Name: LC-MCYMS 诊断碎裂过滤的天然产物发现: 微囊藻毒素分析的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 了解诊断碎裂过滤方法在MZmine软件中用于天然产物发现的应用。该技术通过分析微囊藻毒素等复杂混合物中的质谱数据，帮助研究人员识别新的生物活性化合物和毒素，提升食品安全与环境监测能力。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢加拿大藻类培养中心（滑铁卢大学）的Heather Roshon提供本研究所用的蓝细菌培养物，以及卡尔顿大学的Sawsan Abusharkh提供的技术协助。

1. 非靶向液相色谱（LC）-MS/MS 数据集的制备
注意：DFF 可使用任何高分辨率质谱仪以及针对目标分析物类别优化的分析方法进行。在 Orbitrap 质谱仪上经 MC 优化的 LC-MS/MS 条件见材料表。
<ol>
	<li>下载 MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) 
	注：示例数据 CPCC300.raw 可在以下网址获取：https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0。
	<ol>
		<li>在 原始数据方法 下拉菜单中，选择 原始数据导入 选项。</li>
		<li>选择要分析的数据文件。可导入单个或多个文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）如果 MZmine 不支持厂商数据格式，请使用 Proteowizard16 生成去卷积的 .mzml 数据文件。
	<ol>
		<li>选择 峰提取 滤镜，以应用厂商提供的去卷积算法。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 导入的 DDA 文件的诊断性碎裂过滤
<ol>
	<li>使用光标选择并高亮所需的數據文件 原始数据文件 主 MZmine 界面的列。</li>
	<li>在……之下 可视化 下拉菜单，选择 诊断性碎裂过滤 选项</li>
	<li>在出现的 DFF 对话框中（图3），输入以下选项：
	<ol>
		<li>保留时间——使用 自动量程 或定义目标分析物类别洗脱时的保留时间范围（以分钟为单位）。</li>
		<li>前体 m/z - 使用 自动量程 或定义 m/z 目标分析物类别的范围，包括在适当情况下对多电荷化合物的检测可能性。</li>
		<li>m/z 耐受性 – 输入质谱仪可达到的二级质谱质量精度；对于Orbitrap平台，0.01 m/z 或 3.0 ppm 是合适的。如果仅研究诊断性碎片离子，请输入 0.0 进入 诊断性中性丢失值（Da） 选项。相反，如果仅研究诊断性中性丢失，则输入 0.0 进入 诊断性产物离子（m/z) 选项</li>
		<li>诊断性产物离子（m/z) – 输入类别特异性产物离子(s) m/z用逗号分隔多个产物离子。 
		注意：输入多个产物离子将显示包含所有列出产物离子的质谱图。</li>
		<li>诊断性中性丢失值（Da） 输入该类别特有的中性丢失值。多个中性丢失值之间用逗号分隔。 
		注意：输入多个中性丢失项将显示包含所有所列中性丢失的质谱图。同时输入诊断性产物离子和中性丢失项，将显示满足所有条件的质谱图。</li>
		<li>最低诊断离子强度（% 基峰） – 以MS/MS谱图基峰强度的百分比表示，设定用于判断诊断性产物离子和/或中性丢失的最小强度阈值。</li>
		<li>峰列表输出文件 – 选择输出结果的路径和文件名。</li>
		<li>点击 好的 单击按钮以开始DFF分析。成功完成上述步骤后，将显示DFF图。 
		注意：将生成两个 .csv 数据文件。 {峰列表输出文件}.csv 含有前体 m/z，扫描编号以及扫描的保留时间。这可用于现有的 MZmine 模块，包括 原始数据方法 &#62; 峰检测 &#62; 靶向峰检测 生成符合定义的DFF标准的前体离子的提取离子色谱图。 {峰列表输出文件}_data.csv 含有前体 m/z，产物离子 m/z 以及保留时间，以便在 MZmine 外生成 DFF 图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. DFF 在微囊藻毒素分析中的应用示例
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>将装有30 mL无菌MA培养基17或其他蓝藻生长培养基（BG-11）并配有泡沫塞的250 mL锥形瓶进行灭菌。</li>
		<li>在无菌条件下，将蓝藻培养物接种至灭菌后的培养基中，细胞浓度约为5 × 105 cells mL-1。使用血细胞计数板监测细胞密度。本示例中，将铜绿微囊藻（M. aeruginosa）菌株CPCC300在27 °C下以光能自养方式培养，采用冷白荧光灯照明（30 µE m-2 s-1），光照周期为12小时光照：12小时黑暗。每天轻轻摇动培养物一次。</li>
		<li>培养26天后，通过真空过滤法使用直径为47 mm的GF/C玻璃微纤维滤膜将细胞与培养基分离。</li>
		<li>向收集的细胞中加入3 mL 80%甲醇(aq)至14 mL试管中。</li>
		<li>对含有蓝藻细胞的试管进行涡旋振荡，随后超声处理，每次30秒。将试管置于-20 °C下保存1小时。然后将试管恢复至室温，并让样品解冻15分钟。</li>
		<li>重复步骤3.1.5两次，以有效裂解细胞。</li>
		<li>将所得的蓝藻细胞提取物通过0.22 μm PTFE针筒滤器过滤。</li>
		<li>在30 °C下使用氮气缓流通过蒸发仪干燥提取物。干燥后将提取物储存在-20 °C，直至进行LC-MS/MS分析。</li>
		<li>分析前，在棕色HPLC小瓶中用500 µL 90%甲醇(aq)重新溶解干燥残留物，并涡旋振荡30秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用DDA采集模式在高分辨质谱仪上分析蓝藻提取物。 
	注：本实验所用MC分析的优化LC-MS条件见材料表。</li>
	<li>准备DDA数据文件，并按照步骤1.1和1.2导入MZmine软件。</li>
	<li>选择数据文件，并按照步骤2.1–2.2启动DFF模块。</li>
	<li>进行MC分析时，在DFF模块中使用以下设置（图3）。
	<ol>
		<li>保留时间 — 输入范围为2.00至6.00分钟。</li>
		<li>前体离子m/z — 输入m/z范围为430.00至1200.00。</li>
		<li>m/z容差 — 设置m/z容差为0.01 m/z或3.0 ppm。</li>
		<li>特征性产物离子（m/z） — 输入135.0803, 163.1114作为特征性产物离子的m/z值。</li>
		<li>特征性中性丢失值（Da） — 输入0.0，表示不使用任何特征性中性丢失。</li>
		<li>最小特征离子强度（%基峰） — 使用15.00作为最小强度阈值。</li>
		<li>峰列表输出文件 — 将输出文件定义为putative_MCs.csv。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击确定按钮以启动DFF分析。成功完成上述步骤后，将显示DFF图谱（图4）。</li>
</ol>

