体外研究诱导多能干细胞来源内皮细胞灌注三维血管生成出芽的标准化与可扩展检测方法

该体外实验在高通量且可扩展的平台上展示了血管生成性出芽。该方法可用于发现血管生成中的新靶点。该血管生成实验结合了包含梯度和灌注的复杂细胞微环境，并与高通量筛选平台兼容。

血管生成在健康和疾病中均发挥着重要作用。了解血管生成过程中发生的机制，有助于我们理解癌症的生长方式以及组织的修复过程。该方法可为心血管疾病和组织再生过程中的机制提供深入见解。

在这两种情况下，血管生成都起着重要作用。首次使用该微流控平台时，您需要了解体积定律以及如何进行移液操作。您可以通过在显微镜下观察或把培养板倒置过来确认操作步骤。

仅阅读方法时，某些步骤可能难以掌握，例如微流控通道的实际尺寸有多小，或如何持握培养板。这些操作将由本实验室的技术员 Wendy Stam 演示。首先，将微流控 384 孔板转移至无菌超净工作台。

使用多通道移液器，向40个观察孔中的每一个加入50微升水或磷酸盐缓冲盐水，然后打开盖子。接着，向每个微流控单元的凝胶入口加入1.5微升浓度为4毫克/毫升的I型胶原溶液。确保将凝胶液滴置于每个孔的中央，以便凝胶进入通道。

填充五个微流控单元后，将培养板倒置，目视检查凝胶通道是否填充正确。将微流控板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育10分钟，使I型胶原蛋白聚合。然后将培养板从培养箱中取出，转移至无菌超净工作台中。

向每个微流控单元顶部灌注通道的出口孔中加入50微升浓度为10微克/毫升的纤维连接蛋白编码溶液。将移液器吸头紧贴孔壁，以正确填充孔洞并避免产生气泡。通道会充满液体，液体将覆盖出口端，但不会填满出口孔。

然后将培养板放入培养箱中孵育至少两天。现在，将冻存的iPSC-ECs在37摄氏度水浴中快速解冻，时间少于一分钟。随后将细胞转移至15毫升离心管中，并缓慢加入10毫升基础培养基以稀释。

吸取10 µL溶液，在细胞计数仪上进行细胞计数。将离心管以100 ×g离心5分钟。吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后用基础培养基重悬，使细胞浓度达到2 × 10⁷ 个细胞/毫升。

接下来，将微流控384孔板从培养箱转移至无菌超净工作台。从灌注出口吸除纤连蛋白编码溶液，并在出口孔中加入25 µL基础培养基。在每个顶部灌注入口孔中加入1 µL细胞悬液。

液滴在数秒内变平。在显微镜下检查单个通道内及通道间的接种是否均匀。将微流控培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1至1.5小时。

此后，检查细胞以确认其已贴壁。从顶部灌注出口孔中移除基础培养基。在顶部灌注入口和出口中加入预热的血管培养基。

将培养板置于摇床上，摇床设置为7度倾角，摇动间隔为8分钟，并放入培养箱中。接种后第1天和第2天，使用配备自动载物台的明场显微镜对培养板进行成像，以确认细胞活性。两天后，细胞已在胶原蛋白I型支架上形成融合的单层。

首先，通过在4.5毫升基础培养基中添加4.5微升VEGF储备液、4.5微升PMA储备液和2.25微升S1P储备液，配制4.5毫升血管生成出芽培养基。通过在基础培养基中添加5.1微升VEGF和3.4微升bFGF，配制8.5毫升血管生长培养基。吸除各孔中的培养基，并在顶部灌注进样孔和出样孔以及凝胶进样孔和出样孔中各加入50微升新鲜的血管培养基。

然后向底部灌注通道的入口和出口孔各加入 50 µL 血管生成芽体混合物。将培养板放回摇床上的培养箱中，以形成血管生成生长因子的浓度梯度。在添加血管生成生长因子后的第 1 天和第 2 天，使用明场显微镜在自动载物台上对各孔进行成像。

为了研究吻合形成和芽状结构的稳定，向顶部灌注入口加入一微升浓度为每毫升零点五毫克的荧光标记白蛋白。然后使用五十微升移液器混匀溶液。将培养板转移至配备自动载物台和设定为三十七摄氏度的培养箱的荧光显微镜下进行观察。

将显微镜设置为10倍物镜，并调整曝光参数。每分钟采集一次时间序列图像，持续10分钟。从显微镜上取出培养板，转移至无菌超净工作台。

吸出各孔中的全部培养基，并更换相应孔中的血管培养基和血管生成出芽培养基。将微流控板放回培养箱中，继续进行血管生成出芽培养。在第6天重复成像，以研究通透性。

为固定细胞培养物，从各孔中吸除所有培养基。向所有灌注入口和出口孔中加入25微升4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液。然后将微流控板的一侧置于盖子上，倾斜约五度，以诱导液体流动。

室温孵育10分钟。随后，吸除孔中的PFA。用50 µL HBSS对所有灌注入口和出口清洗两次。

然后从孔中吸除HBSS。甲醛是一种危险化学品，操作时应佩戴手套，并且只能在通风橱中打开。接着，向所有灌注入口和出口加入50 µL 0.2%非离子型表面活性剂，在室温下透化10分钟，并将微流控板以约五度的倾斜角度放置在盖子上。

吸出各孔中的非离子型表面活性剂，并向所有灌注通道的进样孔和出样孔中加入50 µL HBSS，洗涤两次。吸出孔中的HBSS。用HBSS配制1,000至2,000倍稀释的Hoechst用于细胞核染色，并用HBSS配制100至200倍稀释的鬼笔环肽（Phalloidin）用于F-actin染色。

在Falcon管中加入6毫升HBSS、30微升F-actin和3微升Hoechst。然后向每个灌注入口和出口孔中各加入25微升。将培养板置于轻微倾斜的位置，在室温下孵育至少30分钟。

在所有灌注入口和出口中，用 50 微升 HBSS 洗涤两次。然后使用带有自动载物台的荧光显微镜直接成像，或将培养板在 4 摄氏度避光保存以备后续使用。在本方案中，微血管持续灌注，并暴露于血管生成生长因子的梯度环境中。

采用被动泵送方法接种iPSC-ECs可实现均匀的接种密度。将液滴置于微流控通道入口上方的时间延时图像显示了液滴刚加入后的状态、液滴位于入口主通道上方的状态，直至液滴弯月面被入口固定，从而引发流向出口的流动。暴露于血管生成因子梯度环境中后，图案化胶原I凝胶内的微血管出现了定向的血管生成出芽。

加入促血管生成梯度后24小时，可见清晰的尖端细胞形成并侵入Ⅰ型胶原凝胶，而包括管腔形成在内的主体细胞则在48小时后可见。固定和染色后，可识别这些出芽结构的形态和长度。然而，在未添加生长因子的情况下，未观察到细胞向Ⅰ型胶原凝胶的侵入。

通过共聚焦成像，测定出芽直径并确认管腔形成。该方法可用于筛选新的血管生成抑制剂，有助于发现针对糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎和癌症的新疗法。

我们目前正在探索如何构建包含血脑屏障模型和血管化类器官的共培养体系。