一种用于持久无细胞基因表达的多层微流控平台

使用无细胞基因表达系统可显著改进合成基因网络的原型构建。本方案描述了多层微流控反应器的制备过程，并证明该装置可用于延长绿色荧光蛋白（GFP）的无细胞表达。无细胞蛋白质表达与微流控反应器相结合，为合成生物器件的设计提供了快速原型构建平台。

整个装置具有高度的通用性，可适用于需要高度控制的任何生化或化学反应。确保无细胞反应溶液的稳定性至关重要，但实现起来较为困难。务必注意提供充分的冷却，并使用本方案中指定的管路。

制造和准备实验平台需要连接多个独立组件，若无视觉辅助，该过程可能难以跟进。首先，请参照随附的文字版实验方案，制作微流控装置，并建立气动控制和流体压力调节系统，以控制对该装置至关重要的阀门。为搭建芯片外冷却系统，首先将一段聚四氟乙烯（PTFE）管缠绕在帕尔贴（Peltier）元件的冷面上，并用胶带固定线圈。

确保聚四氟乙烯（PTFE）管的一端连接至流体层压力控制系统的储液装置，另一端从帕尔帖元件表面伸出的长度不超过1厘米。接着，将一段5至10厘米长的聚醚醚酮（PEEK）管插入聚四氟乙烯（PTFE）管的伸出端。在帕尔帖元件的热面均匀涂抹适量导热硅脂，然后将其放置于水冷块的冷板上。

确保管道、帕尔帖元件和冷却块始终彼此直接接触。接下来，使用串行总线连接器将帕尔帖元件连接到温度控制器，以便调节供给帕尔帖元件的电压。然后，将热敏电阻牢固地放置在帕尔帖元件表面，并将其输出端连接至温度控制器。

打开冷水机后，调节供给帕尔贴元件的电压，直至温度稳定在四摄氏度。对于微流控装置的每个控制通道，截取一段一米长的标准管路。在一端插入23号规格、半英寸鲁尔短管的针头，在另一端插入不锈钢连接针。

将鲁尔接头连接到一个外径为3/32英寸的鲁尔雄接头尼龙倒刺接头上，并将该接头的倒刺插入一段聚氨酯管中。然后将此聚氨酯管直接插入其中一个电磁阀中。接着，将一个23号规格、半英寸长的鲁尔接头连接到注射器上，并将其插入一段3至4厘米长的标准导管中。

将这段管路的开口端放入超纯水储液槽中，并用超纯水充满注射器。按照图示对微流控装置的每个控制通道进行编号。对于第4至第29号通道，找到对应的管路，并将金属针插入连接在注射器上的管路开口端。

然后向控制通道管路中注入水，直至填充管路长度的一半。接着，将管路从注射器上断开，并将不锈钢连接针插入微流控装置对应的孔中。对所有控制通道重复此步骤。

现在，使用控制界面打开所有电磁阀。这将使控制通道管路中的流体加压，迫使流体进入微流控装置，并关闭装置内所有基于膜的阀门。对于每个无需冷却的试剂，截取一米长的标准管路，将储液罐出口连接至微流控装置的入口。

取一段导管，将其插入储液罐中，确保导管到达储液罐底部。应拧紧储液罐的导管出口，以确保形成气密密封。然后，将一根不锈钢连接针插入导管的开口端。

接下来，将一个23号半英寸鲁尔接头短管连接到1毫升注射器的末端。在鲁尔接头短管上连接一段标准长度的导管。将导管末端插入所需的试剂溶液中，并用该试剂填充注射器。

然后将不锈钢连接针插入连接在注射器上的聚氨酯管路中，并用试剂充满管路。当使用较小反应体积时，试剂不会进入储液池，此时管路本身将作为储液池。操作完成后，断开注射器，并将连接针插入微流控芯片流动层的一个进样孔中。

然后使用压力调节软件对每个储液池施加压力，以将试剂注入微流控装置。确保已开启水冷机和珀尔帖元件，并将珀尔帖元件的表面温度设置为4摄氏度。将冷却装置尽可能靠近微流控装置安装，以最大限度减少珀尔帖元件与装置入口之间的未冷却体积。

然后将一个1毫升注射器连接至一个带有短段标准管路的23号规格、半英寸鲁尔短接头。吸取待冷却的试剂以充满注射器。接下来，通过连接管路将聚醚醚酮（PEEK）管路与注射器相连，并对注射器施加持续压力，使试剂流经PEEK管路并进入聚四氟乙烯（PTFE）管路中。

最后，将PEEK管从注射器上断开，并直接插入微流控装置的流道入口。施加压力时，冷却的试剂将被推入微流控装置。确保微流控装置牢固固定在显微镜载物台上，所有控制层和流体层管路均已连接，并关闭培养箱的所有开口。

接下来将培养箱的环境温度设置为 29 摄氏度。然后确保在实验开始前冷却系统已开启，并设置为 4 摄氏度。检查流道压力调节器所施加的压力是否已设置为 800 毫巴，并通过软件将每个独立流道的输出压力设置在 20 至 100 毫巴之间。

检查施加至控制通道电磁阀的压力，第1至第8通道应为1 bar，第9至第29通道应为3 bar。接下来，通过加压第29通道关闭装置出口，同时对第1至第3通道及第15至第28控制通道进行卸压。然后选择性地对多路复用器的控制通道进行卸压，以使单一选定的试剂流入装置。

使用显微镜监测气泡的去除，并随后确保所有试剂正确流动，避免引入气泡。使用提供的软件包，根据随附的文字实验方案设置与校准过程相关的数据字段。随后通过执行校准程序，确定每次进液步骤中每个反应器排出的液体体积。

按照控制软件提供的步骤，完成校准实验的分析，并确定微流控装置中每个环路反应器的刷新率。最后，在虚拟控制界面中设置目标实验所需的参数值。在控制界面中点击“执行实验”按钮，启动实验方案。

在标定实验中，反应器被填充一种荧光染料，每次稀释后记录其荧光强度。每次稀释时荧光强度的降低量反映了在设定的流入步数下反应器环路中被置换的体积。该体积称为更新比率。

每一步稀释的平均刷新比率及其标准差以红色显示。八个反应器中有七个表现出非常相似的行为，但其中一个反应器在第七次稀释循环后出现波动。这凸显了每个反应器需要设置独特刷新比率的必要性。

此处展示的长时间体外转录与翻译反应每 14.6 分钟置换 30% 的反应器体积。微流控装置中的两个反应器作为空白对照。其余所有反应器均包含 75% 的体外转录与翻译反应溶液，以及 25% 的超纯水或 2.5 纳摩尔编码 deGFP 蛋白表达的线性 DNA 模板。

在所有四个添加了DNA的反应器中，均观察到明显的去绿色荧光蛋白（deGFP）表达。其中一个反应器显示出较低的荧光信号，这可能是由于流体分布不均导致进入该反应器的DNA量较少，或由于反应器尺寸存在差异所致。

14小时后，含有DNA的反应器信号出现突然升高。这是由于气泡进入微流控装置的流动层所致。当流动恢复后，实验信号回到之前的荧光强度水平。

除非充分冷却，无细胞反应溶液会随着时间推移而降解，因此本方案中所述的冷却过程至关重要。由于该平台具有高度通用性，可在精确且可控的条件下进行多种生物化学和化学反应。微流控流动反应器的应用已加速了双基因回路原型设计中连续的“设计-构建-测试”循环。