Name: 用于长期无细胞基因表达传导的多层微流体平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 了解用于长期无细胞基因表达的多层微流体平台制作方法。该PDMS装置通过温控系统实现GFP等蛋白的持续表达，为合成生物学研究提供高效可控的实验平台。

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本工作得到了欧洲研究理事会（ERC）（项目编号 677313 BioCircuit）、荷兰科学研究组织（NWO）的 NWO-VIDI 资助（NWO，723.016.003）、荷兰教育、文化和科学部（引力计划，024.001.035 ＆ 024.003.013）、人类前沿科学计划（Human Frontier Science Program）资助 RGP0032/2015、欧盟“地平线 2020”研究与创新计划下的欧洲研究理事会资助 723106，以及瑞士国家科学基金会资助 200021_182019 的支持。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

已展示一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的多层微流控装置，并证明了其能够长时间维持体外转录翻译（IVTT）反应。尽管该技术特别适用于此具体示例，但理论上还可用于众多其他应用。对流体流动的额外控制，结合持续补充反应试剂并同时去除反应产物（或副产物）的能力，使其非常适用于连续合成反应、多种动态行为的研究，以及同一反应的多个不同条件的并行开展。
尽管基于PDMS的器件制备过程相对简单，但其使用需要复杂的硬件系统，包括阀阵列、压力调节器、压力泵、培养箱和冷却装置。从制备到实际应用的过渡并非易事，且需要较大的初期投入。此外，要稳定地搭建系统并成功开展实验，还需投入大量时间；本文旨在解决这一问题。然而，一旦系统建立，整个装置可根据不同需求进行调整。此外，该硬件系统包含多个模块化组件，每个组件均可扩展，从而支持更复杂的微流控器件设计。同时，模块化设计还允许用户用功能相似的替代组件替换原有硬件，因此使用者并不局限于本文所描述的具体配置48,49。
不同设备之间以及外部条件（如压力波动）的差异可能导致使用这些设备进行实验时产生误差。为解决此问题，每次实验前应对系统进行校准，为每个反应器提供一个独特的Refresh Ratio。尽管校准能够补偿设备间及实验间的差异，但该过程耗时且并非完全精确。当不同黏度的流体在相同压力下暴露时，其流动速率并不相同，因此使用多种试剂进行校准时可能无法获得相同的Refresh Ratios。 通过采用三个控制通道以蠕动泵方式将试剂泵入微流控装置，而非仅通过调节供压来控制流速，可在一定程度上减弱这一影响。在试剂黏度差异极大的极端情况下，作为最后手段，可通过开展多次校准实验，为每种试剂单独设定相应的Refresh Ratio。
使用蠕动泵将试剂注入微流控装置可减弱因使用不同黏度溶液而产生的影响，但同时也会引发另一个问题。由于采用离散的步骤将流体泵入微流控装置，导致向单个反应器中注入试剂的分辨率受限于单次泵送循环所注入的体积。在本研究中，该值在标定过程中确定，约为1%，即单次泵送循环可置换约1%的反应器体积（约0.1 nL）。因此，置换30%的反应器体积需要执行30次泵送循环，其中加入23次IVTT反应溶液，仅加入7次DNA或超纯水。尽管该方案足以满足本研究需求，但在尝试添加更多种类的独特试剂、使用更低的更新比例，或向反应器中添加更小体积的单一试剂时，其他实验方案可能会遇到困难。在此类情况下，可调整微流控装置的设计，以提供体积更大的反应器。Niederholtmeyer 等人36已报道了此类设计的一个实例。
关键的是，本文所述装置能够使反应持续较长时间，从而实现稳态的转录和翻译速率。通过定期向反应器中注入新的试剂并移除反应产物（或副产物），可维持反应的持续进行，并监测复杂的动态行为。通过这种方式，构建出一个在某种程度上模拟细胞环境的平台。此外，该平台还可通过调整注入的时间间隔以及注入试剂的具体组成，来探索系统的动态特性。因此，这种多层微流控装置成为表征和优化具有复杂动态行为的新型合成网络的有力工具。