<ol><li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li>
<li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS%E2%80%93NRPS%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li>
<li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li>
<li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828(2016).</li>
<li>Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%3A+An+International+Journal+Devoted+to+the+Rapid+Dissemination+of+Up-to-the-Minute+Research+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li>
<li>Bartók, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+%28FB1%29+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395(2010).</li>
<li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendix+3%3A+tables+of+microcystins+and+nodularins%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+cyanobacterial+monitoring+and+cyanotoxin+analysis%22%5BJournal%5D)">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li>
<li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blooming+algae%3A+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Fisheries+and+Aquatic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li>
<li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms%3A+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+algae%22%5BJournal%5D)">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li>
<li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+microcystins+by+LC%2FMS%2FMS+under+ion+trap+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antibiotics%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710(2006).</li>
<li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li>
<li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoWizard%3A+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li>
<li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+%28Microcystis+aeruginosa%29+under+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li>
<li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li>
<li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions%3A+differences+of+electrospray+ionization%2Fcollision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda%5BTitle%5D)+AND+%22European+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li>
<li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+%26+technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science & technology. 48 (4), 2097(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

DFF 是一种直接且快速的策略，可用于检测整类化合物，尤其适用于天然产物化合物的发现。DFF 最关键的环节是确定目标化合物类别的特异性 MS/MS 碎裂标准。在此代表性示例中，DFF 被用于检测铜绿微囊藻（M. aeruginosa）细胞提取物中所有含 Adda 残基的微囊藻毒素（MCs）。尽管绝大多数 MCs 均含有 Adda 残基，但已知该位置也可能存在其他残基，特别是去甲基-和乙酰去甲基-Adda 变体19。使用所定义的标准将无法检测到含有这些残基的 MCs。然而，由于 DFF 是一种数据采集后的分析方法，分析人员可利用本文所述的简单逐步操作流程，在同一数据集上轻松地进一步考察其他诊断性碎片离子。这种方法还允许分析人员检测具有假设性修饰的化合物，这些修饰可能改变诊断性产物离子和/或中性丢失特征。
加合物和源内碎片也可能满足DFF标准，从而被错误地解读为独特的分析物。当提取物中其他化合物表现出相同的产物离子和/或中性丢失时，可能会产生假阳性结果。在这两种情况下，均可通过使用额外的产物离子和中性丢失来提高方法的选择...

