Name: 标准化和可扩展的测定，以研究iPSC衍生内皮细胞在Vitro的渗透3D血管生成发芽 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 学习利用微流控平台培养iPSC衍生内皮细胞，研究三维血管生成发芽机制。该方法可高通量筛选血管生成抑制剂，为心血管疾病和癌症治疗提供新靶点。

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本工作部分得到了荷兰健康研究与发展组织（ZonMw）“以更少动物获得更多信息”计划（项目编号 114022501）的研究资助以及荷兰心脏基金会CVON联盟项目RECONNECT的资助。

1. 仪器准备
<ol>
	<li>将微流控384孔板转移至无菌超净工作台。</li>
	<li>取下盖子，使用多通道或重复移液器向40个观察孔（图1b，B2孔）中每孔加入50 µL水或磷酸盐缓冲液（PBS）。 
	注意：本实验方案可在此暂停。将盖子盖好后，将板置于室温（RT）下的无菌培养柜中保存。</li>
</ol>
2. 准备凝胶和包被
<ol>
	<li>准备 2.5 mL 浓度为 10 µg/mL 的纤连蛋白（FN）包被溶液。将 25 µL 浓度为 1 mg/mL 的纤连蛋白储备液用 2.5 mL 无钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）稀释。将溶液置于 37 °C 水浴中，待用。</li>
	<li>准备 100 µL 的 I 型胶原蛋白溶液。向 10 µL HEPES（1 M）中加入 10 µL NaHCO3（37 g/L），用移液器混匀。将离心管置于冰上，加入 80 µL 浓度为 5 mg/mL 的 I 型胶原蛋白，得到终浓度为 4 mg/mL 的中和 I 型胶原蛋白溶液。使用移液器小心混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>向每个微流控单元的凝胶入口（图 1b，孔 B1）加入 1.5 µL 的 I 型胶原蛋白溶液（4 mg/mL）。确保凝胶液滴位于每个孔的中央，以便凝胶进入通道（见 图 2a）。 
	注意： 相位引导结构可防止相邻通道被填充，从而实现凝胶的图案化。可通过明场显微镜观察“观察窗”（孔 B2）处弯月面的形成，或通过将板倒置来确认凝胶是否正确加载。如果凝胶未完全填充通道，可额外添加 1 µL 液滴。</li>
	<li>将微流控板放入培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育 10 分钟，使 I 型胶原蛋白聚合。 
	注意： 聚合时间至关重要；由于微流控系统中使用的体积较小，孵育 15 分钟后即可观察到蒸发现象，导致凝胶塌陷或收缩。</li>
	<li>从培养箱中取出板，转移至无菌超净工作台。</li>
	<li>向每个微流控单元顶部灌注通道的出口孔（图 1b，孔 A3）加入 50 µL 浓度为 10 µg/mL 的 FN 包被溶液。将移液器吸头紧贴孔壁，以确保正确填充孔而不夹入气泡（见 图 2b）。液体应充满通道并在入口处（孔 A1）形成钉扎，但不填充入口孔。</li>
	<li>将板放入培养箱（37 °C，5% CO2）中至少孵育 2 天。 
	注意： 此处可暂停实验流程，因为 I 型胶原蛋白凝胶与包被混合液在培养箱中至少可稳定保存 5 天。若更换包被混合液，可能延长保存时间，但尚未经过验证。关键在于 FN 包被的充分覆盖，以防止 I 型胶原蛋白凝胶脱水。</li>
</ol>
3. 细胞接种/微血管培养
<ol>
	<li>在500 mL基础内皮细胞培养基中加入5 mL胎牛血清和2.5 mL青霉素-链霉素溶液，使用孔径为0.22 µm的瓶顶滤器过滤除菌。此培养基现称为基础培养基。</li>
	<li>配制血管生长培养基：将3 µL浓度为50 µg/mL的血管内皮生长因子（VEGF）和2 µL浓度为20 µg/mL的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）加入5 mL基础培养基中。</li>
	<li>在37 °C水浴中快速解冻冻存的iPSC-ECs（&#60;1分钟），转移至15 mL离心管中，并用10 mL基础培养基稀释。</li>
	<li>对细胞进行计数。 
	注意：每支冻存管含有100万个细胞（体积为0.5 mL），细胞活力&#62;90%。</li>
	<li>以100 × g离心5分钟。吸除上清液时避免扰动细胞沉淀，用基础培养基重悬细胞，调整细胞浓度至2 × 107个细胞/mL。</li>
	<li>将微流控384孔板从培养箱转移至无菌超净工作台。</li>
	<li>从灌注出口孔（A3）吸除FN包被液，并在出口孔（A3孔）中加入25 µL基础培养基。</li>
	<li>在每个顶部灌注入口孔（图1b，A1孔）加入1 µL细胞悬液。液滴应在数秒内展平（参见图3a,b以了解该“被动泵送”方法的示意图）。 
