Name: 使用mRNA电穿孔快速有效地表达Avian胚胎中的多种蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学习mRNA电穿孔技术在鹌鹑胚胎中快速高效表达多种蛋白质的方法。该技术通过荧光标记实现细胞体内运动追踪，为发育生物学研究提供高效工具。

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感谢 David Huss 对本研究工作的有益见解。本工作部分得到了 Rose Hills 基金会暑期研究奖学金（2016-2018 年）和南加州大学教务长本科生研究奖学金对 M.T. 的资助，Saban 研究所院内培训博士前奖项对 M.D. 的资助，以及南加州大学本科生研究助理项目奖项对 R.L. 的资助。

所有动物实验均依照洛杉矶儿童医院和南加州大学机构动物护理与使用委员会批准的指南进行。
1. 构建基于pCS2的表达载体
<ol>
	<li>为了克隆 pCS2.Lifeact-eGFP，首先通过使用 BamHI（10 U）和 BsrGI（10 U）在适当的消化缓冲液（见材料表）中对 2 µg 的 pCS2.CycB1-GFP（一种含有不同插入片段的构建体）进行双酶切，制备载体骨架。缓冲液稀释至 1x，总体积为 50 µL，37 °C 下孵育 1 小时（克隆流程示意图见图 1）。
	<ol>
		<li>向限制性内切酶反应产物中加入虾碱性磷酸酶（1 U），对载体骨架的游离 3’OH 末端进行去磷酸化处理，37 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>将全部反应混合物在 1% 琼脂糖凝胶/1x Tris 乙酸 EDTA（TAE）缓冲液中以 90 V 电泳约 50 分钟，随后将凝胶置于含 0.5 µg/mL 溴化乙锭的 1x TAE 缓冲液中染色 15 分钟，并轻轻摇动。同时，务必在空泳道中加入分子量标记物，以便确定 DNA 片段大小。</li>
		<li>使用不会造成 DNA 断裂的 DNA 安全紫外透射仪，迅速从琼脂糖凝胶中切下载体骨架（预期条带大小为 4 kb），并按照试剂盒说明书，使用凝胶回收试剂盒从凝胶块中纯化 DNA 片段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与步骤 1.1 同时进行，使用 BglII（10 U）和 BsrGI（10 U）在适当消化缓冲液（稀释至 1x）中对 2 µg 的 pEGFP-N1-Lifeact 进行酶切，总体积为 50 µL，37 °C 孵育 1 小时。将全部反应混合物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，按照步骤 1.1.2–1.1.3 所述方法分离出 800 bp 的条带。</li>
	<li>在载体和插入片段均经纯化并使用分光光度计定量后，将 50 ng 载体与 38 ng 插入片段（载体与插入片段的摩尔比为 1:3）加入 T4 DNA 连接酶缓冲液中，随后加入 T4 DNA 连接酶以催化连接反应。此外，设置无 DNA 的阴性对照、仅载体对照和仅插入片段对照。所有反应在室温下孵育 30 分钟。
	<ol>
		<li>取 1 µL 连接反应混合物转化至感受态 E. coli DH10 中。同时设置仅加水的阴性对照和含 20 pg pUC19 的阳性对照。将菌液涂布于含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 Luria Broth（LB）琼脂平板上，37 °C 过夜培养。</li>
		<li>次日早晨，计数各平板上的菌落数。 
		注意：理想情况下，阴性对照平板上应无菌落生长，载体+插入片段连接组平板上应有&#62;100 个菌落，而仅载体对照平板上的菌落数应较少。</li>
		<li>从载体+插入片段连接混合物转化的平板上挑取至少 8 个细菌菌落，使用无菌牙签或移液器吸头将其接种至含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 2 mL 液体 LB 培养基中。</li>
		<li>使用商业质粒小提试剂盒从各个克隆中提取质粒 DNA。</li>
		<li>取每个克隆的 500 ng DNA 进行诊断性限制性酶切，使用 NotI（10 U）和 BamHI（10 U）在适当缓冲液（稀释至 1x）中 37 °C 孵育 1 小时，随后将酶切产物在 1% 琼脂糖凝胶的 1x TAE 缓冲液中电泳。pCS2.Lifeact-eGFP 阳性克隆的预期条带大小为 3.9 kb 和 978 bp。</li>
