末端与流出管路一同置于第二个烧杯中。将废液管路插入废液桶中。</li>
	<li>向一个大的空废液桶中加入 1–2 L 次氯酸钠溶液，用于灭活实验过程中产生的废液。请咨询安全负责人，确保废液得到妥善处理。</li>
	<li>通过 eVOLVER 的触摸屏进入设置部分，运行所有泵 20 秒，使 10% 次氯酸钠溶液充满流体管路。运行过程中，需目视检查确认所有管路均已充满，且各泵运行正常。让次氯酸钠溶液在管路中静置至少 30 分钟以完成灭菌。</li>
	<li>再次使用触摸屏应用程序运行泵，直至管路不再浸没于液体中，使空气通过管路，尽可能排出残留的次氯酸钠溶液。</li>
	<li>将培养基输入管路放入乙醇烧杯中，并重复上述操作，用乙醇充满管路后再用空气冲洗。 
	注意：由于乙醇具有快速杀菌作用，无需等待 30 分钟进行灭菌。</li>
	<li>使用鲁尔接头将培养基输入管路连接至培养基瓶，并运行泵，直至培养基完全流经管路，以冲洗残留的乙醇。</li>
	<li>将已灭菌的小瓶部分插入 eVOLVER Smart Sleeves 中，并根据管路的颜色编码将其连接至相应位置。首先将输入管路连接至较短的进液吸管，再将废液管路连接至较长的出液吸管。 
	警告：必须仔细检查是否存在松动的连接或错误布设的管路。若未进行检查，可能导致溢出，并可能损坏 Smart Sleeve。</li>
	<li>以 10 秒为间隔，依次运行所有泵，使培养基注入小瓶。需通过目视检查确认出液泵能够通过出液吸管有效排出培养基，以防止溢出。若发现出液吸管工作不畅，应检查流体管路连接和蠕动泵状态，并根据需要进行修正或更换部件。</li>
	<li>将小瓶完全推入，使其完全被 Smart Sleeve 包裹。</li>
	<li>在 eVOLVER 触摸屏的交互式设置页面上，设置实验参数的初始条件。对所有小瓶，将温度设为 30 °C，搅拌速度设为 10。可通过在触摸屏上用手指滑动以同时选中所有小瓶，一次性完成设置。</li>
</ol>
3. 配置 eVOLVER 软件并编程算法化培养流程
<ol>
	<li>在计算机上的 eVOLVER 控制面板中，进入实验管理页面。在实验导航面板中选择基础实验或一个已有实验作为起点，然后点击“克隆新建”。 
	注意：通过将保存实验定义的代码仓库的 GitHub 链接粘贴到实验管理器中，可以使用其他组的实验。</li>
	<li>指定实验名称以及将要运行该实验的 eVOLVER 设备。请确保通过修改页面上的这些字段，已选择所需的校准设置。</li>
	<li>使用小瓶选择器和参数定义面板来设置实验条件。例如，若要将小瓶 0-4 的温度设置为 30 °C，请在小瓶选择器中选中这些小瓶，将参数定义设为 30，然后点击 设置。对光密度（OD）重复此操作，以为每个小瓶设置上限和下限阈值。</li>
	<li>完成实验参数定义后，点击 保存 以保存实验，然后点击 开始 以运行实验。</li>
</ol>
4. 启动实验并实时监测
<ol>
	<li>实验开始后，进入交互式仪表板中的实时数据面板。针对每个小瓶，通过浏览图表确认OD值保持在零，且温度已达到或正趋向于设定的程序温度。</li>
	<li>准备接种物时，测定过夜培养物的OD值，假设小瓶体积为25 mL，计算所需的稀释倍数，并通过取样口将计算所得体积的接种物用移液器加入小瓶中。例如，若过夜培养物的OD值为2.0，需在培养小瓶中达到约0.05的起始OD值，则应向每个小瓶中加入625 μL的菌液。</li>
	<li>检查仪表板上的图表，确认OD曲线已相应更新。图表中应显示OD值上升至接近预期的起始OD值。</li>
	<li>在整个实验过程中，通过浏览仪表板中相应的图表来跟踪不同类型的数据（如OD值、温度、生长速率、代时和培养基消耗量）。这些数值可为用户提供实验决策依据（例如设定取样时间点），甚至可用于实现自动反馈控制的函数中。</li>
	<li>若需在实验中途更换培养基瓶，首先在实验管理面板中暂停实验，以防止泵的运行。迅速将培养基管路从空瓶上拧下并连接至新瓶。避免触碰管路末端，以防污染。随后在实验管理器中恢复实验运行。</li>
</ol>
5. 从 eVOLVER 管中取样酵母细胞
<ol>
	<li>制备环己酰亚胺溶液以抑制蛋白质合成，并固定酵母细胞用于流式细胞术分析。在15 mL圆锥形离心管中加入12 mL PBS和12 μL 20 mg/mL环己酰亚胺，涡旋振荡5秒。</li>
	<li>使用多通道移液器将100 μL溶液分装至96孔圆底板的每个孔中。</li>
	<li>用铝箔包裹该板以避光，于4 °C保存直至使用。</li>
