在Vivo前向遗传屏幕识别新的神经保护基因在果蝇黑色素

该协议的主要目标是利用前瞻遗传学的力量来识别基因，当调节不良导致神经退化时。这项技术的主要优点是，它为识别神经保护基因提供了一种公正而直接的方法，在哺乳动物模型中可能更难执行。该技术可用于识别与神经退化过程有关的新基因，该基因与许多疾病（如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症）有关。

除了识别神经保护基因外，前向遗传方法还可用于发现其他生物过程（如神经元功能和传输）中涉及的基因。首先，从属于ENU变异集合的果蝇突变集合中收集同源苍蝇，这些变异体映射到第二染色体。将10至12天的苍蝇翻转到测试室，每次不麻醉一条线，让它们恢复5分钟。

将五厘米线标记侧向下，在放置在固体表面上的鼠标垫上强行敲击腔室三次，以便所有苍蝇在底部开始检测。观察飞行运动在10秒内。记录在此时间内到达或通过五厘米线的苍蝇数量以及测试的苍蝇总数。

等待一分钟，然后开始第二次试验。每行至少重复三次试数复制。在二氧化碳垫上对苍蝇进行麻醉后，用手术刀片将苍蝇头部切开，然后用画笔将苍蝇轻轻放在卡诺伊的固定剂中，放在1.5毫升的微离心管中。

然后将管子在四摄氏度下过夜。第二天，确保头部在固定溶液中沉没。在烟气罩下，使用 P1000 移液器将固定溶液替换为 70% 乙醇的固定溶液，并将其样品保持在 4 摄氏度，供将来分析。

使用巴斯德移液器，将固定头转移到微生物活基盒中并关闭盒式磁带。将盒式磁带送到组织学设施进行处理，或将其放在自动组织加工机中（如果现场可用）。运行程序脱水，清除和渗透与石蜡头部。

然后将盒式磁带转移到石蜡嵌入站，在 60 摄氏度下加热石蜡，并将适合盒式磁带的金属基模放在加热站上。使用精细钳子调整头部方向，使头部朝向基模具的顶部。正确的头部定位对于组织学分析至关重要。

硬化后，修剪每个石蜡块，以尽量减少将剖切的表面。在微原子上切割每个块的五微米部分。接下来，将分段石蜡丝带放在35摄氏度的热水浴中，最多5分钟。

将多晶硅涂层的滑轨浸入热水浴中，并使用木材施用器将分节带放在幻灯片上。让滑梯在室温下通宵干燥。第二天，使用幻灯片加热器在 63 摄氏度下加热幻灯片 15 分钟。

在烟罩下，将幻灯片放在幻灯片染色架上，将滑架放在 HistoChoice 中五分钟，然后根据手稿进行数次乙醇和蒸馏水浴处理。将机架转移到装满哈里斯赤氧林的容器中两到五分钟，以染色。然后从 Hematoxylin 溶液中拿出机架，在以下染色步骤之前，将机架放在自来水下 10 分钟。

染色后，使用钳子，将幻灯片从”史托选择”或二甲苯溶液中拿出来。将薄层永久安装介质滴在样品上，轻轻将盖玻片放在顶部。避免形成气泡。

安装介质硬化后，将幻灯片置于光学显微镜下，在大约中脑处获取具有代表性的大脑部分的图像。首先，准备含有小瓶的食物，以产生异质雌性苍蝇。二氧化碳麻醉后，使用画笔将突变线的5名男性和胸膜堵塞的10个处女叶和针在卷曲O线到小瓶中，使一个十字架。

将小瓶放在摄氏25度。10至12天后，收集至少15个携带变异染色体和标记染色体的处女雌性后代。将它们从平衡线交叉到五个雄性，该线携带另一个可见的显性标记 Curly O 在 scutoid 或等效物上。

10到12天后，收集携带石质或卷曲O的异质雄性后代，以及可能从十字架上重组的染色体。单独交配他们到处女女性从携带变异染色体的股票。10到12天后，从最后一个十字架收集后代到含有小瓶的新食物，并在29摄氏度到10至14天的年龄飞苍蝇。

在飞头上执行组织学，并重复每个个体交叉的后代。有了这些信息，对染色体的狭窄区域进行缺陷映射，以优化隐性突变的位置。每个缺陷线都有染色体不同区域的缺失，允许它们用于补充测试。

接下来，交叉线从嗜血杆菌缺乏工具包为第二染色体，并寻找不补充的表型的兴趣。要获得DNA序列分析的参考，请从 FlyBase 下载包含 BRAT 基因基因组共识序列的 FASTA 格式文件，或使用包含遗传背景控制 BRAT 序列结果的文件，例如最初变异的 Drosophila 线。在 A 质粒编辑器中打开排序文件。

转到”编辑”并单击”对齐序列”。使用计算机的鼠标，选择要比较的所有序列。在放置菜单中，指示此对齐的参考序列。

与参考序列相比，检查序列区域核苷酸的变化。如果需要，通过单击”文本，然后保存”，以 RTF 格式将对齐方式保存在计算机上。通过收集每个十字的 F1 后代来执行救援实验。

仔细选择标记的平衡器。将果蝇在29摄氏度的果蝇食物介质上老化，并在大脑上进行组织学分析，以寻找神经退化。要对867名突变体进行年龄依赖性分析，将苍蝇年龄年龄分在5天、15天和25天，然后进行后续组织学分析。

该协议提出了一种向前的遗传方法，通过一组化学变异的苍蝇使用爬升测定进行筛选。在235条同源线中，约37%的测试线在10至12天测试时，其爬升通过率低于50%。随后，在51条显示最低爬升通过率的线条上进行组织学筛查后发现，其中29条线显示大脑神经皮中明显的孔洞，范围从轻度到严重，指示神经退化。

867只苍蝇的神经退化表型是隐性的，因为杂端867只苍蝇的大脑已经交叉到野生型菌株，与对联的同类苍蝇的大脑相当。缺乏线Df24116没有补充867突变表型基于爬升测定。组织学验证显示缺陷线 Df24116 没有补充 867 神经退化表型， 而 Df9296 没有。

检查867个突变体的大脑表型交叉到额外的缺乏线证实，突变包含在包括基因 BRAT的基因组区域。重要的是要记住，在这个程序中，要尽可能严格和精确地工作，因为该协议结合了几个步骤，如果执行不当，可能会影响突变体与候选基因中神经退化的识别。根据所识别的基因，后续分析可以包括测试与已知神经退化途径中起作用的基因的兴趣或相互作用的基因的附加奥夫尔。

在组织学过程中，请小心处理卡诺伊的固定溶液，因为它含有氯仿。戴手套，最好在烟罩下使用足够的通风。同样，在烟罩下进行所有组织性染色。