		<li>将阳性克隆的 1 pg–100 ng DNA 转化至感受态 E. coli DH10 中，并按照前述步骤进行 3–4 次小提，以获得足量 DNA 用于体外转录反应（至少 10 µg）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体外转录制备 mRNA
<ol>
	<li>用 NotI (10 U) 在适当的消化缓冲液中对 10 µg pCS2.LifeAct-eGFP 质粒的插入片段 3’端进行线性化处理，缓冲液稀释至 1×，总体积为 50 µL，37 °C 过夜反应。 
	注意：为防止 RNase 污染并减少 mRNA 降解，操作 mRNA 样品时应佩戴手套。</li>
	<li>使用苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1, v/v) 混合液纯化 DNA。
	<ol>
		<li>加入 150 µL 无 RNase 水，使消化反应总体积达到 200 µL。然后加入 200 µL 苯酚:氯仿:异戊醇混合液，涡旋振荡 20 秒。</li>
		<li>在微量离心机中以最大速度（18,400 × g）离心 2 分钟。小心吸取含有线性化 DNA 的上层水相。重复此步骤以去除更多杂质，并注意不要扰动可能在上下液相之间形成的白色沉淀物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠（无 RNase）和 2.5 体积的 100% 乙醇沉淀线性化 DNA。将混合物置于 -20 °C 至少 &#62;30 分钟，然后以最大速度（18,400 × g）离心收集 DNA 沉淀。
	<ol>
		<li>用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，然后在空气中干燥至少 &#62;5 分钟。</li>
		<li>将 DNA 沉淀溶解于 5 µL 无 RNase 水中。使用分光光度计测定 DNA 浓度。 
		注意：预期 DNA 浓度约为 0.5–1 µg/µL，A260/A280 比值在 1.7–2.0 之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取 1 µg 线性化的 pCS2.LifeAct-eGFP DNA 进行体外转录（IVT）。按照商业试剂盒说明书（见材料表）操作，加入 10 µL 帽类似物（终浓度 0.8 mM）和核苷三磷酸（NTPs）（ATP、CTP 和 TTP 终浓度均为 1 mM，GTP 终浓度为 0.2 mM）、2 µL 10× 反应缓冲液（终浓度 1×）、2 µL SP6 RNA 聚合酶，并用无 RNase 水补足至 20 µL。
	<ol>
		<li>根据转录本大小，将 IVT 反应混合物孵育约 2 小时或更长时间。 
		注意：对于 3 kb 的转录本，2 小时孵育效果良好；但对于大于 5 kb 的转录本，过夜孵育效果更佳。</li>
		<li>为去除转录反应中未结合的游离核苷酸，加入 30 µL LiCl RNA 沉淀液（7.5 M 氯化锂，50 mM EDTA）以沉淀 mRNA。短暂涡旋混合后，于 -20 °C 放置 30 分钟。在微量离心机中以最大速度（18,400 × g）离心 15 分钟收集 mRNA，并用 70% 乙醇（无 RNase）清洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将合成的 mRNA 溶解于 15 µL 无 RNase 水中。分装为每管 5 µL（共 3 管），置于 -80 °C 长期保存。使用分光光度计定量 mRNA。 
	注意：预期产量为 15–20 µg mRNA（约 1 µg/µL）。1 µL（1 µg/µL）足以进行一次约含 10 个胚胎的实验，假设将 mRNA 从 1 µg/µL 稀释至 500 ng/µL，且每个胚胎注射约 200 nL。因此，每管应足够进行约 5 次实验。</li>
	<li>在使用 RNase 去污染溶液（如 RNase Away）彻底清洁所有凝胶设备后，将约 300 ng mRNA 在 1% 琼脂糖凝胶中以 1× TAE 缓冲液进行电泳，确认 mRNA 呈现单一主带（若形成二级结构可能出现多条带），且凝胶泳道中无弥散条带，后者提示 RNA 已降解。</li>