串联质谱法（MS/MS）是一种广泛应用的质谱技术，其过程包括选择一个前体离子，并通过施加激活能（例如碰撞诱导解离，CID）诱导其发生碎裂via应用激活能，如碰撞诱导解离（CID）1。离子的碎裂方式与其分子结构密切相关。天然产物通常以结构相似化合物的混合物形式生物合成，而非单一独特的化学物质2。因此，属于同一生物合成类别的结构相关化合物通常共享关键的MS/MS碎裂特征，包括共同的产物离子和/或中性丢失。能够筛选复杂样品中具有类别特异性产物离子和/或中性丢失的化合物，是一种强大的策略，可用于检测整类化合物，有望发现新的天然产物3,4,5,6。几十年来，研究人员已在低分辨仪器上采用中性丢失扫描和前体离子扫描等质谱方法，检测具有相同中性丢失或产物离子的离子。然而，这些方法需要在实验前预先定义特定离子或跃迁。随着高分辨质谱仪在科研实验室中日益普及，复杂样品现在通常采用非靶向、数据依赖性采集（DDA）方法进行筛查。与传统的中性丢失扫描和前体离子扫描不同，结构相关化合物可通过采集后的数据分析进行识别7。在本研究中，我们展示了一种我们开发的策略，称为诊断性碎裂过滤（DFF）5,6，这是一种简单且用户友好的方法，用于在复杂基质中检测整类化合物。该DFF模块已集成至开源平台MZmine 2中，可通过下载MZmine 2.38或更新版本获取。DFF允许用户高效地筛查DDA数据集，寻找包含对整类化合物具有诊断意义的产物离子和/或中性丢失的MS/MS谱图。DFF的一个局限性在于，某类化合物的特征性产物离子和/或中性丢失必须由分析人员预先定义。
例如，已鉴定的60多种不同的伏马菌素霉菌毒素8,9均具有三羧丙酸侧链，在[M-H]-离子碎裂时会产生m/z 157.0142（C6H5O5-）的产物离子4。因此，可通过DFF方法筛选DDA数据集中所有包含显著的m/z 157.0142产物离子的MS/MS谱图，从而检测样品中所有可能存在的伏马菌素。类似地，可通过在DDA数据集中筛选包含特征性中性丢失79.9574 Da（SO3）的MS/MS谱图来检测硫酸化化合物3。该方法也已成功应用于检测新型环肽5以及含有色氨酸或苯丙氨酸残基的天然产物6。
为了展示DFF方法在MZmine平台中的有效性及其使用的便捷性10，我们将该方法应用于微囊藻毒素（MCs）的分析；微囊藻毒素是一类由淡水蓝藻产生的、包含240多种结构相关毒素的化合物11,12,13。
最常报道的蓝藻毒素是微囊藻毒素（MCs），其中微囊藻毒素-LR（MC-LR，亮氨酸[L]/精氨酸[R]）同系物被研究得最为广泛（图1）。MCs 是由多种蓝藻属生物合成的单环非核糖体七肽， 微囊藻、鱼腥藻、念珠藻 和 Planktothrix12,13肥大细胞由五种常见残基和两个被L-氨基酸占据的可变位置组成. 几乎所有微囊藻毒素（MCs）在第5位均具有一个特征性的β-氨基酸残基，即3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-二烯癸酸（Adda）11. &#160;MCs 的二级质谱碎裂途径已有充分描述14,15；Adda残基是产生显著的MS/MS碎片离子的原因， m/z 135.0803+ (C9H11O+）以及其他产物离子，包括 m/z 163.1114+ (C11H15O+) (图2）。非靶向 DDA 数据集 Microcystis aeruginosa 只要微囊藻毒素含有Adda残基，即可利用这些诊断离子对细胞提取物中存在的一切微囊藻毒素进行筛查。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;蓝细菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Microcystis aeruginosa&lt;/em&gt;CPCC300</td><td>加拿大藻类培养中心</td><td>CPCC300</td><td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteowizard（软件）</td><td></td><td>软件</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td></tr><tr><td>Mzmine 2</td><td></td><td>软件</td><td>http://mzmine.github.io/</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;液相色谱-质谱（LC-MS）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap</td><td>Thermo</td><td>-</td><td>配备HESI电离源</td></tr><tr><td>1290 UHPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>配备二元泵、自动进样器、柱温箱</td></tr><tr><td>C18色谱柱</td><td>Agilent</td><td>959757-902</td><td>Eclipse Plus C18 RRHD色谱柱（2.1 &amp;times; 100 mm，1.8 &amp;mu;m）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;溶剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima LC-MS级甲醇</td><td>Fisher</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Optima LC-MS级乙腈</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Optima LC-MS级水</td><td>Fisher</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS级甲酸</td><td>Fisher</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-772-436</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琥珀色HPLC小瓶，2 mL/瓶</td><td>Agilent</td><td>5182-0716/5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>0.2-&amp;mu;m PTFE针式过滤器</td><td>Pall Corp.</td><td>4521</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 47 mm GF/A玻璃微纤维滤膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1820047</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;MA培养基（pH 8.6）（每升用量）&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Watanabe, M. F. &amp; Oishi, S. 培养条件下环境因子对蓝细菌（Microcystis aeruginosa）毒性的效应。应用与环境微生物学。49 (5), 1342-1344 (1985)。</td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2786</td><td></td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8291</td><td></td></tr><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5022</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，40 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5640</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&amp;middot;&lt;/sub&gt;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0，50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>甘油磷酸钠，100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，20 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bicine，500 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES1151B-B7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&lt;strong&gt;P(IV)金属溶液，5 mL&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;用ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O定容至1 L&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaEDTA&amp;middot;2HO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot;6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Baker</td><td>2540</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Baker</td><td>3764</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;蓝细菌BG-11 50倍淡水溶液&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