	注意：在显微镜下检查接种是否均匀。若不均匀，可在出口孔再加入1 µL细胞悬液，并等待液滴展平。</li>
	<li>将微流控孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育1小时。此后细胞应已贴壁。若未完全贴壁，可继续孵育30分钟。</li>
	<li>从顶部灌注出口孔（图1b，A3孔）吸除基础培养基。在顶部灌注入口和出口孔（图1b，A1和A3孔）加入预热的血管培养基。将孔板放置于摇床上（设置倾斜角度为7°，摇动间隔为8分钟），放入培养箱（37 °C，5% CO2）中培养。</li>
	<li>接种后第1天和第2天，使用配备自动载物台的明场显微镜对孔板进行成像，以确认细胞活力。培养2天后，细胞应在胶原蛋白-1支架上形成融合的单层。 
	注意：若各通道融合程度不一致，可将微血管再继续培养24小时。</li>
</ol>
4. 研究血管生成出芽过程，包括顶端细胞和尾随细胞的形成
<ol>
	<li>通过在基础培养基中添加4.5 µL VEGF（50 µg/mL 储液）、4.5 µL 佛波酯12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）（2 µg/mL 储液）和2.25 µL 鞘氨醇-1-磷酸（S1P）（1 mM 储液），配制4.5 mL 血管生成出芽培养基。</li>
	<li>配制8.5 mL 血管生长培养基（在基础培养基中添加30 ng/mL VEGF 和20 ng/mL bFGF）。</li>
	<li>吸除各孔中的培养基，并在顶部灌注通道的入口和出口孔以及凝胶入口和出口孔中各加入50 µL 新鲜的血管培养基（图1b，孔A1、A3、B1 和B3）。</li>
	<li>在底部灌注通道的每个入口和出口孔中加入50 µL 血管生成出芽混合液（图1b，孔C1 和C3）。</li>
	<li>将装置放回培养箱（37 °C，5% CO2）中的摇床上，以形成血管生成生长因子的浓度梯度。</li>
	<li>在添加血管生成生长因子后第1天和第2天，使用配备自动载物台的明场显微镜进行成像。 
	注意：继续培养微血管以研究血管吻合（进入第5节），或在第2天和第6天固定并染色微血管，以定量分析出芽长度和形态（进入第6节）。</li>
</ol>
5. 研究吻合与芽枝稳定化
<ol>
	<li>使用带有自动载物台的明场显微镜进行成像。</li>
	<li>向顶部灌注入口（图1b，孔A1）加入1 µL荧光标记的白蛋白（0.5 mg/mL），并用50 µL移液器混匀。</li>
	<li>将培养板转移至配备自动载物台和37 °C培养箱的荧光显微镜中。设置显微镜物镜为10倍，并调整合适的曝光参数（例如，四甲基罗丹明[TRITC]通道，曝光时间20 ms）。每分钟采集一次时间序列图像，持续10分钟。</li>
	<li>将培养板从显微镜中取出，并转移至无菌超净工作台。</li>
	<li>吸除各孔中的全部培养基，并分别更换血管培养孔和血管新生出芽孔中的培养基（参见步骤4.3和4.4）。</li>
	<li>将装置重新放回培养箱（37 °C，5% CO2）中，继续培养以促进血管新生出芽。</li>
	<li>重复步骤5.1−5.6，以在第6天检测通透性。</li>
</ol>
6. 固定、染色与成像
<ol>
	<li>吸出所有孔中的培养基。 
	注意：由于微流控通道中的残留培养基或液体体积很小（1−2 µL），不会影响固定效果。</li>
	<li>向所有灌注入口（图1b，A1 和 C1）和出口孔（图1b，A3 和 C3）中加入 25 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液。室温孵育 10 分钟。将装置置于轻微倾斜角度（±5°），以诱导液体流动（例如，将板的一侧放在一个盖子上）。</li>
	<li>从孔中吸除 PFA。用 50 µL 的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）对所有灌注入口和出口清洗两次。吸除孔中的 HBSS。</li>
	<li>在室温下，向所有灌注入口和出口加入 50 µL 的 0.2% 非离子型表面活性剂，孵育 10 分钟以进行通透处理。</li>
	<li>从孔中吸除非离子型表面活性剂。向所有灌注入口和出口孔中各加入 50 µL HBSS，清洗灌注通道两次。吸除孔中的 HBSS。</li>
	<li>使用 Hoechst（1:2,000）染细胞核，使用鬼笔环肽（phalloidin，1:200）染 F-肌动蛋白，溶剂为 HBSS。为 40 个单元准备 2.2 mL 染色液，每个灌注入口和出口孔中加入 25 µL。将培养板置于轻微倾斜角度，室温避光孵育至少 30 分钟。</li>
	<li>在所有灌注入口和出口中用 50 µL HBSS 各清洗两次。</li>
	<li>使用配备自动载物台的荧光显微镜直接成像，或在 4 °C 避光保存以备后续使用。</li>
</ol>