</ol>
3. mRNA 电穿孔混合物的制备
<ol>
	<li>将 mRNA 解冻并稀释至所需浓度（在本研究测试的所有 mRNA 中，使用无 RNase 水配制为 250–500 ng/µL 效果良好）。加入 1/10 体积的有色染料（参见材料表，无 RNase，终浓度为 0.1%），以帮助可视化 mRNA 注射部位并准确定位电极。 
	注意：若将 DNA 与 RNA 联合用于共电穿孔，请确保 DNA 不含污染性 RNase，可在 mRNA 与 DNA 混合前采用酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法纯化 DNA。
	<ol>
		<li>务必使用模拟电穿孔溶液（不添加 RNA）制备阴性对照。如有可能，使用预先验证过的 mRNA 制备阳性对照（即在先前实验中已证实可成功表达荧光蛋白的 mRNA）。 
		注意：阴性对照对于所有成像实验均至关重要，可用于确定背景荧光水平，以便对数据进行归一化处理。当使用新转录的 mRNA 时，阳性对照尤为重要，有助于确认电穿孔条件设置有效。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 mRNA 电穿孔溶液保存在冰浴中，以防止降解，直至准备进行电穿孔操作。</li>
</ol>
4. 将mRNA电穿孔导入活体鹌鹑胚胎
<ol>
	<li>每日收集新鲜受精的鹌鹑蛋，并在加湿冰箱中于 13 °C 下储存，储存时间不超过 1 周。将鹌鹑蛋在 38 °C 下孵育，直至达到所需的胚胎发育阶段19,20,21。 
	注意：本研究中静态和动态成像均使用 HH3 至 HH5 阶段的胚胎。对于 HH3 胚胎，在收获前将蛋在室温下放置 2 小时，可使分离过程更容易，因为胚胎在冷却后通常对物理操作更具耐受性。</li>
	<li>根据 EC 培养系统分离并准备胚胎22。每种条件至少收集 5 个胚胎，其中包括至少 1 个作为阴性对照（未进行电转染）。
	<ol>
		<li>轻轻敲破蛋壳并将内容物倒入 10 cm 培养皿中。用移液管移除大部分浓稠的蛋清，并用纸巾轻轻擦拭卵黄表面，去除胚胎周围残留的浓稠蛋清，以确保胚胎牢固地粘附在滤纸环上。</li>
		<li>将预先裁剪好的滤纸（见材料表）覆盖在胚胎上，用剪刀沿胚胎边缘平滑地剪下。</li>
		<li>使用巴斯德移液管在胚胎下方注入 PBS，用轻柔的液流冲走粘附在胚胎上的卵黄。 
		注意：此步骤在处理较早期（&#60;HH3）胚胎时尤为关键，因为这些胚胎更容易粘附于卵黄，在后续洗涤步骤中常会从卵黄膜上脱落。</li>
		<li>以倾斜角度缓慢将胚胎连同滤纸环从卵黄上提起，转移至盛有 PBS 的培养皿中进行进一步清洁。待大部分卵黄被去除后，将胚胎腹面朝上放置于覆盖有半固体琼脂/蛋清混合物的 35 mm 培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用玻璃微电极拉制仪制备六至八根长度为 10 cm 的玻璃毛细管（外径 = 1.2 mm）。</li>
	<li>将胚胎腹面朝上放入盛有 PBS 的电转染室中。使用玻璃毛细管，向目标区域覆盖的上胚层与卵黄膜之间的腔隙中注射 200 nL 的 mRNA 或 DNA/mRNA 电转染混合液。 
	注意：本研究中大多数实验对透明区的整个前部区域以及部分不透明区进行了电转染。</li>
	<li>将正负电极（铂金扁平方形电极，边长 5 mm）分别置于胚胎的上方和下方，使用体内电转染仪施加以下脉冲序列：5 次 5 V、50 ms 持续时间的方波电脉冲，脉冲间隔为 100 ms。确保电极之间的距离约为 5 mm。 
	注意：优化电转染参数至关重要，以避免导致脆弱胚胎细胞死亡的条件。应针对不同电转染设备，考虑 DNA 和 mRNA 电转染时的电压、脉冲时长、脉冲间隔及脉冲次数等参数。</li>
	<li>将电转染后的胚胎在 38 °C 下继续孵育至所需发育阶段。 
	注意：荧光解剖体视显微镜（见材料表）有助于筛选转染与非转染胚胎。</li>
	<li>若需对胚胎进行静态成像，则在室温下用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定 1 小时，或在 4 °C 下过夜固定。
	<ol>
		<li>用剪刀沿滤纸边缘平滑剪开，将胚胎从卵黄膜上分离，并用精细镊子轻轻剥离胚胎背侧表面的亮膜。</li>
		<li>用 PBS/Triton（0.1%）清洗固定后的胚胎，每次 5 分钟，共洗 2 次；如需，可继续进行原位杂交或免疫染色。</li>
