Name: 环境细颗粒物小鼠组织中三种 DNA 损伤的质谱定量及水平评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 了解利用高效液相色谱串联质谱技术定量检测小鼠肺、肝、肾组织中氧化应激诱导的DNA损伤的方法。该技术具有高选择性和灵敏度，可用于评估环境细颗粒物PM2.5对DNA完整性的影响。

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圣保罗州研究资助基金会（FAPESP，项目编号：2012/22190-3 和 2012/08616-8）、国家科学技术发展委员会（CNPq，项目编号：454214/2014-6 和 429184/2016-6）、高等教育人员提升协调办公室（CAPES）、圣保罗大学研究副校长办公室（PRPUSP）、国家科学和技术研究所 INAIRA（INCT INAIRA，MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP；项目编号：573813/2008-6）、国家科学和技术研究所 Redoxoma（INCT Redoxoma，FAPESP/CNPq/CAPES；项目编号：573530/2008-4）、Redoxoma 多学科研究计划（NAP Redoxoma，PRPUSP；项目编号：2011.1.9352.1.8）以及 Redoxoma 研究中心（CEPID Redoxoma，FAPESP；项目编号：2013/07937-8）。T. F. Oliveira 和 A. A. F. Oliveira 获得了 FAPESP（项目编号：2012/21636-8、2011/09891-0、2012/08617-4）和 CAPES（高等教育人员提升协调办公室）的奖学金资助。M. H. G. Medeiros、P. Di Mascio、P. H. N. Saldiva 和 A. P. M. Loureiro 获得了 CNPq 的研究员资助。
本文中的一些图和表最初发表于 Oliveira A.A.F. 等人的研究：暴露于巴西圣保罗市浓缩环境细颗粒物（PM2.5）的小鼠的遗传毒性和表观遗传毒性效应。Particle and Fibre Toxicology.&#160;15, 40 (2018)。

作者无任何利益冲突需要披露。

一个常见的主要问题&#160;在采用HPLC方法进行8-oxodGuo分析时，一个主要问题是DNA提取、DNA水解及DNA水解物浓缩等前处理过程中可能诱导其形成22,38为尽量减少8-oxodGuo人为形成的问题，建议在所有DNA提取、储存和水解溶液中添加去铁胺，采用碘化钠变性法提取DNA并避免使用苯酚，同时在水解过程中使用接近100 µg的DNA量，以最大限度降低虚假氧化对最终结果的干扰。39我们考虑了上述引用的建议，但未采用碘化钠变性法提取DNA。为简便起见，我们使用了市售的DNA提取试剂溶液，并在使用前向其中添加去铁胺。此外，将获得的DNA水解产物直接注入HPLC-ESI-MS/MS系统的首根色谱柱，以实现8-oxodGuo与正常核苷的初步分离。在8-oxodGuo洗脱前，通过切换阀将第一根色谱柱的洗脱液转移至第二根色谱柱，以实现进一步分离并缩小峰宽。该方法使8-oxodGuo的定量具有足够的灵敏度，且不受干扰物影响。迄今为止，最相似的DNA中8-oxodGuo定量方...