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<li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23(2018).</li>
</ol>

P. Vulto 和 T. Hankemeier 是 Mimetas BV 的股东。V. Borgdorff 和 A. Reijerkerk 是 Ncardia BV 的员工。V. van Duinen、W. Stam、V. V. Orlova 和 A.J. van Zonneveld 无任何利益冲突披露。

本方法描述了在一种稳定且可扩展的微流控细胞培养平台上培养40个可灌注内皮微血管的技术。与传统的二维和三维细胞培养方法相比，该方法展示了如何将包含梯度和连续灌注的生理相关细胞微环境与三维细胞培养相结合，同时具备足够的通量以满足筛选需求。
相较于类似的微流控检测方法，本方法的一个主要优势在于其灌注过程不依赖泵，而是利用摇床平台同时在所有微流控单元中实现持续灌注。这确保了检测的稳健性和可扩展性：可将多块板堆叠放置于摇床平台上。重要的是，所有微流控单元仍可单独寻址，使得该方法可用于药物筛选，包括剂量-反应曲线的生成。此外，由于无需使用泵，成像和培养基更换操作更为简便，且交叉污染的风险显著降低。
该方法的另一个优势在于使用了标准化的预制造平台，而相比之下，其他微流控细胞培养平台需要由最终用户自行制备。这种即用性有助于该检测方法在其他学术和制药研究团队中的推广应用，从而促进实验的标准化。此外，与微流控原型不同，384孔板接口可确保与现有实验室设备（如吸液器、板架处理器和多通道移液器）的兼容性，便于整合到当前的筛选体系中。
进行该实验时有几个关键步骤。胶原蛋白-1凝胶应完全填充凝胶通道。在加样过程中，可通过观察窗（图2a）或翻转培养板使其倒置（如图1a所示）来观察微流控通道的填充情况。填充过程中，胶原蛋白凝胶应保持在中央通道内，不得流入相邻的灌注通道。我们注意到，胶原蛋白-1凝胶的质量对实验的正常进行至关重要。黏度过高的胶原蛋白-1批次会导致凝胶通道填充不完全。在37 °C下聚合10分钟后，凝胶应均匀且透明。若胶原蛋白-1储存不当（例如冰箱温度波动），胶原蛋白将在通道内发生聚合，并出现明显可见的纤维形成。这可能导致内皮细胞在未添加促血管生成因子的情况下侵入凝胶，但无法形成正常的管腔结构。
接种细胞时，需从孔中移除纤连蛋白包被溶液，仅保留微流控通道内充满包被溶液。若从微流控通道中抽吸包被溶液，可能导致凝胶破坏或凝胶被抽走。细胞悬液需要替换或置换该包被溶液。采用被动泵送法接种细胞悬液时效果最佳，因为直接将细胞悬液通过移液方式加入通道中，所获得的接种密度重复性较差。
当微血管在凝胶上形成稳定的单层时，这些微小差异仅导致达到汇合所需的时间不同。因此，该检测的起始点由细胞汇合度决定，而非培养时间。如有必要，可延长培养时间，直至在凝胶上形成清晰的单层细胞。
在加样孔中，若加样操作不当，可能会产生气泡（见图2b）。这些气泡会阻碍培养基的流动，即使将装置置于摇床上，也会导致微血管塌陷并影响浓度梯度的正常形成。将移液枪头轻轻抵住加样孔侧壁，有助于完全充满加样孔。若加样孔内已产生气泡，可通过将无菌移液枪头轻轻插入玻璃底部来去除。微流控通道内也可能出现气泡。当加样孔中的培养基被移除后，30分钟内即可观察到微流控通道中培养基的蒸发（由于通道内为微升级体积）。因此，更换培养基的操作应尽可能迅速。当向已有培养基蒸发的通道中添加培养基时，容易在微流控通道内形成气泡。这些微流控通道内的气泡可通过手动方式去除：将P20移液枪直接置于入口或出口处，并从相对的加样孔推动培养基流经微流控系统。成功去除气泡后，另一侧加样孔中的液体体积会出现微小但可察觉的减少。表1列出了常见错误及其相应的解决方法。
当需要连续成像时，缺乏泵是一个限制因素，因为摇板平台只能让用户在连续的时间间隔进行成像。此外，该平台中的培养基灌注为双向流动，剪切应力水平较低，而体内血管系统暴露于具有较高剪切应力的单向流动环境中。尽管我们未观察到双向流动对血管新生出芽产生负面影响，但流动是一种重要的生物力学刺激，最好能够加以控制。然而，尽管市面上已有商用的泵系统，但将其与384孔板整合仍然具有挑战性，且泵系统的使用会严重限制该检测方法的可扩展性。
利用诱导多能干细胞来源的内皮细胞（iPSC-ECs）研究血管生成出芽现象，为疾病建模和药物研发开辟了新的机遇。与原代内皮细胞相比，这些细胞可通过基因组编辑技术以近乎无限的数量生成，并具有稳定的基因型，还可构建基因敲除和敲入的细胞模型。然而，由于将诱导多能干细胞分化为内皮细胞的实验方案相对较新，目前尚不清楚哪些因素能够使iPSC-ECs最真实地模拟原代内皮细胞，以及能够生成或实际生成了哪些内皮细胞亚型。此外，关于其相关性的若干问题仍有待解答。例如，iPSC-ECs是否仍保留内皮细胞典型的可塑性？iPSC来源的细胞在多大程度上响应并与其细胞微环境相互作用？本文所介绍的标准化平台可用于回答其中一些问题，从而进一步验证iPSC来源内皮细胞在体外实验中的应用价值。
该检测方法最直接的未来发展方向是整合在血管生成过程中发挥重要作用的其他细胞类型，例如周细胞和巨噬细胞。这将有助于研究巨噬细胞在出芽之间吻合过程中的作用，或周细胞在毛细血管形成后的黏附行为。此外，还可以在细胞外基质内部或表面培养多种其他类型的细胞（例如，我们已展示了神经元以及多种上皮结构如近端小管和小肠的培养），这些可与本方法生成的血管网络相结合。最后，研究在合成水凝胶中的血管新生出芽也具有重要意义，因为合成水凝胶成分明确，可进一步提高检测的标准化程度，并允许调节影响细胞-基质相互作用的刚度和结合基序。
总之，该方法表明，在具有足够稳健性和可扩展性的平台上，结合生理相关的培养条件，使用iPSC来源的内皮细胞进行标准化且可扩展的3D血管生成检测是可行的，该平台可整合到药物筛选体系中。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 &#181;L of 10 &#181;g/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 &#181;L of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 &#181;L of basal medium in the outlet well (well A3).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59678">Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