		<li>最后，在 PBS/Triton（0.1%）中加入 0.5 µg/µL DAPI 对胚胎染色，室温下至少染色 30 分钟。再用 PBS/Triton 清洗胚胎 2 次，每次 5 分钟，并在 SCALE-U2 溶液中透明过夜23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为分析电转染效率（见图 2），在 ImageJ 中使用二值化与颗粒分析工具，并结合 DAPI 通道获取图像中所有细胞的细胞核轮廓。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中使用二值化工具时，选择 DAPI 通道中包含大多数细胞的一个 z 层切片，点击Process &#62; Binary &#62; Make Binary。为分离相邻细胞，点击Process &#62; Binary &#62; Watershed。通过点击Analyze &#62; Analyze Particles 获取细胞轮廓，设定大小范围为 100–500（µm2）。</li>
		<li>确保 DAPI 通道中大多数细胞均被勾画出轮廓，并在 ROI 管理器弹出窗口中点击More &#62; Save 保存细胞轮廓。</li>
		<li>打开先前保存的 mRNA 或 DNA 通道的单个 z 层切片文件，使用这些轮廓在 ROI 管理器中点击 Measure，获取 mRNA 和 DNA 通道的荧光强度值。</li>
		<li>最后，对这些强度值进行筛选，将荧光强度 &#60;6,000 的细胞计为非转染细胞，荧光强度 &#62;6,000 的细胞计为转染细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过电穿孔 mRNA 编码的荧光蛋白成像
<ol>
	<li>在荧光解剖体视显微镜下观察所有电穿孔后的胚胎，从中选择最健康且电穿孔效果最佳的胚胎用于动态成像实验。
	<ol>
		<li>将其他已电穿孔的胚胎以及未电穿孔的胚胎（阴性对照）继续置于另一个培养箱中孵育，以便在对选定胚胎进行成像过程中，若该胚胎死亡时可及时替换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于动态成像，采用先前描述的全胚体外卵外禽类胚胎培养方法24,25,26，结合倒置共聚焦显微镜进行。 
	注意： 显微镜配备有载物台培养装置（见材料表），可在成像期间维持36 °C的温度。在显微镜调试过程中观察到，36 °C下孵育的胚胎比在更高温度下存活时间更长，可能是因为激光会导致胚胎局部升温。读者应根据自身显微镜系统确定最佳的载物台孵育温度。
	<ol>
		<li>为动态观察胚胎发育过程，使用镊子在PBS清洁液中轻轻移动电穿孔后的胚胎，用PBS短暂清洗胚胎以去除电穿孔过程中可能在胚胎背侧形成的小气泡。</li>
		<li>将清洗后的胚胎直接放置于含有薄层蛋清-琼脂（约150 µL）的成像培养皿中，注意避免在胚胎背侧表面产生气泡22。</li>
		<li>为确保长期成像期间胚胎存活，可在成像培养皿内边缘放置一小块湿润卷起的滤纸，并用石蜡膜密封培养皿，以尽量减少成像和孵育过程中的液体蒸发。</li>
		<li>迅速将该培养皿转移至预热的共聚焦显微镜载物台上，使用明场通道（PMT激光20%）定位胚胎中的染料颜色，以识别注射并完成电穿孔的区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置成像软件的物镜（10倍或20倍）、二向色镜（GFP使用488 nm，RFP使用561 nm）、发射光谱（GFP为499–562 nm，RFP为570–695 nm），并开启相应的激光（GFP使用488 nm，RFP使用561 nm）。 
	注意： 电穿孔后的mRNA在20分钟内即可翻译为蛋白（见图3）。本文大多数图像所使用的成像元数据如下：使用20倍物镜的倒置共聚焦显微镜（见材料表）；像素驻留时间约为1.5 μs；4线扫描平均。
	<ol>
		<li>在成像软件中点击“Live”（实时成像），根据各显微镜激光功率的不同，调整激光强度至适合荧光信号强度的水平。初始设置建议使用1%激光功率、800增益，然后以1%为增量逐步提高激光功率，直至出现饱和像素。</li>
		<li>随后略微降低激光功率，直至不再出现饱和像素。 