	<li>取样时，使用加长型200 μL吸头通过小瓶盖上的取样孔进行移液操作。</li>
	<li>将100 μL样品从小瓶转移至固定板的孔中，上下吹打混匀2–3次，然后重新用铝箔包裹，并将板放回4 °C保存。</li>
</ol>
6. 实验分解与清理
<ol>
	<li>在大烧杯中配制1 L的10%次氯酸钠溶液和两份500 mL的去离子水溶液。</li>
	<li>通过实验管理面板发送停止指令以结束实验。数据仍会存储在支持云功能的数据库中，之后仍可在仪表板的实时数据面板中查看，或下载用于离线分析。</li>
	<li>将小瓶从智能套筒中取出，并放入高压灭菌架中，以避免后续步骤中发生溢出。</li>
	<li>将培养基进液管路从培养基瓶上拧下，并插入盛有10%次氯酸钠溶液的烧杯中。通过eVOLVER用户界面像初始设置时一样运行泵，以对管路和小瓶进行灭菌。</li>
	<li>将管路从小瓶上断开，并将管路浸入去离子水中。先用去离子水运行泵以冲洗系统中所有次氯酸钠，再用空气冲洗。</li>
	<li>关闭eVOLVER电源时，先关闭12 V电源，等待5秒，然后关闭5 V电源。</li>
	<li>将搅拌子和瓶盖浸泡在10%次氯酸钠溶液中，然后用去离子水冲洗。务必通过向每个瓶盖的进液和出液吸管中通入去离子水进行彻底冲洗。若瓶壁形成膜状物，使用试管刷清洗小瓶。</li>
	<li>妥善处理废弃物，并彻底冲洗废液容器。 
	注意：废液容器中含有10%次氯酸钠、灭菌后的细胞培养废弃物以及微量乙醇。请咨询安全负责人以获取正确的处理和处置方法。</li>
</ol>
7. 使用流式细胞术分析组分群体以量化适合度
<ol>
	<li>使用配备适当荧光通道和检测器的流式细胞仪分析第5节收集的样品16。</li>
	<li>每份样品至少采集10,000个事件，并根据前向散射和侧向散射数据设门以筛选完整细胞。</li>
	<li>根据适当的荧光通道（例如GFP）设门，以确定各细胞群体的比例分布。</li>
	<li>在计算机上，通过点击“导出”按钮，从实验管理页面将数据保存至指定位置。</li>
	<li>从eVOLVER数据文件中确定每个时间点各小瓶完成的世代数。在eVOLVER代码中，世代数的计算方法是：首先将OD数据在每次稀释事件之间进行分段，然后对每一段数据拟合形式为 <img alt="指数生长公式，ae^(rt)，数学方程。" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> 的基本指数函数，得到生长速率r16。随后使用以下公式计算某一时间段内的世代数： 
	<img alt="种群增长计算公式；方程；教育用途。" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 2"></li>
	<li>绘制流式细胞术数据中标记群体与未标记群体的对数比值相对于上述计算所得世代数的关系图（以取样时间点为准）。识别线性区域，并根据以下方程拟合斜率。该斜率通常定义为竞争性适合度18,19。 
	<img alt="微生物生长比较方程；公式：ln(变异株%/参考株%)=斜率*世代数+截距" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 3"></li>
</ol>

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作者 Brandon G. Wong 和 Ahmad S. Khalil 是 Fynch Bioscience 公司的联合创始人，该公司开发了本文所使用的 eVOLVER 平台。

生长筛选是生物学中不可或缺的工具，广泛用于产生和表征细胞群体之间的表型差异。尽管分批培养在一定程度上允许进行生长筛选，但连续培养技术通过精确调控选择的形式和动态过程，显著提高了实验的可控性和可预测性，从而获得可重复且定量的结果22。连续培养已被用于严格控制高多样性文库的筛选20,23,24,25，以及在实验性进化和定向进化中实施复杂的适应性策略11,12,26,27。此外，连续培养还能够在一系列定量可控的条件下对细胞进行精确表征，有助于深入理解复杂的遗传系统，并优化工程化生物生产菌株9,14,28。
然而，连续培养尚无通用的实验方案，因为选择条件的细微变化可能导致生物学结果的巨大差异4,29,30。实验人员必须能够在不同的选择模式之间进行选择，并相应地调整实验方案和设备。除了提供控制参数的选择外，理想情况下，此类系统还应具备足够的复杂性，以&#160;在高度并行的实验中独立同时管理多个参数，从而解析复杂生物系统中相互作用的输入信号（例如上位性）。eVOLVER 通过允许用户任意编程培养条件与流体功能之间的反馈控制，实现了对高度特化环境生态位的精确设定。