细胞能够利用复杂的动态调控网络来感知并响应其环境1,2。合成生物学领域利用我们对这些网络中天然存在组分的认知，设计可扩展细胞功能的生物系统3,4。相反，通过设计现有回路的简化型合成类似物，或通过正向工程构建具有天然生物学行为的生物系统，也有助于加深我们对调控生命活动的天然网络的理解。这类生物系统的从头设计采用自下而上的策略，以明确定义的生物元件为基础，理性构建新型基因回路或信号通路5,6。将网络的理性设计与具有生物学意义的系统设计相结合，可实现对不同抽象层次的生物调控系统进行深入表征与研究7。
Elowitz 和 Leibler8 以及 Gardner 等人9 的开创性工作首次成功地将合成基因网络引入细胞宿主。在随后的十年中，尽管将合成回路引入细胞仍存在若干局限性7,10,11,12，众多研究人员仍在此前成果的基础上持续推进。理想情况下，合成回路应以模块化的方式引入细胞宿主。然而，细胞环境的复杂性使得这一目标极具挑战性，许多元件和网络的功能高度依赖于具体生物学背景12,13,14。因此，合成网络常常与宿主内源组分发生非预期的相互作用，从而影响合成回路的功能。同样，外源网络的元件也可能抑制宿主的正常生理过程，与宿主竞争共享资源，并影响细胞的生长动力学15,16,17。因此，为了在活体环境中合理设计并预测合成网络的行为，必须建立一个涵盖宿主与回路特异性动态过程的综合模型18。
一种可用于细胞宿主之外的合成网络表征的可行替代方案，是体外转录与翻译（IVTT）技术的应用。作为合成网络的试验平台，反应在包含实现基因表达所需全部组分的溶液中进行19,20,21。通过这种方式，可构建一个具有生物学相关性但属人工的环境，用于测试合成网络22,23,24,25,26,27,28。使用IVTT溶液的一个主要优势在于能够在用户指定的条件下进行反应，研究人员可精确调控每个反应的组分2。此外，无细胞方法能够实现对合成网络的高通量测试，因为它免除了耗时的细胞克隆步骤。因此，连续的设计—构建—测试循环周期显著缩短29,30,31,32。通过采用无细胞克隆技术（如Gibson组装）快速构建新型网络，以及使用线性DNA模板构建网络（与体内测试所需的质粒不同，线性模板可通过聚合酶链式反应（PCR）扩增），可进一步加快设计周期33,34。
批量反应是进行体外转录翻译（IVTT）反应的最简单方法，仅需使用一个反应容器，将所有反应组分混合其中35。此类反应适用于蛋白质表达和基本回路测试，但在研究网络长期动态行为时则显得不足。在批量反应过程中，试剂会逐渐耗尽或发生降解，导致转录和翻译速率持续下降。此外，随着反应进行，副产物不断积累，可能干扰甚至完全抑制网络的正常功能。最终，批量反应器的使用限制了可观测的动态行为，尤其难以实现负调控5,36。
IVTT系统的多功能性支持多种替代方法来实现长时间的IVTT反应，这些方法包括连续流动、基于液滴的方法以及更简单的透析方法2,30,37,38,39,40。微流控装置的应用使用户能够更精确地控制反应过程，同时提高通量并降低成本35,41,42，每种具体方法都有其独特优势。连续流动法可轻松优化以提高表达产量，但难以有效去除特定反应产物，使得对动态行为的研究变得复杂39。尽管基于液滴的微流控系统可用于新型网络的高通量筛选，但由于难以向反应体系持续补充新鲜试剂，这些液滴实际上类似于小体积的批次反应43。基于透析的反应器允许引入新鲜试剂并去除部分反应产物，但RNA分子和较大的蛋白质会在反应器内积累，因其分子过大而无法通过膜孔扩散。此外，维持长时间反应需要消耗大量试剂30,44。2013年，Maerkl等人提出了一种专为长时间IVTT反应设计的多层微流控装置36,45。多层微流控装置的使用可直接控制流体流动，实现流路的重定向以及在装置特定区域对流体的隔离46,47。这些被隔离的区域可作为独立的纳升级反应腔室，用于进行IVTT反应。在单次IVTT反应过程中，通过周期性地向反应器注入新鲜试剂，以补充IVTT组分和DNA模板；同时，等体积的旧反应液被排出，从而清除反应产物。通过这种方式，维持一个非平衡环境，使基础转录和翻译速率保持在稳态，延长IVTT反应的持续时间，并促进丰富的动态行为发生。采用该方法，研究人员能够研究特定电路中各个过程的动力学速率，有助于新型基因网络的正向设计。例如，Niederholtmeyer等人应用此方法对遗传环形振荡器的多个元件进行了表征，并确定了其动力学速率36。在后续研究中，Yelleswarapu等人表明，在批次条件下测定的σ因子28（σ28）的动力学速率不足以描述基于σ28的振荡器的行为，而加入基于流动的数据后显著改善了对网络行为的模型预测22。
本文的目标是提供一种用于制备可进行长期体外转录翻译（IVTT）反应的多层微流控装置的完整方案。此外，本文还将介绍执行长时间IVTT反应所需的所有硬件和软件。微流控装置的驱动——即对其内部流体流动的控制——通过一系列气动阀实现，这些气动阀经由管路直接连接至微流控装置。而气动阀则通过一个自行设计的虚拟控制界面进行调控。微流控装置内的流体流动由商业化的压力调节系统提供的持续压力驱动。IVTT反应通常在29 °C至37 °C之间进行，反应过程中使用显微镜培养箱来调控温度。然而，IVTT混合物在高于4 °C条件下储存时，其活性会逐渐下降。因此，本文将详细阐述所采用的片外冷却系统，该系统用于在将IVTT混合物注入微流控装置前对其进行冷却。总之，本文全面概述了利用微流控流动反应器成功开展长时间IVTT反应所需的操作流程，使其他研究人员能够相对容易地复制该技术。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>VWR</td><td>20063.365</td><td></td></tr><tr><td>AZ 40 XT</td><td>默克股份公司（德国达姆施塔特）</td><td>-</td><td>正性光刻胶</td></tr><tr><td>AZ 726 MIF 显影剂</td><td>默克股份公司（德国达姆施塔特）</td><td>-</td><td>正性光刻胶显影液</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>默克股份公司（德国达姆施塔特）</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>ECN 631-1550</td><td></td></tr><tr><td>mr Dev 600</td><td>Microresist Technology GmbH（德国柏林）</td><td>-</td><td>负性光刻胶显影液</td></tr><tr><td>无硅散热膏</td><td>电路工坊</td><td>CW7270</td><td>导热硅脂</td></tr><tr><td>硅片</td><td>硅材料</td><td>-</td><td>&amp;lt;1-0-0&gt; 取向，100 mm 直径，525 &amp;micro;m 厚度</td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Microchem 公司（美国马萨诸塞州牛顿市）</td><td>-</td><td>负性光刻胶</td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体试剂盒（PDMS）</td><td>陶氏化学公司</td><td>01317318</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4通道数字输入/输出模块</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-504</td><td>8x</td></tr><tr><td>相机镜头</td><td>The Imaging Source</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>压缩接头</td><td>Koolance, Inc.</td><td>FIT-V06X10</td><td>适用于内径6mm、外径10mm的管路接头。