		注意： 胚胎成像开始时选择的激光功率可能适用于早期时间点，但若随着时间推移细胞荧光显著增强或减弱，则后期时间点可能不再理想。为解决此问题，建议初始成像时使用略低的激光功率设置，因为电穿孔后的细胞通常在电穿孔后前6小时内荧光强度逐渐增强（见图3A–E中的信号增强量化结果）。如果后期图像出现饱和，可继续使用原始成像参数采集图像，但应立即以较弱的成像条件（更小的针孔或更低的激光功率）额外采集一幅图像。</li>
		<li>每3–5分钟对胚胎成像一次，以追踪单个细胞在不同时间点的迁移过程。本研究中，图像为整个电穿孔区域的z轴层扫图像（约50 µm厚），并在z轴堆栈底部保留额外空间，以防胚胎在成像过程中沉入琼脂糖基质中。</li>
		<li>通过检查首段视频的前几个时间点，观察细胞移动速度。若细胞移动较快（即在接下来的几个时间点内将移出成像区域），可考虑扩大成像区域的缩放倍数（如从1x调整为0.8x）或更换成像区域。 
		注意： 明区（area pellucida）内的胚胎区域比暗区（area opaca）移动更迅速。此外，较年轻的胚胎（HH3、HH5）中的细胞运动通常比更晚期的胚胎（&#62;HH7）更为活跃。</li>
		<li>在对胚胎的电穿孔区域完成成像后，应对其同一胚胎的未电穿孔区域进行成像，以确定自发荧光水平（若使用较低激光功率（&#60;10%）成像，自发荧光应极低）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 荧光漂白后恢复（FRAP）检测 mRNA 完整性
注意：体内光漂白后荧光恢复（FRAP）实验可用于确定转染的 mRNA 能够翻译成荧光蛋白（FP）的时间长度。以下方案概述了在电穿孔胚胎中检测 H2B.Citrine mRNA 半衰期的 FRAP 实验步骤。
<ol>
	<li>使用20倍、0.8 NA的物镜和完全打开的针孔，在倒置共聚焦显微镜上进行FRAP实验。
	<ol>
		<li>在体视显微镜下确认H2B-Citrine的电转染效果后，将胚胎置于倒置共聚焦显微镜预热的载物台上（见步骤5.2.4），在多个时间点（电转后45分钟、2小时和5小时）使用405 nm激光（激光功率70%、扫描100次、扫描速度为4）对H2B-Citrine的细胞荧光进行光漂白，使残留荧光仅剩约5%。 
		注意：该过程大约需要几分钟。</li>
		<li>光漂白后，继续将胚胎在36 °C条件下于载物台上孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>务必关注光漂白区域内正在进行活跃分裂的细胞，这表明光漂白后的细胞在处理后并未完全死亡。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜以固定时间间隔（3或5分钟）采集光漂白后的图像（电转区域的z轴层扫图像），持续最多30分钟。 
	注意：如有条件，可使用转基因H2B-XFP品系作为阳性对照，以确认光漂白区域内细胞的存活状态。由电转mRNA编码的荧光蛋白（FP）的荧光恢复速率应逐渐降低，而由转基因编码的FP的荧光恢复速率在整个成像过程中应保持稳定。</li>
	<li>为确保成像条件不会对胚胎存活产生不利影响，应同时孵育未进行光漂白的电转胚胎，作为成像过程的对照。</li>
	<li>为定量分析电转后mRNA降解的光漂白结果，使用ImageJ软件测量每个细胞中心区域（直径7.5 µm的圆形区域）的荧光强度，以追踪细胞荧光随时间（每3或5分钟）的变化。测量对象应包括光漂白区域内所有未处于有丝分裂期且已完全光漂白的细胞。 
	注意：由于染色质凝缩，有丝分裂期细胞核的荧光强度高于间期细胞核，因此建议在定量分析中排除有丝分裂期细胞。</li>
	<li>在多个时间点（45分钟、2小时和5小时）绘制光漂白后荧光强度随时间变化的曲线图。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

在本实验方案中，我们逐步介绍了如何精确地将mRNA微量注射并电穿孔导入原肠胚期鹌鹑胚胎的细胞中。我们证明了体外合成的mRNA电穿孔可在原肠胚期鹌鹑胚胎中实现快速且高效的荧光蛋白（FPs）表达（图2 和 3）。通过共聚焦显微镜，可在电穿孔mRNA翻译出H2B-citrine蛋白后约20分钟内检测到荧光信号，并在数小时内持续增强（图3，补充影片1）。这一速度出乎意料地快，接近citrine荧光蛋白预估的成熟时间32,33。而由DNA载体表达的荧光蛋白则在2-3小时后方可检测到（图3，补充影片1），这与以往报道的结果相似8,34<su...