天然产物发现中的lc-ms/ms诊断性碎片过滤技术：应用于微囊藻毒素分析

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

天然产物通常以结构相似化合物的混合物形式生物合成，而非单一化合物。由于具有共同的结构特征，同一类别的许多化合物会经历类似的串联质谱（MS/MS）碎裂过程，并产生多个相同的产物离子和/或中性丢失。诊断性碎裂筛选（DFF）的目的是通过在非靶向的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据集中筛选出包含特定类别产物离子和/或中性丢失的MS/MS谱图，从而高效地检测复杂提取物中属于某一类别的所有化合物。该方法基于开源MZmine平台中的DFF模块，要求样品提取物通过高分辨质谱仪（如四极杆Orbitrap或四极杆飞行时间质谱分析器）进行数据依赖性采集分析。该方法的主要局限在于，分析人员必须首先确定哪些产物离子和/或中性丢失对该目标天然产物类别具有特异性。DFF能够进一步发现复杂样品中所有相关的天然产物，包括新化合物。在本研究中，我们通过筛选铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）的提取物，验证了DFF的有效性；铜绿微囊藻是一种引发有害藻华的重要蓝藻，可产生微囊藻毒素。

对铜绿微囊藻（M. aeruginosa）CPCC300进行分析后生成的DFF图谱如图4所示。该图谱的x轴表示满足设定DFF标准的前体离子的m/z值，而y轴则显示微囊藻毒素（MCs）MS/MS谱图中所有产物离子的m/z值。本次分析中，MC检测的标准包括：前体离子的m/z范围在440–1200之间，保留时间在2.00–6.00分钟之间。最重要的是，这些MS/MS谱图中均包含m/z 135.0803和163.1114（± 3 ppm），且其强度高于设定的基峰强度阈值（15%）。在该条件下，LC-MS/MS DDA分析共采集到4116张MS/MS谱图。其中，有26张谱图满足DFF标准，并在铜绿微囊藻（M. aeruginosa）CPCC300提取物中被检测到。然而，同一种化合物可能被采集到多张MS/MS谱图，尤其是高丰度离子。在该提取物中，仅发现18个独特的前体离子m/...