4个</td></tr><tr><td>控制器末端模块</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-600</td><td></td></tr><tr><td>连接管路的装置</td><td>圣戈班高性能塑料</td><td>AAD04103</td><td>0.02&quot; ID，0.06&quot; OD，Tygon 管道（ND-100-80）</td></tr><tr><td>设备连接器引脚</td><td>Unimed SA（瑞士洛桑）</td><td>200.010-A</td><td>AISI 304 管材，内径 0.35 mm，外径 0.65 mm，长度 8 mm</td></tr><tr><td>以太网控制器</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-881</td><td></td></tr><tr><td>母头连接器</td><td>Encitech</td><td>DTCK15-DBS-K</td><td>15针母头总线连接器</td></tr><tr><td>液体储库</td><td>Fluigent</td><td>Fluiwell-4C</td><td></td></tr><tr><td>Fluigent 压力控制系统</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-EZ</td><td>0 - 345 mbar</td></tr><tr><td>Hg短弧灯</td><td>Advanced Radiation Corporation</td><td>-</td><td>350W</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Torrey Pines Scientific</td><td>HP61</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 软件</td><td>de Greef 实验室，埃因霍温理工大学</td><td>https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td><td></td></tr><tr><td>液体冷却剂</td><td>Koolance, Inc.</td><td>LIQ-705CL-B</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔接头</td><td>Instech Laboratories, Inc.</td><td>LS23</td><td></td></tr><tr><td>雄性鲁尔接头转卡套式接头</td><td>Cole Parmer</td><td>45505-32</td><td>3/32&quot; ID</td></tr><tr><td>Matlab 软件</td><td>de Greef 实验室，埃因霍温理工大学</td><td>https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td><td></td></tr><tr><td>微型相机</td><td>The Imaging Source</td><td>DMK 42AUC03</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>滨松光子学</td><td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-513000-05</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Heraeus T6P 50045757</td><td></td></tr><tr><td>氧气等离子体灰化器</td><td>Quorum Technologies</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 打孔器</td><td>SYNEO</td><td>Accu-Pucnh MP10</td><td></td></tr><tr><td>PEEK 管</td><td>特拉扬</td><td>1301005001-5F</td><td>0.005&quot; ID，1/32&quot; 光密度，红色</td></tr><tr><td>帕尔帖元件</td><td>欧洲热力学</td><td>APH-127-10-25-S</td><td></td></tr><tr><td>帕尔帖温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>CAD/Art服务有限公司</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>光刻掩模设计</td><td>Maerkl 实验室，洛桑联邦理工学院</td><td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td><td></td></tr><tr><td>气动阀阵列</td><td>FESTO</td><td>-</td><td>1个22阀阵列和1个8阀阵列，常闭型阀门。</td></tr><tr><td>电源适配器</td><td>Koolance, Inc.</td><td>ADT-EX004S</td><td>110/220V 交流电源适配器</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯管</td><td>Cole Parmer</td><td>06417-21</td><td>#24 AWG 薄壁聚四氟乙烯</td></tr><tr><td>冲孔针</td><td>SYNEO</td><td>CR0320245N21R4</td><td>OD：0.032&quot; （0.8128 毫米），内径：0.024&quot; (0.6090 mm)</td></tr><tr><td>PVC管</td><td>Koolance, Inc.</td><td>HOS-06CL</td><td>6 mm 内径，10 mm 外径</td></tr><tr><td>单边刀片</td><td>GEM Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>软管</td><td>Fluigent</td><td>-</td><td>配备流体储液槽（内径 1 mm，外径 3 mm）</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>热敏电阻电缆</td><td>Warner Instruments</td><td>TA-29</td><td>带珠状热敏电阻的电缆</td></tr><tr><td>紫外光暴露系统</td><td>ABM，美国</td><td>-</td><td>近紫外曝光系统，350W</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Vacuumbrand GmbH</td><td>MD1C</td><td></td></tr><tr><td>水冷式冷板模块</td><td>Koolance, Inc.</td><td>PLT-UN40F</td><td></td></tr><tr><td>饮水机</td><td>Koolance, Inc.</td><td>EX2-755</td><td></td></tr><tr><td>体重秤</td><td>赛多利斯</td><td>M-prove</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于持久无细胞基因表达的多层微流控平台