电穿孔是一种物理转染方法，通过电脉冲在细胞质膜上形成瞬时孔隙，使核酸或化学物质等能够进入细胞质。电穿孔被广泛用于将DNA导入细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞1,2,3。该技术常规应用于在发育中的禽类胚胎内将遗传物质导入特定细胞和组织，以研究基因对发育过程的调控机制，或标记迁移中的细胞群体4,5,6,7。然而，DNA电穿孔也存在若干实验局限性8。例如，DNA电穿孔通常导致每个细胞摄入的表达载体数量高度可变，进而造成其所编码的mRNA和蛋白质表达水平的差异。这种变异性可能导致显著的细胞间异质性，从而增加图像分析和数据解读的复杂性9,10。此外，通过DNA电穿孔表达的蛋白质通常在电穿孔后约3小时才开始表达，并需至12小时后才能在细胞数量和荧光强度上达到最大效率，这可能是因为DNA需时间进入细胞核，并在体内完成转录和翻译过程11。
相比之下，mRNA 转染已成功应用于多种模型系统，包括通过显微注射将 mRNA 导入Xenopus laevis卵母细胞12,13，利用 mRNA 脂质体转染重编程人类干细胞14，以及对成年小鼠中难以转染的神经干细胞进行电穿孔15。我们测试了利用体外合成的编码不同荧光蛋白（FPs）的 mRNA，通过 mRNA 电穿孔技术在早期鸟类胚胎发育过程中高效标记细胞的能力。在本研究中，我们采用了 pCS2+ 载体，这是一种常用于在Xenopus和斑马鱼胚胎中表达蛋白的多功能表达载体。pCS2+ 载体中的 SP6 和 T7 RNA 聚合酶启动子使得任何克隆基因在体外转录/翻译系统中均能实现 mRNA 和蛋白&#160;的合成&#160;与&#160;表达。
在此，我们证明了mRNA电穿孔技术能够在原肠胚期的鹌鹑胚胎中实现荧光蛋白（FPs）的快速高效表达。我们设计并构建了本研究中使用的多种表达载体。例如，我们将LifeAct-eGFP基因16亚克隆至pCS2+载体17中，使其可在CMV启动子和SP6启动子驱动下表达。插入的基因位于SP6启动子的下游和SV40 poly(A)尾18的上游。在同时电穿孔mRNA和DNA的胚胎中，由体外转录mRNA编码的荧光蛋白在电穿孔后20分钟内即可检测到，而由DNA表达载体编码的荧光蛋白则需3小时后才能检测到。可将多种编码核蛋白、高尔基体蛋白和膜蛋白的mRNA同时电穿孔导入胚胎，从而在单个细胞中实现多种蛋白的快速高效表达。最后，通过活体光漂白后荧光恢复（FRAP）实验表明，大部分电穿孔导入的mRNA在2小时内即发生降解。因此，mRNA电穿孔技术具有初始蛋白表达迅速且后续新蛋白合成有限的特点，是在需要精确控制表达时间时的一种重要技术手段。

<table><tbody><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td></td></tr><tr><td>BsrG1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3575S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇</td><td>Thermo Fisher</td><td>15593031</td><td></td></tr><tr><td>SP6 mMessage Machine 体外转录试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>快绿FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93443</td><td>4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇，&lt;em&gt;t&lt;/em&gt;-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，聚乙二醇 &lt;em&gt;tert&lt;/em&gt;-辛基苯基醚</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>2-(4-脒基苯基)-6-吲哚羧脒二盐酸盐，4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐，DAPI二盐酸盐</td></tr><tr><td>Whatman No.1 滤纸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51457</td><td></td></tr><tr><td>pmTurquoise2-Golgi</td><td>Addgene</td><td>36205</td><td>pmTurquoise2-Golgi由Dorus Gadella惠赠（Addgene质粒# 36205；http://n2t.net/addgene:36205；RRID:Addgene_36205）</td></tr><tr><td>pmEGFP-N1-LifeAct</td><td></td><td></td><td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td></tr><tr><td>pCS2.Lifeact-mGFP</td><td>Addgene</td><td></td><td>本文</td></tr><tr><td>pCS.H2B-citrine</td><td>Addgene</td><td>53752</td><td>pCS-H2B-citrine由Sean Megason惠赠（Addgene质粒# 53752；http://n2t.net/addgene:53752；RRID:Addgene_53752）</td></tr><tr><td>pCS.memb-mCherry</td><td>Addgene</td><td>#53750</td><td>pCS-memb-mCherry由Sean Megason惠赠（Addgene质粒# 53750；http://n2t.net/addgene:53750；RRID:Addgene_53750）</td></tr><tr><td>Zeiss LSM-780 倒置显微镜</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td>LSM-780 是一种共聚焦和多光子显微镜，具备活体成像工作所需的灵敏度。