为了克服当前装置的局限性并扩展或改变控制参数，可轻松重新设计智能套筒以添加新的传感器或执行器。此外，减小小瓶体积可降低培养基消耗，这在连续培养中具有显著的经济意义。尽管当前设计能够测量和控制温度、培养物振荡、光诱导、浊度以及流体操作，但其他参数仍需通过从小瓶取样并在外部进行测量。目前的研究工作包括通过荧光素酶监测酶活性的能力，以及在 eVOLVER 培养中直接调控溶解氧和 pH 值。此外，尽管本研究未予展示，eVOLVER 可与新型毫流控多路复用装置16相连接，这些装置借鉴了大规模集成原理（源自电子学并被微流控技术所采用），从而以较低成本实现更复杂的流体操作（例如多路流体输入、小瓶间转移）。这些湿件模块可在实验室内完全自主设计和制造，使用户能够通过编程控制不同阀门组合，在自动化的流体程序中实现流体通路的灵活调控。这不仅使用户能够突破传统连续培养中固定的流体设计限制，还能以较少的昂贵控制元件（例如蠕动泵）将流体操作能力扩展至高通量水平。最后，我们希望整合一个自动取样平台，该平台将利用这些毫流控组件和 DIY 部件，克服在较长时间和较大规模实验中因频繁取样而带来的操作繁琐问题。
除了对平台进行物理改造外，基于网络的软件还通过允许用户编写、编辑和共享自定义的 eVOLVER 脚本，开辟了新的自由度，从而生成完全自动化、具备反馈功能的培养程序（例如浊度恒化培养）。用户可通过编程方式在相同筛选方案的细微变化中系统性地扫描参数范围，或将控制算法以新颖的组合方式进行连接，以定义任意数量的复杂筛选方案。此外，能够轻松实现实时监测，彻底改变了实验的进行方式。通过实时监测，用户可以：1）检查不同实验运行之间的一致性，这对于生物生产应用和高通量实验至关重要；2）在必要时对实验进行干预，以排查生长不良或形成生物膜等困难菌株的问题，或诊断用户操作错误（例如污染）。最后，由于对每个独立培养体系同时采集并实时解析多个数据流，eVOLVER 产生了高密度的数据，这可能有助于采用机器学习方法进行新颖的下游分析。
除了在适合度表征、文库筛选和实验室进化中已证明的应用外，我们认为多个相关领域也适合在集成流体系统的 eVOLVER 平台上实现。利用微生物组样本开展的 eVOLVER 实验，可在受控环境中检测群落稳定性31,32，使用培养组学技术探索微生物群组成33，或动态混合不同物种以研究定植或入侵过程中的生态动力学34,35。许多用于生物分子连续定向进化的技术也可轻松在该设备上实现26,36,37，从而显著提升这些系统的可及性和通量。以动态、高通量的方式优化培养条件（如培养基成分、温度和菌株）有助于工业生物制造应用中的优化工作9。我们进一步设想将 eVOLVER 与显微镜和流式细胞术等其他分析技术以闭环方式垂直整合，从而构建一个在单细胞和群体水平上均可实现细胞培养生长与分析的全自动系统。此外，通过对 Smart Sleeve 进行一些硬件改造（例如密封反应容器并控制气体成分），eVOLVER 有望适应更广泛类型的细胞培养，例如悬浮培养的哺乳动物细胞。将整个系统置于厌氧环境中以支持厌氧细胞培养也是可行的。展望未来，我们计划将软件框架构建为集中式的云基础设施，相信这将使用户能够远程轻松配置、分析和共享实验数据，而无需亲自在实验室现场操作。该云基础设施作为数据管理平台，还将支持跨实验的大规模元分析。我们预计，eVOLVER 及这些未来的技术进步将通过促进连续培养中的自动化与创新，极大拓展生长筛选实验的可能范围。

连续细胞培养技术最早于近70年前开发1,2，近年来正经历复兴3,4。这一趋势源于多种因素的共同作用。首先，高通量组学技术的发展使得大量基因型的读取和生成成为可能5,6，从而相应地催生了对能够实现良好控制的细胞生长和表型分析实验技术的需求。为此，连续培养成为充分利用新兴基因组学进展的一种强大实验手段。通过在精确控制（且动态）的环境条件下对细胞群体进行生长筛选或实验，连续培养为严格地将基因型与表型关联提供了途径7,8，可用于定量表征工程化菌株和生物体9，并在实验室进化研究中追踪适应性遗传变化10,11,12。
其次，近年来出现的易于使用的原型技术（如增材制造以及开源硬件和软件组件）使得更广泛的用户能够在实验室中直接设计和构建成本效益高的连续培养系统。这些技术的发展催生了一系列能够实现连续培养功能的自制（DIY）设备，例如恒化器13、浊度恒定器14或病态恒定器15。然而，尽管这些临时解决方案在解决其特定（小众）设计问题方面取得了成功，但通常缺乏在通量和/或实验设计复杂性方面进行扩展的能力。