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

随着研究人员致力于开发更大、更复杂的合成基因调控回路，基于细胞的合成生物学的局限性日益显现。在体内对合成基因调控网络进行分析耗时较长，且存在环境控制不足的问题，外源性合成组分与宿主过程相互作用可能导致非预期行为。为克服这些问题，无细胞表征新回路的方法正变得越来越普遍。体外转录与翻译（IVTT）混合体系可实现对实验环境的调控，并能针对每个独特系统进行优化。本文所述方案详细介绍了可用于长期维持IVTT反应的多层微流控装置的制备方法。与反应物随时间消耗、（副）产物不断积累的批处理反应不同，微流控装置的使用可实现反应资源的持续补充以及反应产物的及时清除。通过这种方式，可模拟细胞环境，维持非平衡状态，从而在较长时间内研究基因回路的动态行为。为了充分挖掘多层微流控装置的潜力，已将硬件与软件集成，以实现IVTT反应的自动化。将IVTT反应与本文介绍的微流控平台相结合，可全面分析复杂网络行为，进一步加深我们对调控细胞过程机制的理解。

为了验证多层微流控平台在体外转录翻译（IVTT）实验中的有效性，采用所述装置表达 deGFP 蛋白。实验使用一种 commercially available30 的 IVTT 反应混合物——包含所有必需的转录和翻译组分——并添加了反应底物和 DNA 模板。实验在 29 °C 下进行，该温度被证实为 IVTT 蛋白表达的最适温度。
该微流控装置拥有九个独立的入口，其中四个在本实验中得以使用。第一个入口注入的是市售的体外转录翻译（IVTT）反应混合物。该IVTT反应混合物包含了成功表达蛋白质所需的所有组分，但在加载至微流控装置前，向其中添加了纯化的GamS蛋白，使其终浓度达到1.3 µM。添加GamS蛋白旨在实验过程中最大限度地减少线性DNA的降解。关键的是，IVTT混合物在注入微流控装置前，先被注入盘绕在珀尔帖元件表面的聚四氟乙烯（PTFE）管路中，该元件表面温度为4°C，用以冷却溶液，从而防止反应液在使用前发生降解。采用微孔聚醚醚酮（PEEK）管路连接离开珀尔帖元件表面的PTFE管路与微流控装置，减少了未被冷却的IVTT反应混合物体积。第二个注入装置的溶液是编码deGFP的线性DNA模板，其溶解于超纯水中，浓度为10 nM。第三个溶液，超纯水，在实验过程中具有多种用途。其主要作用是确保所有反应器的每次稀释置换体积相等，在对照反应中作为DNA的替代物。此外，超纯水也用于设备校准期间稀释荧光团，以及在切换试剂时冲洗装置的残留体积。最后注入装置的溶液是纯化的FITC-葡聚糖溶液（25 µM），用于执行初始的设备校准。DNA、水和荧光团溶液被注入管路（内径0.02英寸，外径0.06英寸）中，随后可根据方案第4.2节所述，将该管路插入微流控装置的某个流入通道。因此，这些溶液在整个实验期间均储存于29°C条件下。
微流控装置控制通道的驱动通过定制的控制软件实现，其中每个控制通道均可独立驱动。长时间的体外转录翻译（IVTT）反应无法通过此手动过程完成，必须使用控制软件中集成的自动化协议。在为实验准备微流控装置时，可利用类似的自动化协议执行多项有用的操作：用新试剂冲洗装置的死体积、在环形反应器内混合试剂，以及在向反应器中加载新试剂的同时置换等体积的当前溶液。此外，还提供两种复杂操作：装置校准的实施，以及长时间无细胞蛋白表达的执行。上述所有操作均可通过主界面轻松执行，同时可配置多个参数以调整特定操作的设置，例如流入通道、流入体积和混合时间。
由于压力波动以及微流控装置制造过程中的不完美性，单次注射循环中所置换的液体体积在不同装置之间可能存在差异。因此，在进行体外转录翻译（IVTT）实验之前，需先确定每次注射循环中反应器的置换体积（更新分数）。该校准过程要求将全部八个反应器充满荧光参考溶液，本实验中使用的是纯化的FITC-葡聚糖溶液（25 μM）。随后，用超纯水对反应器进行10倍稀释。通过测量每个反应器在每次稀释循环中荧光强度的下降程度，可计算出单次注射循环所置换的液体体积。在校准软件中，该数值（即更新比率）将被记录下来，供后续IVTT实验使用。关键的是，为了补偿装置内流速的差异以及各个反应器体积的偏差，每个反应器的更新比率均需单独测定并存储。反应器的填充与稀释过程由控制软件中的执行校准程序自动完成。校准实验的结果如图8所示。
最复杂的预设程序可执行长时间的体外转录翻译（IVTT）实验，允许用户启动实验后无需看管，直至实验结束。在整个实验过程中，反应器1和5作为空白对照，仅在稀释时向其中加入水。反应器2和6作为阴性对照，仅包含IVTT反应溶液和超纯水。其余反应器（3、4、7和8）则包含IVTT反应溶液以及2.5 nM编码deGFP基因的线性DNA。反应器的初始化通过将所有反应器（除1和5外）完全充满IVTT反应溶液实现，随后用超纯水置换出25%的反应器体积。此后，开始周期性地向反应器中注入试剂。实验设置为每14.7分钟向反应器注入一次新试剂，每次稀释循环中置换30%的反应器体积。每次注入的试剂组成为：75%为新鲜IVTT溶液，其余25%为DNA或超纯水。每次加入新试剂后，反应器持续混合，随后利用显微镜记录每个反应器的荧光图像。反应连续运行68个循环，总实验时长为16.5小时。该实验结果见图9。