配备电动载物台、自动对焦装置和全封闭式培养箱，780 是高端活细胞/胚胎成像的优秀显微镜。高灵敏度32通道Quasar探测器支持光谱成像、线性解混和多色（&gt;4）图像采集。激发光源包括6线单光子激光器（405、458、488、514、564 和 633 nm）、Chameleon（Coherent）双光子激光器（波长范围690 nm至1000 nm），并由ZEN 2011 SP7（Black）系统软件控制运行。</td></tr><tr><td>CUY-21 EDIT 体内电穿孔仪</td><td>Bex Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铂金方形电极，边长5 mm</td><td>Bex Co., Ltd.</td><td>LF701P5E</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX10 FL 体视显微镜</td><td>Olympus LifeScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XM10 单色相机</td><td>Olympus LifeScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于HCR的磷酸盐缓冲液（PBS）（10&amp;times;，pH 7.4）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>配制1 L 10&amp;times;储存液：加入80 g NaCl（Sigma-Aldrich S3014）、2 g KCl（Sigma-Aldrich P9541）、11.4 g 无水Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（Sigma-Aldrich S3264）和2.7 g 无水KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（Sigma-Aldrich P9791）。用HCl调节pH至7.4，最后用超纯水定容至1 L。用于HCR的PBS中应避免使用CaCl₂和MgCl₂。必须将用于HCR的PBS配制成无RNase溶液（例如通过焦碳酸二乙酯[DEPC]处理）。</td></tr><tr><td>1.37 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 20 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PBS/Triton&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>将1 mL Triton X-100（Sigma Aldrich 93443）和100 mL 10&amp;times; PBS加入890 mL超纯蒸馏H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O中。用0.2 &amp;mu;m滤膜过滤溶液，并于4 ?C保存至使用。</td></tr><tr><td>1&amp;times;磷酸盐缓冲液（PBS）（DEPC处理；pH 7.4）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用mrna电穿孔技术在禽类胚胎中快速高效表达多种蛋白质

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

我们报道，与DNA电转染相比，mRNA电转染可更快速、更广泛地在活体鹌鹑胚胎中实现细胞的荧光蛋白标记。其转染效率高，可同时共转染至少4种不同的mRNA，效率约为87%。大多数电转染的mRNA在电转后2小时内被降解，从而允许在发育中的胚胎中开展时间敏感型实验。最后，我们描述了如何对电转染了编码不同亚细胞定位荧光蛋白mRNA的活体胚胎进行动态成像。

mRNA 电穿孔的效率高于 DNA 电穿孔
我们使用 pCS2+.H2B-Citrine 构建体来制备体外转录的 mRNA。由于DNA电穿孔通常在1-2 µg/µL浓度下进行，因此我们采用等摩尔浓度的mRNA（经计算，H2B-Citrine mRNA的浓度约为0.25-0.5 µg/µL）进行mRNA电穿孔。我们首先通过分别将pCS2+.H2B-Citrine DNA和H2B-Citrine mRNA（由pCS2+.H2B-Citrine的SP6启动子体外转录生成）电穿孔至HH5期鹌鹑胚胎中，并在电穿孔后12小时检测荧光表达效率，以比较两者的电穿孔效率。尽管在部分电穿孔细胞中DNA电穿孔可产生更强的荧光信号，但其转染效率明显低于mRNA所编码的荧光蛋白在胚胎中的广泛表达（图2A和B）。
<p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