eVOLVER 系统的设计目标是创建一个单一平台，能够满足连续培养日益增长的实验需求，并与新兴基因组技术的速度和规模相匹配16（图 1A）。eVOLVER 的设计借鉴了其他学科中高度可扩展技术所共有的基本原则17，包括标准化的尺寸规格、模块化组件以及开源设计理念。因此，针对新的特定应用需求，可以在无需对系统进行重大修改的情况下设计出相应的解决方案。eVOLVER 由高度模块化且开源的湿件、硬件、电子元件以及基于网络的软件组成，是首个可低成本、便捷地重新配置以执行几乎所有类型高通量生长实验的自动化连续培养系统。通过模块化且可编程的智能套管（Smart Sleeves），该系统集成了控制每个独立培养所需的所有传感器和执行器，从而独特地实现了通量扩展以及对培养条件的独立控制。此外，作为一个基于网络的平台，eVOLVER 能够与远程计算机实时交换数据和信息，允许同时监测数百个独立培养体系，并通过任意定义的控制算法实现自动化的培养扰动。
在先前的研究中16，eVOLVER 系统的稳健性能已在持续数百小时的长期实验中得到验证，并展示了其培养多种生物体的能力，范围从 E. coli 和 S. cerevisiae 到未驯化的微生物。研究人员开展了一系列不同的生长选择实验，通过在多个独立培养条件下施加程序化定义的多维选择梯度，并对由此产生的细胞适应性景观进行量化。本文旨在为 eVOLVER 用户提供使用该系统设计和实施此类实验的详细说明。作为示例，本文介绍了在由温度和渗透压胁迫构成的二维环境梯度下，对 S. cerevisiae 突变体适应性景观进行量化的实验方法。本实验方案将指导用户从程序和物理两个层面完成 eVOLVER 系统的配置：在程序层面，通过软件为 16 个并行连续培养体系分别设置自定义的浊度和温度控制程序；在物理层面，通过流体通路布局合理引导不同盐浓度的培养基。本方案可作为通用指南，用于配置 eVOLVER 系统，以开展适用于多种研究领域和学科的自动化连续培养实验。

<table><tbody><tr><td>5 加仑带盖塑料桶</td><td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td><td>45-56Y8-E2FR</td><td>用于废液收集</td></tr><tr><td>a-D(+)-葡萄糖</td><td>Chem-Impex</td><td>00805</td><td>用于YPD培养基</td></tr><tr><td>Attune NxT 自动进样器</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>使流式细胞仪能够从96孔板中运行样品</td></tr><tr><td>Attune NxT 流式细胞仪</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>用于通过单细胞荧光检测确定群体比例</td></tr><tr><td>蛋白胨（Bacto Peptone）</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-0</td><td>用于YPD培养基</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648250</td><td>用于YPD培养基</td></tr><tr><td>耐化学腐蚀带凸缘管接头三通连接器，适用于1/8&quot;管内径，最高耐温250&amp;deg;F</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K731</td><td>用于培养基输入管路分支</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>用于YPD培养基</td></tr><tr><td>CLOROX 杀菌漂白剂 8.25</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td>用于流体管路的灭菌</td></tr><tr><td>定制eVOLVER瓶盖</td><td>FynchBio</td><td></td><td>盖子设有取样及流体输入/输出端口</td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10018301</td><td>用于流式细胞术取样板</td></tr><tr><td>无水乙醇（组织学级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405P-4</td><td>用于流体管路的灭菌</td></tr><tr><td>eVOLVER装置</td><td>FynchBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 