体外模型在血管疾病新药物靶点的发现与验证中发挥着基础性作用。然而，目前具有足够通量的体外筛选模型其生理相关性有限1，这阻碍了体外研究结果向体内应用的转化。因此，为了推动临床前血管药物研究的发展，亟需建立兼具高通量筛选能力与生理相关三维细胞微环境的改进型体外血管模型。
在过去十年中，体外血管模型的生理相关性已取得显著进展。内皮细胞不再仅在组织培养塑料等平面表面培养，而是可以嵌入纤维蛋白和胶原凝胶等三维支架中2。在这些基质中，内皮细胞表现出更接近生理状态的表型，伴随基质降解和管腔形成。然而，这些模型仅再现了血管生成出芽过程中部分关键事件，仍缺乏细胞微环境中诸多重要信号的参与。
微流控细胞培养平台特别适用于进一步提高血管系统体外模型的生理相关性。例如，内皮细胞可暴露于剪切应力下，而剪切应力是血管系统重要的生物力学刺激因素。此外，微流控技术能够实现对流体的空间控制，从而形成生物分子浓度梯度3,4,5,6。此类梯度在体内血管生成过程中的形成与模式构建中发挥着重要作用。然而，尽管微流控细胞培养平台相较于传统的二维和三维细胞培养方法展现出无与伦比的生理相关性，但它们通常缺乏药物筛选所必需的通量、可扩展性和标准化程度7。此外，许多此类平台尚未商业化，用户需在使用前自行进行微加工制造8。这不仅需要专门的制造设备和技术知识，还限制了质量控制水平，并对实验的可重复性产生负面影响9。
迄今为止，原代人内皮细胞仍然是体外模拟血管生成最常用的细胞来源10。然而，原代人细胞存在若干局限性，限制了其在筛选方法中的常规应用。首先，由原代细胞建立的培养体系难以大规模扩增。因此，在进行大规模实验时需使用来自不同供体的细胞批次，导致基因组差异和批次间变异。其次，原代内皮细胞在体外培养经过数次传代后，通常会丧失相关特性11,12。
由人诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的内皮细胞是一种颇具前景的替代方案：它们与原代细胞相似，但具有更稳定的基因型，且易于进行精确的基因组编辑。此外，iPSC具有自我更新能力，因此可近乎无限地扩增，这使得iPSC来源的细胞成为体外筛选模型中替代原代细胞的理想选择13。
本文介绍了一种在标准化、高通量微流控细胞培养平台上培养可灌注三维微血管内皮细胞的方法。通过将装置置于摇床平台上实现灌注，从而确保系统稳定运行并提高实验的可扩展性。由于微血管持续受到灌注并暴露于血管生成因子梯度中，因此可在更接近生理状态的细胞微环境中研究血管生成出芽。尽管该方案适用于多种来源的（原代）内皮细胞14,15，但我们重点采用人诱导多能干细胞（iPSC）来源的内皮细胞（ECs），以提高该实验体系的标准化程度，并促进其在血管药物研究中的整合应用。