我们报道了一种信使RNA（mRNA）电穿孔方法，该方法可在鹌鹑胚胎模型系统中快速高效地表达多种蛋白质。该方法可用于对细胞进行荧光标记，并在电穿孔后短时间内通过延时显微镜记录其在体内的运动过程。

利用mRNA电穿孔技术在禽类胚胎中快速高效表达多种蛋白质

我们报道，与DNA电穿孔相比，mRNA电穿孔可更快速、更广泛地在活体鹌鹑胚胎中实现荧光蛋白对细胞的标记。

mRNA电穿孔技术可在鸟类模型系统中实现多种蛋白质的快速、高效且具有时空控制性的表达。与标准DNA电穿孔所实现的标记相比，该方法能够更广泛、更快速地表达荧光蛋白。电穿孔可促使细胞质膜暂时形成孔道，作为RNA和DNA等遗传物质载体进入多种模式生物细胞的通道。在进行初步实验时，应使用孵化超过一天的胚胎，因为这些胚胎更为强健，对外部操作（如电穿孔）的耐受性更强。在适当的胚胎发育阶段，轻柔地打破鹌鹑蛋并将内容物倒入一个10厘米的培养皿中。使用移液管去除大部分浓稠的蛋白。使用实验室纸巾轻轻擦拭卵黄表面，去除胚胎周围残留的浓稠蛋白，以确保胚胎能紧密贴附于纸环上。将预先裁剪好的滤纸覆盖在胚胎上，用剪刀沿胚胎边缘平稳地修剪滤纸。使用巴斯德移液管将PPS缓冲液以轻柔的液流注入胚胎下方，置换任何粘附在组织上的卵黄。以倾斜角度缓慢将胚胎纸环从卵黄上拉起并取下。将纸环放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中以进行进一步清洁。当大部分卵黄被去除后，将胚胎腹面朝上放置于一个直径35毫米、并覆盖有琼脂与蛋清半固体混合物的培养皿中。通过连接黑色电极，向电穿孔室中加入磷酸盐缓冲液（PBS），并将胚胎放入其中。使用玻璃微量移液管向目标区域的上胚层与卵黄膜之间的腔隙内注射200纳升（200 nanoliters）的mRNA溶液。然后使用红色电极对胚胎进行电穿孔。将电穿孔后的胚胎放回琼脂-蛋清混合物上，并在38摄氏度下孵育至所需发育阶段。若需对电穿孔编码的荧光蛋白进行成像，应在荧光解剖体视显微镜下观察所有电穿孔胚胎，从中挑选出最健康且电穿孔效果最佳的胚胎用于动态成像实验。其余电穿孔胚胎及未电穿孔胚胎则继续在另一孵育箱中孵育。用 PBS 快速冲洗选定的胚胎，以去除电穿孔过程中可能在胚胎背侧形成的小气泡。将清洗后的胚胎直接放入成像培养皿中，培养皿内含约 150 微升的蛋清-琼脂薄层，注意避免在胚胎背侧表面产生气泡。沿成像培养皿内壁边缘放置一小块湿润的卷起的纸巾。用石蜡膜密封培养皿，以尽量减少成像和孵育过程中的蒸发。迅速将培养皿转移至预热的共聚焦显微镜载物台上，使用明场通道定位胚胎中的有色染料。设置成像软件至所需物镜、二向色镜和发射光谱，并开启适当的激光器。注意确保细胞在整个成像过程中始终位于视野范围内。使用足够高的成像分辨率，并确保成像条件不会引起光毒性。在成像软件中点击“Live”，并根据每台显微镜的激光功率，将激光强度调整至适合荧光信号强度的适当设置。 使用1%的激光功率和800的增益开始对胚胎进行成像，然后以1%为增量逐步增加激光功率，直至观察到饱和像素。当观察到饱和像素时，略微降低激光功率，直到无法看到任何饱和像素为止。每隔三到五分钟对胚胎进行一次成像，以检查单个细胞在不同时间点的迁移情况；每次成像应覆盖整个电镀区域，采用5微米的Z轴步进扫描，并在Z轴堆栈的底部留出额外空间，以防在成像过程中胚胎沉入琼脂糖凝胶中。为了观察细胞的移动速度，请查看第一段视频的前几个时间点。如果细胞移动速度较快，可考虑扩大成像区域的放大倍数或对同一胚胎的其他区域进行成像。当胚胎的整个电镀区域完成成像后，需对同一胚胎的非电镀区域进行成像，以确定自发荧光水平。为了确定在体视显微镜下确认目的基因电穿孔后，转染的mRNA能够翻译成荧光蛋白的持续时间，将胚胎置于倒置共聚焦显微镜的预热载物台上，使用405纳米激光，激光功率为70%，迭代次数为100次，扫描速度为4，对电穿孔基因所在区域的细胞荧光在多个时间点进行光漂白，以消除大部分荧光信号。光漂白后，继续将胚胎在36摄氏度的载物台上孵育，并注意观察光漂白区域内活跃分裂的细胞，这些细胞通常仅在健康胚胎中可见，因此表明电穿孔未对胚胎细胞造成损伤。在光漂白后的一定时间内，以每3至5分钟为间隔，定期采集电穿孔区域的Z轴层扫图像。为确保成像条件不会对胚胎存活产生不利影响，需同时孵育未经光漂白的电穿孔胚胎，作为成像实验的对照。为定量分析电穿孔后mRNA降解的光漂白结果，使用ImageJ测量每个细胞电穿孔区域中心直径为7.5微米的圆形区域的荧光强度，以追踪每3至5分钟间隔的细胞荧光变化。当所有位于光漂白区域内、未处于有丝分裂且已完全光漂白的细胞均被测量后，绘制每次光漂白时间点后荧光强度随时间变化的曲线图。尽管DNA电穿孔可导致某些电穿孔细胞产生更亮的荧光，但与广泛表达的mRNA编码荧光蛋白相比，DNA电穿孔的效率明显较低。在同一胚胎内比较DNA与mRNA共电穿孔时，表达荧光蛋白的DNA效率也显著且持续地低于表达荧光蛋白的mRNA。对所有仅使用mRNA、仅使用DNA或两者联合电穿孔的胚胎进行定量分析显示，在特定区域中，mRNA可转染约75%的细胞，而DNA仅能转染约25%的细胞。与转染DNA相比，转染mRNA应能更快地产生蛋白质，因为mRNA可立即被细胞质中的翻译机制识别。尽管先前研究表明共电穿孔多个DNA的效率相对较低，但本实验中四种mRNA的共电穿孔在所有电穿孔区域实现了87%的四重mRNA转染效率。尽管光漂白最初会使光漂白细胞中的荧光强度降低约95%，但仍有一些细胞在电穿孔后不久恢复了分裂能力并表达荧光蛋白。然而，这种能力在电穿孔后五小时内会逐渐下降。请耐心优化最佳成像条件，即使在开始录制视频后也应持续调整，随时准备根据需要进行任何修改。

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