将诊断性碎裂过滤技术应用于MZmine，是一种优雅的采集后方法，可用于筛查液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据集中的已知和未知天然产物的整个类别。该工具会搜索二级质谱（MS/MS）谱图中由分析人员预先定义为表征该类化合物特征的产物离子和/或中性丢失片段。

天然产物发现中的LC-MS/MS诊断性碎片过滤技术：应用于微囊藻毒素分析

天然产物通常以结构相似化合物的混合物形式生物合成，而非单一化合物。由于它们具有共同的结构……

天然产物通常以化合物类别形式生物合成，而非单一产物。诊断性碎片过滤是一种用于检测复杂混合物中所有结构相关化合物的简单方法。在 MZmine 软件中实现的诊断性碎片过滤，可帮助分析人员探索质谱数据集，发现原本可能被遗漏的新天然产物。这包括新的生物产品，也包括新的毒素。将诊断性碎裂过滤技术应用于污染食品和水的毒素类别，可为暴露评估提供依据。当该技术应用于微生物和植物提取物时，可促成新化合物的发现。使用诊断性碎裂过滤方法需要理解定义化学类别的重要串联质谱特征。这意味着结构相似的化合物会产生特征性离子。我叫Shawn Hoogstra。我是本中心的一名研究技术员兼软件开发者，将由我来演示该实验操作。为准备用于微囊藻毒素分析的样品，需在无菌条件下，向250毫升锥形瓶中加入30毫升无菌的蓝藻生长培养基，并接种至细胞密度约为每毫升五乘以十的五次方个细胞，使用血细胞计数板监测细胞密度。经过26天的光自养培养，培养条件为27摄氏度、12小时光照-12小时黑暗循环、采用冷白色荧光灯照明，并每日摇动一次，随后使用直径为47毫米的GF/C玻璃微纤维滤膜，通过真空过滤法将细胞与培养基分离。在14毫升试管中，向收集的细胞加入3毫升80%甲醇，涡旋混匀后，每管超声处理30秒。超声处理后，将样品进行三次循环的裂解处理，每次包括在-20摄氏度冷冻1小时，随后在室温下解冻15分钟，并将所得的每份蓝藻细胞提取物分别通过0.22微米聚四氟乙烯注射器滤器过滤。使用温和的氮气流，在30摄氏度下用蒸发仪将提取物吹干，并将干燥的提取物在-20摄氏度下保存。进行液相色谱-串联质谱分析时，将待分析的干燥残余物用500 µL 90%甲醇重新溶解，并涡旋混匀样品30秒。转移至棕色高压液相色谱小瓶中。随后，根据标准操作流程，采用数据依赖性采集模式在高分辨质谱仪上分析蓝藻提取物。大多数微囊藻毒素含有一个ATA残基，在串联质谱中会产生两个特征性碎片离子，即M到Z的135.0803和163.1114。对于非靶向液相色谱-串联质谱数据集的制备，在MZmine 2中打开“原始数据导入”选项，位于“原始数据方法”的下拉菜单中。然后选择微囊藻毒素分析的数据文件，并选择峰提取滤镜，应用仪器供应商提供的质心化算法。对于导入的数据依赖性采集文件进行诊断性碎裂过滤（DFF）时，使用光标选中数据文件，然后打开“可视化”下拉菜单，选择 DFF 选项。在出现的 DFF 对话框中，输入目标分析物类别洗脱时的保留时间范围（以分钟为单位）；并输入目标分析物类别的质荷比范围，必要时包含多电荷化合物的可能性。输入质谱仪可达到的串联质谱质量精度，并输入该类别特异性的产物离子质荷比。输入类别特异性的中性丢失值，并将诊断性产物离子和/或中性丢失的最低强度定义为串联质谱图中基峰强度的百分比。然后选择输出结果的路径和文件名，点击“OK”以启动DFF。成功完成设置后，将显示DFF图。分析人员必须解读化合物类别中已知化合物的串联质谱图，以确定对该类化合物具有诊断意义的产物离子和/或中性丢失。该DFF图是在分析铜绿微囊藻CPCC 300后生成的。x轴表示满足定义DFF标准的前体离子的质荷比，而y轴显示微囊藻毒素串联质谱图中所有产物离子的质荷比。本分析中，微囊藻毒素的检测标准包括质荷比在400至1,200范围内的前体离子，以及保留时间为2至6分钟。最重要的是，这些串联质谱图谱均包含超过设定基峰强度15%阈值的质荷比信号。在分析过程中获得的4,116张串联质谱图谱中，有26张满足DFF标准，并在铜绿微囊藻CPCC 300提取物中被检测到。检测到的主要微囊藻毒素可明确鉴定为亮氨酸-精氨酸型微囊藻毒素及其去甲基化天冬氨酸衍生物。当利用诊断性碎片筛选发现新化合物时，可对相应生物体进行大规模培养，以分离化合物并利用核磁共振（NMR）进行结构表征。将该方法应用于微囊藻毒素检测时，诊断性碎片筛选可帮助我们判断传统的靶向筛查方法是否能够检出样品中存在的主要毒素。