<table><tbody><tr><td>0.2-10 &amp;mu;L 电子重复移液器</td><td>Sigma</td><td>Z654566-1EA</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>3通道OrganoPlate</td><td>Mimetas</td><td>4003-400B</td><td></td></tr><tr><td>含4% PFA的PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td></td></tr><tr><td>基础培养基</td><td>NCardia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白-1</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01</td><td></td></tr><tr><td>Combitips Advanced Biopur 2.5 mL</td><td>VWR</td><td>613-2071</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Repeater M4 移液器</td><td>VWR</td><td>613-2890</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759-1MG</td><td>以milliQ水配制成1 mg/mL溶液</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td> Hoechst</td><td>Molecular Probes</td><td>H3569</td><td>以水配制成10 mg/mL溶液</td></tr><tr><td>iPSC来源的内皮细胞</td><td>NCardia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>以milliQ水配制成37 g/L溶液</td></tr><tr><td>OrganoPlate灌注摇床Mini</td><td>Mimetas</td><td></td><td>用于提供流动的摇床平台</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>以DMSO配制成1 mg/mL溶液</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Focus-Biomolecules</td><td>10-2165</td><td>以含0.1% DMSO的PBS配制成2 &amp;mu;g/mL溶液</td></tr><tr><td>S1P</td><td>Echelon Biosciences</td><td>S-2000</td><td>以含1%乙酸的甲醇配制成1 mM溶液</td></tr><tr><td>TRITC标记的白蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>A34786</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>Peprotech</td><td>450-32-10</td><td>以含0.1% BSA的水配制成50 &amp;mu;g/mL溶液</td></tr></tbody></table>

体外研究诱导多能干细胞来源内皮细胞灌注三维血管生成出芽的标准化与可扩展检测方法

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

血管疾病的新药临床前研究需要适用于高通量筛选的血管体外模型。然而，目前具备足够通量的体外筛选模型其生理相关性有限，这阻碍了体外研究结果向体内应用的转化。另一方面，微流控细胞培养平台在体外展现出无与伦比的生理相关性，但往往缺乏所需的通量、可扩展性和标准化能力。本文展示了一种稳健的平台，用于在包含灌注和浓度梯度的生理相关细胞微环境中，研究来源于人诱导多能干细胞的内皮细胞（iPSC-ECs）的血管生成过程。iPSC-ECs 在图案化的一型胶原支架上培养，形成40个可灌注的三维微血管结构。在施加血管生成因子梯度后，可研究血管生成的关键特征，包括分化为顶端细胞和茎秆细胞，以及可灌注管腔的形成。通过荧光示踪染料进行灌注，可在血管生成出芽的融合过程期间及之后研究其通透性。综上所述，该方法证明了在标准化且可扩展的三维血管生成检测体系中，使用iPSC来源的内皮细胞的可行性；该平台兼具生理相关的培养条件，以及足够的稳健性和可扩展性，可整合至药物筛选体系中。