在进行长时间的体外转录翻译（IVTT）实验时，反应失败主要有两个原因：空气进入微流控装置，或IVTT反应溶液发生降解。微流控装置中出现空气通常直接源于流入溶液中存在的微小气泡，这些气泡随后被注入微流控装置中。一旦进入装置，空气的存在会阻碍液体的正常流动，导致反应体系无法周期性更新，从而在反应器环中形成批式反应。在某些情况下，通过反复冲洗试剂可缓慢将空气排出，之后反应可按预期继续进行（如图9所示）。而在其他情况下，空气会持续滞留，只能通过中止实验，并对微流控装置的流体层施加持续（较高）压力来清除，该操作类似于方案第5.1节中描述的填充过程。在实验过程中，细胞裂解液被储存在连接于帕尔贴元件的聚四氟乙烯（PTFE）管路中，并将温度冷却至4 °C。这两项措施均有助于延缓IVTT反应溶液随时间发生的降解：惰性的PTFE管路可最大限度减少管路材料与反应溶液之间的相互作用，低温环境则有助于维持执行IVTT所必需的功能性（生物）分子组分的活性。如果由于冷却不足或反应溶液与储存环境之间发生非预期相互作用而导致反应溶液发生降解，则实验上会表现为蛋白质表达水平随时间逐渐降低。一旦发生降解，IVTT反应溶液无法恢复，必须重新准备新的实验。
<img alt="带压力调节、帕尔贴冷却和流体储液池的显微镜装置；示意图与实验室照片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1. 实现连续体外转录翻译（IVTT）反应所需的硬件装置。A) 硬件装置的示意图。B) 本研究中所用装置的实际照片。实现用于连续 IVTT 反应的多层微流控装置，需要一套复杂的硬件系统，以调节流体压力、驱动控制通道、对反应体系和试剂进行加热与冷却、储存液体，并在实验过程中对装置进行成像。实验在 30 °C 下进行，通过将显微镜置于设定为此温度的培养箱内来实现。为防止 IVTT 反应溶液降解，将其储存在缠绕于帕尔贴元件冷面的聚四氟乙烯（PTFE）管路中。帕尔贴元件的温度设定为 4 °C，并通过水冷器和水冷块维持该温度。无需冷却的试剂则储存在显微镜培养箱外的流体储液池中。这些储液池通过计算机控制的压力调节器施加恒定压力。通过这种方式，液体被推动流经储液池的出口管路，直接连接至微流控装置的进液通道。微流控装置的每个控制通道均连接至一个气动阀。整个阀门阵列处于恒定压力下。打开阀门时，可使气动阀与微流控装置控制通道之间的连接管路中的流体加压，从而实现微流控装置内部聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜的开启与关闭。气动阀通过用户界面控制，由现场总线控制器（图中未示出）指令特定气动阀的开启与关闭。图改编自 Yelleswarapu 等22。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="气动管路示意图；管路连接；气源接口；科学仪器装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2. 气动阀装置及控制通道连接概览。 图示为一个 8 阀阵列，其中阀门 1、2 和 3 已连接三个控制通道。可通过 1/4” 管路向阀阵列供应压缩空气。控制通道的驱动使用两种压力：1 bar 用于低压控制通道（1、2 和 3），3 bar 用于高压控制通道（9 至 30，本图未显示）。管路可填充超纯水，并使用不锈钢连接针插入任一控制通道入口。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="带有压力控制器、储液池、管路、连接件的微流控装置；流体流动调控。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3. 商业化流体压力调节器与储液系统概览。 使用市售的压力调节器将液体注入多层微流控装置的流体层。将压力控制器连接至计算机，可调节用于液体注入的压力。试剂可储存于流体储液池中，该储液池直接连接至压力调节器。对储液池施加压力后，液体通过出口管路被推出。该出口管路可通过不锈钢连接针直接连接至微流控装置的任一液体入口。若试剂体积不足以充满储液池，出口管路可作为试剂的临时储液空间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有帕尔帖元件、热敏电阻电缆、PTFE和PVC管路的微流控冷却系统示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4. 用于冷却反应试剂的冷却系统示意图。（左）独立的冷却装置；（右）置于显微镜内并与微流控装置连接的冷却系统。在将体外转录翻译（IVTT）反应溶液注入微流控装置之前，使用帕尔帖元件对其进行冷却。试剂储存于盘绕在帕尔帖元件冷面的PTFE管路中。采用一段PEEK管路将冷却后的液体输送至微流控装置，其较小的内径（0.005英寸）可最大限度减少脱离冷却区域的试剂体积。在盘绕的PTFE管路旁放置一个热敏电阻，用于实时监测帕尔帖元件表面的温度。调节施加于帕尔帖元件的电压，使其表面温度维持在0 °C至4 °C之间。为散除帕尔帖元件产生的多余热量，将其热面紧贴水冷块，并涂抹不含硅酮的散热膏以确保两接触面之间实现最佳热传导。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控装置示意图；控制层/流体层；芯片集成；芯片实验室应用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 微流控装置设计概览。 