长柄移液器吸头（可弹出架；1至200 µL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-420</td><td>用于瓶内取样</td></tr><tr><td>Fisherbrand 八角形可重复使用磁力搅拌子</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57</td><td>直径：4.5 mm，长度：12 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand 可重复使用带盖玻璃培养基瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB8002000</td><td>必须连接管路使用</td></tr><tr><td>耐高温半透明白色硅橡胶管，硬度70A，内径1/8&quot;，外径1/4&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>51135K73</td><td>用于培养基瓶</td></tr><tr><td>Mac Mini</td><td>Apple</td><td></td><td>用于运行实验/采集数据</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP243820</td><td>用于流式细胞术取样板</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料快接式管接头（堵头），适用于1/16&quot;凸缘管内径，聚丙烯材质</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K141</td><td>用于培养基瓶</td></tr><tr><td>塑料快接式管接头（堵头），适用于5/32&quot;凸缘管内径，聚丙烯材质</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K144</td><td>用于培养基瓶</td></tr><tr><td>塑料快接式管接头（插座），适用于1/16&quot;凸缘管内径，聚丙烯材质</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K291</td><td>用于培养基瓶</td></tr><tr><td>塑料快接式管接头（插座），适用于5/32&quot;凸缘管内径，聚丙烯材质</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K294</td><td>用于培养基瓶</td></tr><tr><td>螺口盖，敞口型，带聚四氟乙烯覆面硅胶隔垫，LAB-PAC隔垫。螺纹尺寸：24-400，绿色</td><td>Chemglass</td><td>CG-4910-04</td><td>培养小瓶</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>用于YPD培养基</td></tr><tr><td>SpectraMax M5 多功能微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>用于测定过夜培养细胞的OD600</td></tr><tr><td>仅小瓶，样品瓶，40 mL，透明，28 mm × 95 mm，GPI 24-400</td><td>Chemglass</td><td>CG-4902-08</td><td>培养小瓶</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>用于YPD培养基</td></tr></tbody></table>

使用 evolver 设计自动化、高通量、连续细胞培养实验

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

