利用mRNA电穿孔技术在禽类胚胎中快速高效表达多种蛋白质

mRNA电穿孔技术可在鸟类模型系统中实现多种蛋白质的快速、高效且具有时空控制性的表达。与标准DNA电穿孔所实现的标记相比，该方法能够更广泛、更快速地表达荧光蛋白。电穿孔可促使细胞质膜暂时形成孔道，作为RNA和DNA等遗传物质载体进入多种模式生物细胞的通道。

在进行初步实验时，应使用孵化超过一天的胚胎，因为这些胚胎更为强健，对外部操作（如电穿孔）的耐受性更强。在适当的胚胎发育阶段，轻柔地打破鹌鹑蛋并将内容物倒入一个10厘米的培养皿中。使用移液管去除大部分浓稠的蛋白。

使用实验室纸巾轻轻擦拭卵黄表面，去除胚胎周围残留的浓稠蛋白，以确保胚胎能紧密贴附于纸环上。将预先裁剪好的滤纸覆盖在胚胎上，用剪刀沿胚胎边缘平稳地修剪滤纸。使用巴斯德移液管将PPS缓冲液以轻柔的液流注入胚胎下方，置换任何粘附在组织上的卵黄。

以倾斜角度缓慢将胚胎纸环从卵黄上拉起并取下。将纸环放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中以进行进一步清洁。当大部分卵黄被去除后，将胚胎腹面朝上放置于一个直径35毫米、并覆盖有琼脂与蛋清半固体混合物的培养皿中。

通过连接黑色电极，向电穿孔室中加入磷酸盐缓冲液（PBS），并将胚胎放入其中。使用玻璃微量移液管向目标区域的上胚层与卵黄膜之间的腔隙内注射200纳升（200 nanoliters）的mRNA溶液。然后使用红色电极对胚胎进行电穿孔。

将电穿孔后的胚胎放回琼脂-蛋清混合物上，并在38摄氏度下孵育至所需发育阶段。若需对电穿孔编码的荧光蛋白进行成像，应在荧光解剖体视显微镜下观察所有电穿孔胚胎，从中挑选出最健康且电穿孔效果最佳的胚胎用于动态成像实验。其余电穿孔胚胎及未电穿孔胚胎则继续在另一孵育箱中孵育。

用 PBS 快速冲洗选定的胚胎，以去除电穿孔过程中可能在胚胎背侧形成的小气泡。将清洗后的胚胎直接放入成像培养皿中，培养皿内含约 150 微升的蛋清-琼脂薄层，注意避免在胚胎背侧表面产生气泡。沿成像培养皿内壁边缘放置一小块湿润的卷起的纸巾。

用石蜡膜密封培养皿，以尽量减少成像和孵育过程中的蒸发。迅速将培养皿转移至预热的共聚焦显微镜载物台上，使用明场通道定位胚胎中的有色染料。设置成像软件至所需物镜、二向色镜和发射光谱，并开启适当的激光器。

注意确保细胞在整个成像过程中始终位于视野范围内。使用足够高的成像分辨率，并确保成像条件不会引起光毒性。在成像软件中点击“Live”，并根据每台显微镜的激光功率，将激光强度调整至适合荧光信号强度的适当设置。

使用1%的激光功率和800的增益开始对胚胎进行成像，然后以1%为增量逐步增加激光功率，直至观察到饱和像素。当观察到饱和像素时，略微降低激光功率，直到无法看到任何饱和像素为止。每隔三到五分钟对胚胎进行一次成像，以检查单个细胞在不同时间点的迁移情况；每次成像应覆盖整个电镀区域，采用5微米的Z轴步进扫描，并在Z轴堆栈的底部留出额外空间，以防在成像过程中胚胎沉入琼脂糖凝胶中。

为了观察细胞的移动速度，请查看第一段视频的前几个时间点。如果细胞移动速度较快，可考虑扩大成像区域的放大倍数或对同一胚胎的其他区域进行成像。当胚胎的整个电镀区域完成成像后，需对同一胚胎的非电镀区域进行成像，以确定自发荧光水平。

为了确定在体视显微镜下确认目的基因电穿孔后，转染的mRNA能够翻译成荧光蛋白的持续时间，将胚胎置于倒置共聚焦显微镜的预热载物台上，使用405纳米激光，激光功率为70%，迭代次数为100次，扫描速度为4，对电穿孔基因所在区域的细胞荧光在多个时间点进行光漂白，以消除大部分荧光信号。光漂白后，继续将胚胎在36摄氏度的载物台上孵育，并注意观察光漂白区域内活跃分裂的细胞，这些细胞通常仅在健康胚胎中可见，因此表明电穿孔未对胚胎细胞造成损伤。在光漂白后的一定时间内，以每3至5分钟为间隔，定期采集电穿孔区域的Z轴层扫图像。

为确保成像条件不会对胚胎存活产生不利影响，需同时孵育未经光漂白的电穿孔胚胎，作为成像实验的对照。为定量分析电穿孔后mRNA降解的光漂白结果，使用ImageJ测量每个细胞电穿孔区域中心直径为7.5微米的圆形区域的荧光强度，以追踪每3至5分钟间隔的细胞荧光变化。当所有位于光漂白区域内、未处于有丝分裂且已完全光漂白的细胞均被测量后，绘制每次光漂白时间点后荧光强度随时间变化的曲线图。

尽管DNA电穿孔可导致某些电穿孔细胞产生更亮的荧光，但与广泛表达的mRNA编码荧光蛋白相比，DNA电穿孔的效率明显较低。在同一胚胎内比较DNA与mRNA共电穿孔时，表达荧光蛋白的DNA效率也显著且持续地低于表达荧光蛋白的mRNA。对所有仅使用mRNA、仅使用DNA或两者联合电穿孔的胚胎进行定量分析显示，在特定区域中，mRNA可转染约75%的细胞，而DNA仅能转染约25%的细胞。

与转染DNA相比，转染mRNA应能更快地产生蛋白质，因为mRNA可立即被细胞质中的翻译机制识别。尽管先前研究表明共电穿孔多个DNA的效率相对较低，但本实验中四种mRNA的共电穿孔在所有电穿孔区域实现了87%的四重mRNA转染效率。尽管光漂白最初会使光漂白细胞中的荧光强度降低约95%，但仍有一些细胞在电穿孔后不久恢复了分裂能力并表达荧光蛋白。

然而，这种能力在电穿孔后五小时内会逐渐下降。请耐心优化最佳成像条件，即使在开始录制视频后也应持续调整，随时准备根据需要进行任何修改。