微流控3D细胞培养平台包含40个灌注式微流控单元（图1a,b），用于研究灌注微血管在图案化胶原蛋白-1凝胶上的血管生成出芽（图1c）。这些微血管持续接受灌注，并暴露于血管生成生长因子的浓度梯度中（图3a-d）。血管生成出芽可在建立浓度梯度后2天进行观察，也可在梯度暴露5天以上继续培养，以研究血管吻合及出芽的稳定过程（见时间线，图1d）。
采用被动泵送方法接种iPSC-ECs应获得均匀的接种密度（图4a,b）。在持续灌注条件下培养2天后形成融合的微血管，细胞完全覆盖微流控通道的整个周长，并在图案化胶原蛋白-1凝胶表面形成融合的单层结构。
暴露于促血管生成因子梯度后，图案化胶原蛋白-1凝胶内的微血管出现了定向的血管新生出芽（图5a-g）。在添加促血管生成因子梯度24小时后，可观察到明显的顶端细胞形成并侵入胶原蛋白-1凝胶；而在48小时后，可观察到包括管腔形成在内的柄细胞结构（图5a）。
固定和染色后，可使用鬼笔环肽（phalloidin）染色F-肌动蛋白，以及使用Hoechst 33342染色细胞核，从而观察毛细血管网络（图5b,c）。这些出芽结构可进行定量分析（例如，形态和长度14）。若未添加生长因子，则不应观察到向I型胶原凝胶中的侵袭现象（图5d）。采用共聚焦成像来测定出芽直径，并确认管腔的形成（图5e-g）。
在加入促血管生成生长因子后3−4天内，血管 sprouts 持续向梯度方向生长，并到达对侧灌注通道。这导致血管网络发生重塑，血管生成 sprouts 的数量明显减少（图6a）。通过向血管网络灌注荧光标记的大分子物质（如白蛋白或葡聚糖）来评估管腔的形成。在吻合前后，分别用0.5 mg/mL标记的白蛋白灌注微血管，10分钟后可观察到sprouts通透性的明显差异（Figure 6b-e），这表明毛细血管在吻合后趋于稳定并逐渐成熟。
<img alt="显示iPSC-EC培养和血管生成过程时间线的微流控装置与孔板设置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：诱导多能干细胞来源微血管的微流控细胞培养方案。（a）显示微流控细胞培养装置底部，其下方集成了40个微流控单元，位于384孔板下方。放大图展示40个微流控单元中的一个。（b）每个微流控单元位于9个孔下方，包含3个进样孔和3个出样孔。微流控通道之间由脊状结构（“相位引导结构”，phaseguides）分隔，可在中央通道（“凝胶通道”）中实现水凝胶的图案化，同时仍与相邻通道（“灌注通道”）保持接触。（c）在微流控装置内培养灌注型微血管的方法，用于研究通过图案化I型胶原基质的梯度驱动血管生成出芽。（d）研究血管生成出芽和/或吻合的时间线。本图经van Duinen等14修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微流控通道凝胶加样示意图，展示液滴放置和培养基填充过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：凝胶与培养基的加样步骤。（a）正确与错误的凝胶沉积示例。正确加样可在中间通道形成有序的胶原蛋白-1 凝胶，随后进行聚合。（b）正确与错误的加样孔填充示例。加样孔应按 1−4 的顺序填充，以防止微流控通道内产生气泡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控流动梯度示意图；静水压、双向流动系统，梯度稳定结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：由连续静水压驱动的流动与梯度稳定。（a）孔间静水压差导致微流控通道内发生被动平衡和流动。（b）将装置置于设定为7°倾角和8分钟周期的摇床平台上，可在微流控通道内实现持续的双向灌注。（c）通过在孔中引入两种不同浓度的溶液，并借助被动平衡持续更新，从而形成浓度梯度。（d）使用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran）进行梯度可视化。双向流动可使梯度稳定维持长达3天。比例尺 = 200 µm。本图改编自van Duinen等14。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="被动泵送示意图和微流控液滴流动；显示压力控制，箭头指示流动方向。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4： 用于细胞接种的被动泵送方法。 （a）被动泵送由表面张力差异引起的压力差驱动。这导致液体从液滴（内部压力高）流向储液池（内部压力低）。（b）将液滴（灰色轮廓）置于微流控通道入口（白色轮廓）上方时的时间序列图像（蓝色轮廓）。添加后立即（图 4b, i），入口上方的液滴开始缩小（图 4b, ii：添加后 1 s；iv：添加后 2 s），从而产生向出口方向的流动。此过程持续进行，直到液滴弯月面被入口处钉扎住（图 4b, iv）。比例尺 = 400 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移研究；显微图像；延时分析、细胞排列、结构变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：iPSC-EC 微血管的稳健三维出芽。 （a）iPSC-EC 随时间推移的出芽情况。微血管培养 48 小时（右）后，用含 50 ng/mL VEGF、500 nM S1P 和 2 ng/mL PMA 的促血管生成混合物进行刺激。暴露 24 小时后，可见侵入胶原蛋白-1 支架的首批顶端细胞（中）。暴露 48 小时后，可见首个管腔（箭头）（右），同时顶端细胞已沿梯度方向进一步迁移。（b）经 VEGF、S1P 和 PMA 刺激 2 天的 15 个微血管阵列，对 F-actin（黄色）和细胞核（蓝色）进行染色。比例尺 = 200 µm。