连续培养方法能够在定量可控的环境条件下培养细胞，因此在测量适合度表型以及加深对基因型如何受选择作用塑造的理解方面具有广泛的应用价值。近年来，大量研究致力于开发和应用特定生态位的连续培养装置，揭示了开展新型细胞培养控制的优势，包括定义自定义选择压力，以及提高从长期实验进化到全基因组文库筛选和合成基因回路表征等各类研究的通量。为满足这一日益增长的需求，eVOLVER 平台应运而生：这是一种具有高度可扩展性、灵活性和自动化程度的连续培养平台。eVOLVER 提供了一个标准化的统一平台，可轻松重新配置和扩展，以执行多种类型的高通量或多维度生长选择实验。本文提供了一项实验方案，旨在为 eVOLVER 框架的使用者描述如何配置系统以开展自定义的大规模连续生长实验。具体而言，该方案指导用户如何通过编程，在多个 eVOLVER 样品瓶中复用两种选择压力——温度和渗透压，从而以高分辨率量化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）突变体的适合度景观。我们展示了如何通过其开源的基于网页的软件从程序上配置设备，以及如何通过调整流体和硬件布局从物理上进行配置。文中详细说明了设备的物理搭建过程、培养程序的编写、通过互联网实时监控和交互实验、采集样品瓶用于后续离线分析，以及实验后的数据分析流程。本方案可为来自不同学科领域的研究人员提供一个起点，帮助其利用 eVOLVER 设计复杂的高通量细胞生长实验，以研究和操控生物系统。

此处描述的方案用于构建遗传变异的适合度图谱 S. cerevisiae 在温度和盐度构成的二维胁迫梯度下。具体而言，针对每种变异菌株，我们利用eVOLVER系统与其荧光标记的参考菌株进行成对竞争实验（S. cerevisiae 菌株BY4741整合了组成型表达的mNeonGreen报告基因）在16种不同胁迫组合条件下（图1）。对于变异株，分别选择两种敲除菌株，每种预计对某一胁迫条件轴敏感： ΔPRX1 据报道在高温下具有适应性缺陷20 和 ΔPBS2 在高盐浓度下存在适合度缺陷21作为对照变体，使用了未标记的野生型BY4741菌株，预期其表现与参考菌株相似。总共三项72小时竞争实验在同一时间内于48个瓶中进行，实验分布在三台eVOLVER（16瓶）装置上，均由一台计算机控制运行。
eVOLVER 交互式仪表板用于浏览每次实验生成的大量数据（图 2A）。图 2B 展示了单个 eVOLVER 设备全部 16 个样品瓶的代表性光密度（OD）曲线。每条曲线均呈现出浊度反馈控制算法所产生的典型锯齿状模式，该算法通过监测 OD 值来触发稀释操作，从而将培养物维持在较窄的密度范围（本例中为 0.2–0.3）。OD 和温度数据被持续测量，实时传输至云端数据库，并在 eVOLVER 交互式仪表板中同步更新。基于连续传输的数据，可在仪表板中计算并绘制更高层级的指标（例如生长速率、累积代数）（图 2C），甚至可将这些指标作为不同筛选策略（例如病态恒化器，morbidostat）中的反馈参数使用。
为了生成适应性图谱，我们通过整合流式细胞术测量结果和eVOLVER生长数据，测量参考菌株对变异菌株的竞争速率。具体而言，利用每个时间点样本的流式细胞术数据，将变异菌株与参考菌株的比值取对数，计算出种群比例。对于每种培养物和每个时间点，从每次稀释周期内的eVOLVER生长速率数据中插值得到已历的世代数。将对数比值对世代数作图，不同条件之间的定性差异开始显现（图3A）。为了计算适应性，对每条曲线的线性部分拟合斜率18,19，得到一个定量的适应性值（包含符号和速率），用于描述变异菌株相对于参考菌株的竞争能力（图3B）。在本实验中，负的适应性值表示变异菌株被参考菌株所淘汰。将所有适应性计算结果构建成热图，可直观展示二维适应性景观，揭示不同菌株和条件下性能的细微定量差异（图3C）。
从适合度热图中可以看出，每种变异菌株均表现出以不同方式呈现的适合度缺陷。ΔPRX1 主要对高温敏感，但盐胁迫似乎具有叠加效应，会加剧其适合度缺陷。相反，ΔPBS2 的适合度缺陷主要体现在对高盐浓度的响应上，在温度梯度上的差异则极小。这些结果凸显了高分辨率筛选实验在解析多种环境胁迫因素相互作用方面的实用性，这些相互作用可能表现为叠加、协同或上位效应。