用于连续体外转录翻译（IVTT）反应的微流控流动反应器包含八个反应环，每个反应环体积为10.7 nL。九个入口允许九种不同的反应溶液流入装置。24条控制通道用于调节装置内的流体流动。控制通道9至14构成一个多路复用器。这些控制通道应始终保持加压状态，以阻止流体流入装置。同时释放两个控制通道的压力可允许单一试剂流入。控制通道15、16和17用于以受控方式通过蠕动泵将试剂泵入装置。控制通道18至25分别控制装置内八个反应器各自的入口。控制通道26可关闭冲洗通道，从而迫使流体进入反应器。控制通道27有助于反应器的均匀填充。控制通道28和29分别调节环形反应器的出口以及整个装置的唯一出口。最后，控制通道1、2和3用于在环形反应器内通过蠕动泵驱动流体，实现试剂的混合。该微流控装置的设计及本图均改编自Neiderholtmeyer等人的研究29。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示通道内流动控制的微流控装置示意图；A 和 B，50 µm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6. 微流控装置中的基于膜的阀门。A) 微流控装置内的流动通道。背景中可见两条控制通道。这些通道未加压，因此阀门处于开启状态（液体可流动）。B) 与流动层通道相交的两条控制通道已被加压，导致阀门关闭（即液体流动受阻）。当控制通道加压时，分隔流动层与控制层通道的薄 PDMS 膜向上弯曲（控制层位于流动层下方），从而关闭流动层通道。流动层通道的圆角设计对于确保弯曲的膜完全封闭流动通道至关重要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="自动光谱实验界面；控制、序列设置、校准选项、数据输入。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 用于控制微流控装置的用户界面。 在本研究中，使用了定制的控制界面来调控微流控装置内的流体流动。该界面允许用户单独激活各个控制通道（编号为1-3和9-29），或执行复杂的操作流程，以实现试剂的冲洗与加载、微流控装置的校准以及实验的运行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光强度与稀释倍数关系图；反应器更新率与稀释步骤图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig8.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8. 校准实验的结果。 在标定实验过程中，反应器中装入荧光染料（25 µM FITC-葡聚糖）后记录荧光强度。随后进行一系列稀释操作，通过设定固定数量的进液步骤（15步）将超纯水注入反应器。每次稀释后混合试剂并测定荧光强度。每轮稀释中荧光强度的降低值反映了在设定进液步骤下反应器环路被置换的体积；该值称为 刷新率. A八个反应器的平均强度和标准差以红色表示，各个反应器的强度轨迹以灰色显示。 B平均值 刷新率 标准差以红色显示在每个稀释步骤中。各单独的 更新比例 每个反应器的个体情况以灰色显示。可以看出，八个反应器中有七个表现出非常相似的行为，然而其中一个反应器显示出波动 刷新率 第七次稀释循环后。这凸显了独特性的重要性 更新比例 对于每个反应器，而不是使用平均值 刷新率 用于将试剂注入反应器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="deGFP 表达荧光强度图；IVTT、对照组和空白反应器的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig9.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 9"> 
图9. 表达 deGFP 蛋白的 IVTT 实验结果。 启动了一个延长的 IVTT 反应，每 14.6 分钟置换 30% 的反应器体积。反应持续运行超过 16 小时后终止。微流控装置中的两个反应器作为空白对照，整个实验过程中仅有超纯水流经这些反应器（反应器 1 和 5）。其余所有反应器均包含 75% 的 IVTT 反应溶液和 25% 的超纯水（反应器 2 和 6），或 2.5 nM 编码 deGFP 表达的线性 DNA 模板（反应器 3、4、7 和 8）。在所有四个添加了 DNA 的反应器中，均观察到明显的 deGFP 表达。其中三个反应器的荧光强度相似，而一个反应器的荧光信号较低。这可能是由于流速差异导致进入反应器的 DNA 较少，或反应器尺寸存在变异所致。14 小时后，含 DNA 的反应器信号突然升高。这是由于气泡进入微流控装置的流体层所致，可能源自某一进样溶液。气泡在微流控装置中滞留会显著限制流体在通道中的流动，导致在气泡排出前无法向反应器中添加或移除新鲜试剂。当流动恢复后，实验的荧光强度恢复至先前水平。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/Supplemental_Files.zip" target="_blank">请点击此处下载这些文件。</a>