natural-product-discovery-with-lc-msms-diagnostic-fragmentation

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

LC-MCYMS 诊断碎裂过滤的天然产物发现: 微囊藻毒素分析的应用

考虑到唾液取样在未来的临床应用，研制了一种棒棒糖状的超滤（LLUF）探针，以适应人口腔结构。通过NanoLC-LTQ质谱对未经消化的唾液进行直接分析，证明LLUF探针能够去除大分子蛋白和高丰度蛋白，从而使低丰度肽段更易于被检测到。...

使用棒棒糖式超滤探针采集人口腔内源性唾液肽组：简化并增强临床质谱中的肽段检测

采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱型分析是研究代谢的重要手段。本文概述了用于血清非靶向代谢物谱型分析的典型工作流程，包括样本组织与制备、数据采集、数据分析、质量控制以及代谢物鉴定。...

大规模非靶向血清代谢组学分析：超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）

本方案用于从海水中收集的微生物生物量中提取和浓缩蛋白质及DNA，随后生成适用于基于串联质谱的蛋白质组学分析的胰蛋白酶肽段。...

一种水生微生物宏蛋白质组学工作流程：从细胞到适用于串联质谱分析的胰蛋白酶肽段

本文介绍了一种快速的蛋白质酶解消化方案，该方案采用自制的流通式胰蛋白酶微反应器，并与电喷雾电离（ESI）质谱仪联用。文中详细描述了微反应器的制备、实验装置的搭建以及数据采集过程。...

使用流通式微反应器快速酶解蛋白质以进行质谱检测

本文介绍了一种通过质谱法对水中氟化物进行顺序靶向定量和非靶向分析的实验方案。该方法可提供已知氟代化学物质的定量水平，并对相关样品中的未知化学物质进行鉴定，同时对其丰度进行半定量估算。...

采用靶向与非靶向筛查相结合的高分辨质谱工作流程鉴定全氟和多氟化合物

本方案涵盖了利用液相色谱-质谱联用技术，并结合高级特征提取和生物信息学分析软件，对肽聚糖组成进行的详细分析。...

利用液相色谱质谱法与生物信息学对肽聚糖进行半定量分析

本文介绍了一种用于快速检测蓝藻水华及其相关蓝藻毒素的多学科综合策略。该方法可在24小时内检测水样以及双壳类样品等有机基质中的蓝藻及其相关蓝藻毒素。...

利用快速检测策略早期发现蓝藻水华及其相关蓝藻毒素

本方案描述了高效液相色谱法，结合折光指数检测或质谱检测，用于研究基于复杂裂解液的无细胞系统中的代谢反应。...

液相色谱联用折射率或质谱检测用于基于裂解液的无细胞体系中的代谢物分析

我们提出了一种基于质谱（MS）/质谱（MS）的快速标注与分类莨菪烷类生物碱的方法，该方法既可用于含莨菪烷样品的初步去重，也可用于发现需分离的新生物碱。...

液相色谱-串联质谱在天然产物研究中的应用：以托烷生物碱为例

开发了一种集成式自动进样器和组分收集器（LC-mate），用于自动化重复的高效液相色谱分离。LC-mate...

使用LC-Mate实现高效液相色谱自动化分离：一种用于微量纯化的集成式重复自动进样器与组分收集系统

本文展示了一种标准方案，该方案将多级质谱树与基于藿香正气口服液的碎裂过程相结合。...

基于线性离子阱质谱法对藿香正气口服液中未知化合物的结构分析技术方案

了解诊断碎裂过滤方法在MZmine软件中用于天然产物发现的应用。该技术通过分析微囊藻毒素等复杂混合物中的质谱数据，帮助研究人员识别新的生物活性化合物和毒素，提升食品安全与环境监测能力。

天然产物发现中的LC-MS/MS诊断性碎片过滤技术：应用于微囊藻毒素分析

探索更多视频