最后需要指出的是，在某些情况下，特别是对于严重的胁迫条件，适合度计算可能会导致结果被夸大或出现偏差。例如，在39 °C/1 M NaCl条件下，ΔPBS2相对于参考菌株表现出明显的正斜率（图3A）。这归因于两种菌株的生长均较差，这一情况在野生型数据中有所体现，并限制了该指标在此条件下的适用性。代数不足会导致：1）时间点之间分离不充分，干扰斜率拟合；2）对源自滞后期的随机效应更为敏感。尽管本研究未采取此做法，但实验过程中eVOLVER收集的实时生长数据本可用于判断是否应延长实验时间，并轻松地为该条件补充额外的时间点数据。在后续实验中，也可调节初始接种比例，以延长线性增长阶段在达到饱和前的持续时间。
 
<img alt="eVOLVER 生物反应器装置；实验参数分析示意图；光密度胁迫图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：eVOLVER 系统框架与实验设计概览。（A）eVOLVER 是一种自动化连续培养平台，可对培养条件进行多参数控制。该平台包括智能套筒（Smart Sleeves），其内部集成了用于监测和调控培养条件的传感器与执行器；一组蠕动泵，用于向培养体系中输入培养基并排出废液；一个触摸屏，用于手动操作设备；以及一台计算机，用于与云基础设施交互，实时接收来自平台的数据流。（B）eVOLVER 可通过多种方式进行配置：物理层面通过细胞和培养基输入进行设置，程序层面则通过调整控制智能套筒培养管模块的算法实现。该系统可用于构建高分辨率的多维选择/环境梯度，输出结果包括在特定时间点采集的实体细胞样本以及实时传输的培养数据。（C）将 eVOLVER 配置为在由温度和渗透压胁迫构成的二维选择梯度下开展生长适合度实验。各培养管中接种等比例的参考菌株与变异酵母菌株。设定浊度恒化程序，使所有培养体系维持在指数生长期的特定光密度范围内（OD 0.2–0.3）。通过调节智能套筒阵列的温度和培养基条件，形成两个独立的胁迫梯度。基础培养基成分为 YPD（2% 葡萄糖）+ 100 µg/mL 羧苄青霉素 + 25 µg/mL 氯霉素，以预防细菌污染。通过添加不同浓度的 NaCl 调节培养基，使其终浓度分别为 0 M、0.6 M、0.8 M 或 1.0 M。培养管温度设定为四个水平之一：30 °C、35 °C、37 °C 或 39 °C。（D）三种测试条件下培养物光密度（OD）和种群比例的原始输出示例。竞争实验持续 72 小时，于 24 小时取样，之后每 12 小时取样一次，直至实验结束。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="云端数据处理系统；实时可视化；生长速率分析；温度效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：eVOLVER 实时数据分析仪表盘。（A）eVOLVER 数据通过基于云的软件进行实时处理并传输至交互式仪表盘。用户可通过该仪表盘在连接的 eVOLVER 设备上定义并启动自定义培养程序，监控所有 eVOLVER 单元上正在进行的实验，并根据需要手动调整单个或一组试管中的实验条件。（B）在整个实验过程中，针对所测试条件矩阵中每个试管的光密度（OD）变化轨迹。这些轨迹可实时查看，以确保实验按预期运行，并可在实验结束后用于进一步分析。（C）可实时根据 OD 轨迹计算生长速率和细胞代数，以追踪实验进展。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长动态；对数比例与代数关系；适合度指标计算；适合度曲面图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图 3： 适合度曲面的构建。（A）细胞群体比例的自然对数（变异株/参考株）随细胞代数的变化曲线。颜色表示选择温度，虚线用于区分不同的盐浓度。（B）为量化变异株相对于参考株的相对适合度，采用细胞群体比例随代数变化的速率来推导适合度指标。该指标通过细胞比例曲线的线性区域至少三个数据点进行计算。（C）相对适合度指标以热图形式展示，从而在环境胁迫梯度上构建出适合度曲面。野生型和ΔPBS2在右上角条件（39 °C/1.0 M NaCl）下的数据未纳入本分析，因为培养物经历的代数不足（见代表性结果）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

eVOLVER 平台能够实现高通量、连续的微生物培养，对实验参数进行高分辨率和动态控制。本实验方案演示了如何利用该系统开展复杂的适应性实验，指导用户对多个独立培养体系进行自动化控制编程，并实时测量、采集和交互处理实验数据。

使用 eVOLVER 设计自动化、高通量、连续细胞培养实验

连续培养方法能够使细胞在定量可控的环境条件下生长，因此在测量……方面具有广泛的应用价值。