本文描述了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的多层微流控装置的制备过程，该装置可实现体外转录与翻译（IVTT）反应的长期进行。此外，还全面概述了实现并维持这些反应长期自动化的所需硬件与软件。

基于细胞的合成生物学的局限性正随着研究人员致力于开发更大、更复杂的合成基因回路而日益显现……

使用无细胞基因表达系统可显著改进合成基因网络的原型构建。本方案描述了多层微流控反应器的制备过程，并证明该装置可用于延长绿色荧光蛋白（GFP）的无细胞表达。无细胞蛋白质表达与微流控反应器相结合，为合成生物器件的设计提供了快速原型构建平台。整个装置具有高度的通用性，可适用于需要高度控制的任何生化或化学反应。确保无细胞反应溶液的稳定性至关重要，但实现起来较为困难。务必注意提供充分的冷却，并使用本方案中指定的管路。制造和准备实验平台需要连接多个独立组件，若无视觉辅助，该过程可能难以跟进。首先，请参照随附的文字版实验方案，制作微流控装置，并建立气动控制和流体压力调节系统，以控制对该装置至关重要的阀门。为搭建芯片外冷却系统，首先将一段聚四氟乙烯（PTFE）管缠绕在帕尔贴（Peltier）元件的冷面上，并用胶带固定线圈。确保聚四氟乙烯（PTFE）管的一端连接至流体层压力控制系统的储液装置，另一端从帕尔帖元件表面伸出的长度不超过1厘米。接着，将一段5至10厘米长的聚醚醚酮（PEEK）管插入聚四氟乙烯（PTFE）管的伸出端。在帕尔帖元件的热面均匀涂抹适量导热硅脂，然后将其放置于水冷块的冷板上。确保管道、帕尔帖元件和冷却块始终彼此直接接触。接下来，使用串行总线连接器将帕尔帖元件连接到温度控制器，以便调节供给帕尔帖元件的电压。然后，将热敏电阻牢固地放置在帕尔帖元件表面，并将其输出端连接至温度控制器。打开冷水机后，调节供给帕尔贴元件的电压，直至温度稳定在四摄氏度。对于微流控装置的每个控制通道，截取一段一米长的标准管路。在一端插入23号规格、半英寸鲁尔短管的针头，在另一端插入不锈钢连接针。将鲁尔接头连接到一个外径为3/32英寸的鲁尔雄接头尼龙倒刺接头上，并将该接头的倒刺插入一段聚氨酯管中。然后将此聚氨酯管直接插入其中一个电磁阀中。接着，将一个23号规格、半英寸长的鲁尔接头连接到注射器上，并将其插入一段3至4厘米长的标准导管中。将这段管路的开口端放入超纯水储液槽中，并用超纯水充满注射器。按照图示对微流控装置的每个控制通道进行编号。对于第4至第29号通道，找到对应的管路，并将金属针插入连接在注射器上的管路开口端。然后向控制通道管路中注入水，直至填充管路长度的一半。接着，将管路从注射器上断开，并将不锈钢连接针插入微流控装置对应的孔中。对所有控制通道重复此步骤。现在，使用控制界面打开所有电磁阀。这将使控制通道管路中的流体加压，迫使流体进入微流控装置，并关闭装置内所有基于膜的阀门。对于每个无需冷却的试剂，截取一米长的标准管路，将储液罐出口连接至微流控装置的入口。取一段导管，将其插入储液罐中，确保导管到达储液罐底部。应拧紧储液罐的导管出口，以确保形成气密密封。然后，将一根不锈钢连接针插入导管的开口端。接下来，将一个23号半英寸鲁尔接头短管连接到1毫升注射器的末端。在鲁尔接头短管上连接一段标准长度的导管。将导管末端插入所需的试剂溶液中，并用该试剂填充注射器。然后将不锈钢连接针插入连接在注射器上的聚氨酯管路中，并用试剂充满管路。当使用较小反应体积时，试剂不会进入储液池，此时管路本身将作为储液池。操作完成后，断开注射器，并将连接针插入微流控芯片流动层的一个进样孔中。然后使用压力调节软件对每个储液池施加压力，以将试剂注入微流控装置。确保已开启水冷机和珀尔帖元件，并将珀尔帖元件的表面温度设置为4摄氏度。将冷却装置尽可能靠近微流控装置安装，以最大限度减少珀尔帖元件与装置入口之间的未冷却体积。然后将一个1毫升注射器连接至一个带有短段标准管路的23号规格、半英寸鲁尔短接头。吸取待冷却的试剂以充满注射器。接下来，通过连接管路将聚醚醚酮（PEEK）管路与注射器相连，并对注射器施加持续压力，使试剂流经PEEK管路并进入聚四氟乙烯（PTFE）管路中。最后，将PEEK管从注射器上断开，并直接插入微流控装置的流道入口。施加压力时，冷却的试剂将被推入微流控装置。确保微流控装置牢固固定在显微镜载物台上，所有控制层和流体层管路均已连接，并关闭培养箱的所有开口。接下来将培养箱的环境温度设置为 29 摄氏度。然后确保在实验开始前冷却系统已开启，并设置为 4 摄氏度。检查流道压力调节器所施加的压力是否已设置为 800 毫巴，并通过软件将每个独立流道的输出压力设置在 20 至 100 毫巴之间。检查施加至控制通道电磁阀的压力，第1至第8通道应为1 bar，第9至第29通道应为3 bar。接下来，通过加压第29通道关闭装置出口，同时对第1至第3通道及第15至第28控制通道进行卸压。然后选择性地对多路复用器的控制通道进行卸压，以使单一选定的试剂流入装置。使用显微镜监测气泡的去除，并随后确保所有试剂正确流动，避免引入气泡。使用提供的软件包，根据随附的文字实验方案设置与校准过程相关的数据字段。随后通过执行校准程序，确定每次进液步骤中每个反应器排出的液体体积。按照控制软件提供的步骤，完成校准实验的分析，并确定微流控装置中每个环路反应器的刷新率。最后，在虚拟控制界面中设置目标实验所需的参数值。在控制界面中点击“执行实验”按钮，启动实验方案。在标定实验中，反应器被填充一种荧光染料，每次稀释后记录其荧光强度。每次稀释时荧光强度的降低量反映了在设定的流入步数下反应器环路中被置换的体积。该体积称为更新比率。每一步稀释的平均刷新比率及其标准差以红色显示。八个反应器中有七个表现出非常相似的行为，但其中一个反应器在第七次稀释循环后出现波动。这凸显了每个反应器需要设置独特刷新比率的必要性。此处展示的长时间体外转录与翻译反应每 14.6 分钟置换 30% 的反应器体积。微流控装置中的两个反应器作为空白对照。其余所有反应器均包含 75% 的体外转录与翻译反应溶液，以及 25% 的超纯水或 2.5 纳摩尔编码 deGFP 蛋白表达的线性 DNA 模板。在所有四个添加了DNA的反应器中，均观察到明显的去绿色荧光蛋白（deGFP）表达。其中一个反应器显示出较低的荧光信号，这可能是由于流体分布不均导致进入该反应器的DNA量较少，或由于反应器尺寸存在差异所致。14小时后，含有DNA的反应器信号出现突然升高。这是由于气泡进入微流控装置的流动层所致。当流动恢复后，实验信号回到之前的荧光强度水平。除非充分冷却，无细胞反应溶液会随着时间推移而降解，因此本方案中所述的冷却过程至关重要。由于该平台具有高度通用性，可在精确且可控的条件下进行多种生物化学和化学反应。微流控流动反应器的应用已加速了双基因回路原型设计中连续的“设计-构建-测试”循环。