（c）经刺激的微血管（阳性对照）。（d）未经刺激的微血管（阴性对照）。（e）凝胶内单个毛细血管的最大投影。（f）与（g）相同，但聚焦于中间层面。虚线表示面板 g 中正交视图的位置。比例尺（a-d：200 µm；e-g：20 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控，真菌生长分析，延时显微图像，动态监测，0-10 分钟" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59678/59678fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：血管新生芽在吻合前后通透性的可视化。（a）与基底通道发生吻合后，触发血管新生芽的修剪和成熟过程。在加入血管生成生长因子后第 2、4、6 和 7 天，毛细血管床的局部放大图像。（b）加入血管生成生长因子 2 天后的血管新生芽。新生芽已在凝胶内形成，但尚未与底部灌注通道连接。（c）用含 0.5 mg/mL 白蛋白-Alexa 555 的溶液对微血管进行灌注。分别在 0 和 10 分钟时获取的荧光图像。（d,e）与 b 和 c 图相同条件，但在刺激 7 天后。新生芽已与对侧连接，并在基底灌注通道中形成连续的微血管。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59678/59678fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>问题</td>
			<td>原因</td>
			<td>解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">胶原蛋白-1 未进入或未完全填充通道</td>
			<td>胶原蛋白-1 液滴未放置在入口上方</td>
			<td>小心地将液滴从凝胶通道一侧放置在入口正上方</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶原蛋白-1 体积过小</td>
			<td>使用 1.5 µL 凝胶以完全填充通道</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶原蛋白-1 黏度过高</td>
			<td>更换另一批次的胶原蛋白-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶原蛋白-1 流入灌注通道</td>
			<td>将胶原蛋白-1 直接通过移液加入凝胶通道的入口</td>
			<td>小心地将液滴从凝胶通道一侧放置在入口正上方</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">胶原蛋白-1 不透明/出现纤维形成</td>
			<td>胶原蛋白-1 储存不当</td>
			<td>将胶原蛋白-1 储存于 4 °C，切勿冷冻</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>加入胶原蛋白-1 前，NaHCO3 和 HEPES 未充分混匀</td>
			<td>在加入胶原蛋白-1 前，通过移液仔细混匀 NaHCO3 和 HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">使用被动泵送法时液滴未收缩</td>
			<td>液滴黏附在孔壁上</td>
			<td>吸除液滴，并在入口上方重新添加新的液滴</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>确保出口孔中至少含有 20 µL 培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">未观察到出芽现象</td>
			<td>未添加生长因子，或分装后储存不当</td>
			<td>配制新鲜的促血管生成出芽培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>气泡阻碍灌注/梯度形成</td>
			<td>使用 P20 或 P200 移液器去除气泡</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>各孔之间体积不一致</td>
			<td>所有孔中的体积必须相等，以形成线性梯度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">细胞无活性</td>
			<td>培养板未放置在摇床上，或摇床已关闭</td>
			<td>确保摇床处于开启状态，并设置正确的循环时间/角度（8 分钟/7°）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>因存在气泡导致无法灌注</td>
			<td>使用 P20 或 P200 移液器去除气泡</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未形成管腔，细胞以单细胞形式迁移</td>
			<td>在单层细胞尚未形成时即添加了促血管生成出芽混合物</td>
			<td>在添加促血管生成生长因子前，额外等待 24 小时</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>出芽数量存在显著差异</td>
			<td>接种后细胞密度不一致</td>
			<td>检查各微流控单元之间的细胞密度是否均匀且可比；必要时添加另一滴细胞悬液</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：常见错误的故障排除。