eVOLVER 为研究人员提供了实验自由，能够自主定义培养生长实验，通过多个参数的自动反馈进行调控，并可根据需要扩展至任意规模。eVOLVER 比其他设备更具灵活性。用户可轻松使用 Python 自定义软件，也可通过修改用于容纳各培养物传感器的智能套管来自定义硬件。该系统乍一看可能显得较为复杂，包含多个组件和连接。可视化指南能够帮助初次使用者更有信心地独立开展实验。正确的设置至关重要。务必了解每个组件的功能，以便确认它们能否正常工作。确保所有线路正确连接且接头紧固。尽管 eVOLVER 的设计主要用于在不同条件下对细菌和酵母进行好氧培养，但它也可经改造用于厌氧发酵或维持悬浮状态的哺乳动物细胞。本视频将演示如何使用 eVOLVER 平台设置、初始化并运行高通量连续培养实验。实验前一天，根据论文所述准备培养基、小瓶和接种物。在三个大烧杯中，准备两杯10%次氯酸钠溶液和一杯70%乙醇溶液。使用eVOLVER设备上的开关，先打开eVOLVER的5伏电源，等待5秒后，再打开12伏电源。若从同一瓶培养基中为多个小瓶供液，请使用管路分路器连接多条培养基输入管路。可使用较少的组件构建定制的管路分流器。将培养基输入管路浸入第一个漂白剂烧杯中，将培养基流出管路浸入第二个漂白剂烧杯中。将培养基输入管路的下游端与第二个烧杯中的流出管路连接。将废液管放入废液桶中。向废液桶中加入一到两升次氯酸钠溶液，以对实验过程中产生的废液进行灭菌。通过 eVOLVER 上的触摸屏进入设置部分，运行所有泵 20 秒，使 10% 次氯酸钠溶液充满流体管路。让漂白剂在管路中停留至少30分钟以达到灭菌效果。再次使用触摸屏运行泵，直至管路不再浸没，通过管路推动空气，尽可能排出漂白剂。将培养基输入管路放入盛有乙醇的烧杯中，用乙醇充满管路，再用空气冲洗管路。然后，使用较低位置的连接器将培养基输入管路连接到培养基瓶，并运行泵，直到培养基完全流经管路，以冲洗掉残留的乙醇。将已灭菌的样品管部分插入 eVOLVER 智能套管中，并根据颜色编码，将输入管路连接到较短的进液吸管，将废液管路连接到较长的出液吸管。在 eVOLVER 触摸屏上进行设置，以10秒为间隔依次运行所有泵，使培养基充满样品管。通过目视检查，确保外流泵正通过外流吸管有效排出培养基，以防止溢出。然后，将小瓶向下推，直至完全被智能套筒包裹。在 eVOLVER 触摸屏交互设置页面上，用手指滑动触摸屏或按下“全选”按钮以选中所有小瓶，并将初始条件设置为温度 30 摄氏度、搅拌速度 10。在计算机上指定将要运行实验的 eVOLVER 设备。确保已选择所需的校准设置。打开 eVOLVER 控制面板并导航至实验管理页面。在实验导航面板中选择基础实验或一个已有实验作为起点，然后点击克隆。进入实验编辑页面。使用试管选择器和参数定义面板，根据实验设计将温度调整为30摄氏度，并为每个试管设置光密度（OD）的上限和下限阈值。单击“保存”以保存实验。然后单击箭头返回实验管理器页面，再单击“播放”按钮以运行实验。实验开始后，请转至交互式仪表板中的实时数据面板。对于每个试管，检查 OD 值是否保持在零。浏览温度曲线图，确认温度已达到或正趋近于 30 摄氏度。为制备接种物，首先测定过夜培养物的 OD 值，并根据试管体积为 25 毫升、目标起始 OD 值约为 0.05 的条件，计算过夜培养物所需的目标完全稀释倍数。通过取样口，用移液器加入计算好的接种物体积或多种接种物的混合液。查看仪表盘上的图表，确认光密度（OD）正在上升至0.05。在实验进行过程中，可实时监测细胞生长情况和小瓶内的培养条件，以便研究人员在出现问题时及时干预。eVOLVER 是一种可自动控制培养条件多参数的连续培养平台。当根据 eVOLVER 生长速率数据将对数比值与世代数进行绘图时，野生型、温度敏感型和盐敏感型组别之间显示出定性差异。颜色表示筛选温度，而虚线用于区分盐浓度。利用每个图中线性部分至少三个数据点进行斜率拟合，可得到描述变异菌株相对于参考菌株竞争能力的定量适应度值。负的适应度值表明变异菌株被参考菌株所淘汰。务必检查所有泵是否高效运行，并确保流体管路无任何堵塞。溢流可能破坏实验，并可能损坏智能套管。可对从 eVOLVER 中采集的样品进行后续测序，以检测实验引起的基因组改变。该信息可用于设计新的菌株或系统。对于使用实验室进化或文库筛选的研究人员而言，在每次 eVOLVER 实验中施加独特的筛选压力非常简便。反馈控制和动态环境现在也易于实现。实验结束后，废液瓶中将含有少量次氯酸钠和乙醇。请咨询实验室安全负责人，以妥善处理废弃物。

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