使用mRNA电穿孔快速有效地表达Avian胚胎中的多种蛋白质

mRNA电穿孔提供了鸟类模型系统中多种蛋白质的快速、高效、在空间和时间上控制的表达。与标准DNA电穿孔获得的标签，此方法允许更广泛、更快速地表达荧光蛋白。电穿孔有助于血浆膜中毛孔的瞬态开口，作为将RNA和DNA等遗传有效载荷转移到许多模型生物体的细胞的导管。

对于最初的实验工作与超过一天的胚胎，因为他们更硬，更耐外部操作，如电穿孔。在适当的胚胎发育阶段轻轻地打破和倒鹅蛋内容到10厘米的培养皿。使用转移移液器去除大部分厚白条。

使用实验室组织轻轻擦拭束缚的表面，取出胚胎周围剩余的厚白化细胞，确保胚胎紧紧粘在纸环上。将预切滤纸放在胚胎上，用剪刀在胚胎周围平滑切割。使用巴斯德移液器将PPS层下胚胎，使用温和的溪流，以腾出任何粘在组织上束缚的束缚。

慢慢地将胚胎纸环以斜角向上和从束缚上拉下。将纸张放入装满 PBS 的培养皿中，以进行进一步清洁。一旦大部分的束缚被移除，将胚胎腹侧放在一个35毫米的培养皿中，上面覆盖着半固体的阿加和白细胞的混合物。

通过将黑色电极与 PBS 连接并将胚胎放入内，准备电穿孔室。使用玻璃微胶囊将 200 纳米的 mRNA 注入覆盖所需区域的表膜和葡萄球菌膜之间的腔中。然后用红色电极对胚胎进行电分。

将电胚胚胎放回阿加-白蛋白混合物中，并在38摄氏度下孵育，直到达到所需的发育阶段。对于电穿孔编码荧光蛋白的成像，在荧光解剖立体镜下观察所有电穿孔胚胎，为动态成像实验选择最健康、最好的电穿孔胚胎。继续在单独的培养箱中孵育其他电镀胚胎和非电镀胚胎。

用 PBS 短暂冲洗所选胚胎，以去除在电穿孔期间在胚胎的后侧可能形成的任何气泡。将清洁的胚胎直接放入一个成像盘中，内含一层约150微升的白化素，注意不要在胚胎的背表面产生任何气泡。沿着成像盘的内边缘添加一小块湿润卷起的纸巾。

用石蜡膜密封盘子，以尽量减少成像和孵育过程中蒸发。快速将培养皿移动到共体显微镜的预预热阶段，并使用亮场通道定位胚胎中的彩色染料。将成像软件设置为所需的目标、二色镜和发射光谱，并打开适当的激光器。

注意整个影片的单元格将保留在图像视觉中。使用足够高的成像分辨率，并确保成像条件不会引起光毒性。单击成像软件中的"实时"，根据每种显微镜激光功率将激光功率调整为适合荧光强度的设置。

开始使用 1%激光功率和 800 增益对胚胎进行成像，将激光功率缓慢增加 1%，直到看到饱和像素。当观察到饱和像素时，激光功率会略有降低，直到无法可视化饱和像素。每三到五分钟对胚胎进行成像，使用整个电镀区域的五微米 Z 堆栈检查单个细胞跨不同时间点的迁移，并针对 Z 堆栈的底部增加一些空间，以防胚胎在成像过程中沉入阿加罗斯床。

要观察单元格的移动速度，请检查第一部电影的正几个时间点。如果单元格以快速的速度移动，请考虑展开图像区域的缩放或成像不同的区域。当胚胎的整个电镀区域被成像后，图像在相同胚胎的未电镀区域中确定自荧光水平。

要确定转染mRNA在立体显微镜上确认感兴趣的基因的电穿孔后可以转化为荧光蛋白多长时间，将胚胎置于倒置共体显微镜的预热阶段，并使用具有70%激光功率、100次迭代的405纳米激光，以及从电镀基因的4到光漂白大部分细胞荧光的扫描速度， 在不同时间点。在光漂白后，在36摄氏度的温度下继续在舞台上孵育胚胎，注意注意光漂白区域内通常只见健康胚胎的主动分裂细胞，从而表明电穿孔没有伤害胚胎细胞。定期以三到五分钟的时间间隔获取电镀区域的漂白后 Z 堆栈图像，时间长度达到所需时间。

确保成像条件不致影响胚胎存活同时孵育未光漂白的电镀胚胎，以控制成像。为了量化mRNA衰减后电穿孔的光漂白结果，使用 ImageJ 测量每个细胞电镀区域中心7.5微米圆的荧光强度，以跟踪每三到五分钟间隔的细胞荧光。当光漂白区域内所有未经历线粒化且已完全光漂白的细胞都经过测量后，在胚胎光漂白的每个时间点绘制荧光强度。

虽然DNA电穿孔导致某些电镀细胞的荧光更亮，但与广泛表达的mRNA编码荧光蛋白相比，DNA电穿孔的效率明显较低。当比较同一胚胎中的DNA和mRNA共电时，表达荧光蛋白效率的DNA效率也明显且始终低于表达荧光蛋白的mRNA。所有胚胎的定量仅使用mRNA、DNA或两者的组合进行电镀，发现mRNA在给定区域中转染约75%的细胞，而DNA只转染约25%的细胞。

与转染的DNA相比，转染mRNA应能更快地产生蛋白质，因为细胞转化机制可以立即识别mRNA。虽然多个DNA的共电化以前已被证明是相对低效的，但本实验中4个MRNA的共电化导致所有电镀区域内所有四个MRNA的转染效率达到87%。虽然光漂白最初将光漂白细胞的荧光强度降低了约95%，但一些细胞在电穿孔后不久仍能够恢复分裂和表达荧光蛋白的能力。

然而，这种能力在电穿孔后五小时内会降低。花时间优化最佳成像条件，甚至在开始拍摄电影后，也要继续进行修补，如果需要，可以进行任何调整。