a-multilayer-microfluidic-platform-for-conduction-prolonged-cell-free

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于长期无细胞基因表达传导的多层微流体平台

我们介绍一种用于蛋白质阵列表达的微流控方法。该装置由数千个由微机械阀门控制的反应腔室组成。微流控装置与打印有基因文库的微阵列相结合，这些基因在芯片上进行转录和翻译，从而生成可用于实验的蛋白质阵列。...

基于微流控平台的高通量蛋白质表达仪

我们开发了一种用于微尺度细胞刺激实验的自动化细胞培养与检测平台。该平台在培养和刺激少量细胞群体以及回收裂解液用于分子分析方面，具有操作简便、功能多样和控制精确的优点。该平台非常适合使用珍贵细胞和/或试剂的研究。...

一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

本文介绍了一种在微流控多器官芯片中对原代细胞、组织模型和打孔活检样本进行共培养的实验方案，培养时间可长达28天。人皮肤微血管内皮细胞、肝细胞聚集体和皮肤活检组织已成功在共同培养基循环系统中实现联合培养。...

多器官芯片——一种用于长期多组织共培养的微流控平台

介绍了一种带有可密封飞升级反应腔室的微加工装置。本报告包含一项实验方案，用于在这些腔室内密封无细胞蛋白合成反应物，以研究拥挤效应和空间限域对基因表达作用。...

可密封飞升级微腔阵列用于无细胞生物学

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

单细胞测序可揭示生物系统中的基因型异质性，但现有技术缺乏对群落组成和功能进行深度分析所需的通量。本文介绍了一种微流控工作流程，可用于对来自不同细胞群体的超过&gt;50,000个单细胞基因组进行测序。...

一种用于单细胞基因组测序的超高通量微流控平台

我们描述了一种简单的光刻方法，用于将基因长度的DNA分子固定在表面，该方法可用于在生物芯片上进行无细胞基因表达实验。...

利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

我们介绍了一种微流控芯片上的癌症模型，即"进化加速器"技术，该技术可在明确定义的环境条件下，在单细胞水平上对癌症动态进行长期、实时、定量的可控研究。该技术有望作为基础研究或临床前药物开发的体外模型。...

在微流控进化加速器上生成跨越癌细胞群体的异质性药物梯度以实现实时观察

我们介绍一种用于复杂生命机制高通量研究的微流控系统，该系统包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。该微流控芯片可实现对体内高度复杂且动态变化的微环境条件进行分析。...

利用高通量微流控装置产生动态环境条件

本方案描述了构建一种芯片实验室微流控电穿孔装置所需的微加工技术。该实验装置可在连续流动条件下实现可控的单细胞水平转染，并可通过基于细胞群体的控制进一步扩展至更高通量。文中提供了分析结果，展示了实时电学监测细胞膜通透化程度的能力。...

连续流动微电穿孔系统的构建与操作及其通透性检测

了解用于长期无细胞基因表达的多层微流体平台制作方法。该PDMS装置通过温控系统实现GFP等蛋白的持续表达，为合成生物学研究提供高效可控的实验平台。

一种用于持久无细胞基因表达的多层微流控平台

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