本方法描述了在标准化的微流控平台上培养由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的内皮细胞，形成40条可灌注的三维微血管。该平台能够以可扩展且高通量的方式研究三维环境中由浓度梯度驱动的血管生成出芽过程，包括出芽的吻合及稳定化。

血管疾病药物的临床前研究需要适用于高通量筛选的体外血管模型。然而，目前的……

该体外实验在高通量且可扩展的平台上展示了血管生成性出芽。该方法可用于发现血管生成中的新靶点。该血管生成实验结合了包含梯度和灌注的复杂细胞微环境，并与高通量筛选平台兼容。血管生成在健康和疾病中均发挥着重要作用。了解血管生成过程中发生的机制，有助于我们理解癌症的生长方式以及组织的修复过程。该方法可为心血管疾病和组织再生过程中的机制提供深入见解。在这两种情况下，血管生成都起着重要作用。首次使用该微流控平台时，您需要了解体积定律以及如何进行移液操作。您可以通过在显微镜下观察或把培养板倒置过来确认操作步骤。仅阅读方法时，某些步骤可能难以掌握，例如微流控通道的实际尺寸有多小，或如何持握培养板。这些操作将由本实验室的技术员 Wendy Stam 演示。首先，将微流控 384 孔板转移至无菌超净工作台。使用多通道移液器，向40个观察孔中的每一个加入50微升水或磷酸盐缓冲盐水，然后打开盖子。接着，向每个微流控单元的凝胶入口加入1.5微升浓度为4毫克/毫升的I型胶原溶液。确保将凝胶液滴置于每个孔的中央，以便凝胶进入通道。填充五个微流控单元后，将培养板倒置，目视检查凝胶通道是否填充正确。将微流控板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育10分钟，使I型胶原蛋白聚合。然后将培养板从培养箱中取出，转移至无菌超净工作台中。向每个微流控单元顶部灌注通道的出口孔中加入50微升浓度为10微克/毫升的纤维连接蛋白编码溶液。将移液器吸头紧贴孔壁，以正确填充孔洞并避免产生气泡。通道会充满液体，液体将覆盖出口端，但不会填满出口孔。然后将培养板放入培养箱中孵育至少两天。现在，将冻存的iPSC-ECs在37摄氏度水浴中快速解冻，时间少于一分钟。随后将细胞转移至15毫升离心管中，并缓慢加入10毫升基础培养基以稀释。吸取10 µL溶液，在细胞计数仪上进行细胞计数。将离心管以100 ×g离心5分钟。吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后用基础培养基重悬，使细胞浓度达到2 × 10⁷ 个细胞/毫升。接下来，将微流控384孔板从培养箱转移至无菌超净工作台。从灌注出口吸除纤连蛋白编码溶液，并在出口孔中加入25 µL基础培养基。在每个顶部灌注入口孔中加入1 µL细胞悬液。 液滴在数秒内变平。在显微镜下检查单个通道内及通道间的接种是否均匀。将微流控培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1至1.5小时。此后，检查细胞以确认其已贴壁。从顶部灌注出口孔中移除基础培养基。在顶部灌注入口和出口中加入预热的血管培养基。将培养板置于摇床上，摇床设置为7度倾角，摇动间隔为8分钟，并放入培养箱中。接种后第1天和第2天，使用配备自动载物台的明场显微镜对培养板进行成像，以确认细胞活性。两天后，细胞已在胶原蛋白I型支架上形成融合的单层。首先，通过在4.5毫升基础培养基中添加4.5微升VEGF储备液、4.5微升PMA储备液和2.25微升S1P储备液，配制4.5毫升血管生成出芽培养基。通过在基础培养基中添加5.1微升VEGF和3.4微升bFGF，配制8.5毫升血管生长培养基。吸除各孔中的培养基，并在顶部灌注进样孔和出样孔以及凝胶进样孔和出样孔中各加入50微升新鲜的血管培养基。然后向底部灌注通道的入口和出口孔各加入 50 µL 血管生成芽体混合物。将培养板放回摇床上的培养箱中，以形成血管生成生长因子的浓度梯度。在添加血管生成生长因子后的第 1 天和第 2 天，使用明场显微镜在自动载物台上对各孔进行成像。为了研究吻合形成和芽状结构的稳定，向顶部灌注入口加入一微升浓度为每毫升零点五毫克的荧光标记白蛋白。然后使用五十微升移液器混匀溶液。将培养板转移至配备自动载物台和设定为三十七摄氏度的培养箱的荧光显微镜下进行观察。将显微镜设置为10倍物镜，并调整曝光参数。每分钟采集一次时间序列图像，持续10分钟。从显微镜上取出培养板，转移至无菌超净工作台。吸出各孔中的全部培养基，并更换相应孔中的血管培养基和血管生成出芽培养基。将微流控板放回培养箱中，继续进行血管生成出芽培养。在第6天重复成像，以研究通透性。为固定细胞培养物，从各孔中吸除所有培养基。向所有灌注入口和出口孔中加入25微升4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液。然后将微流控板的一侧置于盖子上，倾斜约五度，以诱导液体流动。室温孵育10分钟。随后，吸除孔中的PFA。用50 µL HBSS对所有灌注入口和出口清洗两次。然后从孔中吸除HBSS。甲醛是一种危险化学品，操作时应佩戴手套，并且只能在通风橱中打开。接着，向所有灌注入口和出口加入50 µL 0.2%非离子型表面活性剂，在室温下透化10分钟，并将微流控板以约五度的倾斜角度放置在盖子上。吸出各孔中的非离子型表面活性剂，并向所有灌注通道的进样孔和出样孔中加入50 µL HBSS，洗涤两次。吸出孔中的HBSS。用HBSS配制1,000至2,000倍稀释的Hoechst用于细胞核染色，并用HBSS配制100至200倍稀释的鬼笔环肽（Phalloidin）用于F-actin染色。在Falcon管中加入6毫升HBSS、30微升F-actin和3微升Hoechst。然后向每个灌注入口和出口孔中各加入25微升。将培养板置于轻微倾斜的位置，在室温下孵育至少30分钟。在所有灌注入口和出口中，用 50 微升 HBSS 洗涤两次。然后使用带有自动载物台的荧光显微镜直接成像，或将培养板在 4 摄氏度避光保存以备后续使用。在本方案中，微血管持续灌注，并暴露于血管生成生长因子的梯度环境中。采用被动泵送方法接种iPSC-ECs可实现均匀的接种密度。将液滴置于微流控通道入口上方的时间延时图像显示了液滴刚加入后的状态、液滴位于入口主通道上方的状态，直至液滴弯月面被入口固定，从而引发流向出口的流动。暴露于血管生成因子梯度环境中后，图案化胶原I凝胶内的微血管出现了定向的血管生成出芽。加入促血管生成梯度后24小时，可见清晰的尖端细胞形成并侵入Ⅰ型胶原凝胶，而包括管腔形成在内的主体细胞则在48小时后可见。固定和染色后，可识别这些出芽结构的形态和长度。然而，在未添加生长因子的情况下，未观察到细胞向Ⅰ型胶原凝胶的侵入。 通过共聚焦成像，测定出芽直径并确认管腔形成。该方法可用于筛选新的血管生成抑制剂，有助于发现针对糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎和癌症的新疗法。我们目前正在探索如何构建包含血脑屏障模型和血管化类器官的共培养体系。

standardized-scalable-assay-to-study-perfused-3d-angiogenic-sprouting

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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