一些活性氧（ROS）能够氧化DNA碱基中的碳-碳双键以及脱氧核糖部分的某些碳原子，从而产生氧化碱基和DNA链断裂1。由于DNA是一种富含氮和氧原子的带负电荷分子，它也是亲电基团的作用靶点，这些亲电基团可与亲核位点（氮和氧）发生共价反应，生成称为DNA加合物的产物2。因此，DNA加合物和氧化DNA碱基是DNA损伤的典型例子，可作为评估具有亲电性、在生物转化过程中生成活性亲电体或诱导氧化应激的物质毒性的有用生物标志物1,2。尽管修饰后的DNA碱基可通过碱基切除修复（BER）或核苷酸切除修复（NER）从DNA中移除，但当DNA损伤的生成与清除之间出现失衡并倾向于前者时，会导致DNA中这些损伤水平随时间净增加3。其后果包括DNA突变率升高、基因表达降低以及蛋白质活性减弱2,4,5,6,7，这些效应与多种疾病的发生发展密切相关。DNA突变可能影响多种细胞功能，如细胞信号传导、细胞周期、基因组完整性、端粒稳定性、表观基因组、染色质结构、RNA剪接、蛋白质稳态、代谢、细胞凋亡以及细胞分化8,9。减缓细胞突变率和慢性疾病（如癌症、神经退行性疾病）发展的策略，依赖于对突变来源的认识，其中就包括DNA损伤及其成因。
由于暴露于污染物、持续性炎症、疾病病理生理状态（如糖尿病）等原因，体内过量产生的活性氧（ROS）是导致生物大分子损伤的重要原因，包括DNA和脂质损伤1。例如，由过渡金属离子（Fe2+、Cu+）还原H2O2生成的高活性羟基自由基（OH）能够以扩散控制速率氧化DNA碱基、DNA糖基部分以及多不饱和脂肪酸10。在目前已表征的80种氧化核碱基中3，研究最为广泛的是8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxoGua）或8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo，图1），该损伤可在哺乳动物细胞中诱发G→T颠换10,11。它由鸟嘌呤的单电子氧化，或DNA中鸟嘌呤受到羟基自由基或单线态氧攻击而形成1。多不饱和脂肪酸也是高活性氧化剂（如•OH）的重要靶标，可启动脂质过氧化过程1,12。该过程生成脂肪酸氢过氧化物，其可分解为亲电性醛类和环氧醛类物质，如丙二醛、4-羟基-2-壬烯醛、2,4-癸二烯醛、4,5-环氧-(2E)-癸烯醛、己烯醛、丙烯醛和巴豆醛，这些产物能够形成具有致突变性的环外DNA加合物，如丙二醛加合物、丙烷加合物或乙醛加合物1,12,13。乙醛加合物中的1,N2-乙醛-2'-脱氧鸟苷（1,N2-εdGuo，图1）和1,N6-乙醛-2'-脱氧腺苷（1,N6-εdAdo，图1）已被提出作为炎症病理生理过程中潜在的生物标志物14,15。
<img alt="修饰核苷的化学结构；8-氧代-dG、1,N²-乙醛基-dG、1,N⁶-乙醛基-dA 示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1. 本研究中定量分析的DNA损伤的化学结构。 dR = 2´-脱氧核糖。该图改编自Oliveira等人的研究34。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
20世纪80年代初开展的研究实现了通过高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）对8-oxodGuo的高灵敏度检测。在多种经受氧化条件的生物体系中，利用HPLC-ECD对8-oxodGuo进行定量，促使人们将8-oxodGuo确认为DNA中氧化诱导碱基损伤的生物标志物1,16。尽管该方法稳定可靠，且可实现对低至fmol水平的8-oxodGuo进行定量17，但HPLC-ECD检测依赖于待测物保留时间的准确性以进行定性识别，并依赖色谱分离度以避免样品中其他组分的干扰。由于电化学检测需要在流动相中使用盐类（如磷酸钾、乙酸钠），因此维持适当的分析条件需要定期对色谱柱和设备进行清洗。
另一种方法是使用细菌DNA修复酶甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶（formamidopyrimidine DNA glycosylase, FPG），随后使用人源8-氧代鸟嘌呤糖基化酶1（human 8-oxoguanine glycosylase 1, hOGG1），以检测并去除DNA中的8-氧代鸟嘌呤（8-oxoGua），从而诱导产生DNA碱不稳定位点。这些碱不稳定位点可转化为DNA链断裂，进而通过碱性单细胞凝胶电泳（“彗星实验”）实现对8-oxoGua的高度敏感的间接定量。该方法的主要优势在于其高灵敏度，且无需提取细胞DNA即可完成分析。该方法测得的DNA中8-oxoGua稳态水平最低，通常比基于高效液相色谱（HPLC）的生物分析方法所得结果低7至10倍。然而，该方法属于对8-oxoGua的间接测量，其局限性包括特异性不足，以及所用修复酶的切割效率未知1,16,18。
免疫测定法是用于检测8-oxoGua1和环外DNA加合物（如1,N6-dAdo和1,N2-dGuo）的另一类方法12。尽管灵敏度较高，但使用抗体检测DNA损伤的一个缺点是特异性不足，容易与生物样品中的其他成分发生交叉反应，包括正常的DNA碱基1,12。环外DNA加合物（包括1,N6-dAdo和1,N2-dGuo）也可通过高灵敏度的32P-后标记法进行检测和定量分析12。32P-后标记法的高灵敏度使得仅需极少量DNA（例如10 µg）即可检测到每1010个正常碱基中约1个加合物19。然而，该方法也存在一些缺点，如需使用放射性化学物质、化学特异性差以及准确性较低19,20。
上述方法的一个共同局限性是检测目标分子时选择性或特异性较低。在此背景下，高效液相色谱串联电喷雾电离质谱法（HPLC-ESI-MS/MS 和 HPLC-MS3）已成为在生物基质（如 DNA、尿液、血浆和唾液）中定量修饰核苷的金标准1,19,20。HPLC-ESI-MS/MS 方法的优点包括高灵敏度（通常在低飞摩尔范围内）以及由以下三方面提供的高特异性：i）色谱分离；ii）分子在质谱仪碰撞室内的特征性和已知的碎裂模式；iii）在多反应监测模式下对选定质荷比（m/z）的精确测定1,19。使用同位素标记的内标可进一步校正 DNA 水解和分析物富集过程中发生的分子损失，以及不同样品间分析物离子化效率的差异。此外，当存在多个色谱峰时，同位素内标还有助于准确识别目标色谱峰1,12,19,20。
已有多种基于HPLC-ESI-MS/MS的方法用于定量不同生物样品DNA中提取的8-oxodGuo、1,N6-dAdo和1,N2-dGuo12,15,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29。细颗粒物（PM2.5）携带多种有机和无机化学物质，如多环芳烃（PAHs）、硝基-PAHs、醛类、酮类、羧酸、喹啉、金属以及水溶性离子，这些物质可能引发炎症和氧化应激，从而促进生物大分子损伤及相关疾病的发生30,31,32,33。本文介绍了经过验证的HPLC-ESI-MS/MS方法，并已成功应用于A/J小鼠肺、肝和肾DNA中8-oxodGuo、1,N6-dAdo和1,N2-dGuo的定量，以评估环境PM2.5暴露的影响34。

<table><tbody><tr><td>[&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;]-2&amp;rsquo;-脱氧腺苷</td><td>剑桥同位素实验室</td><td>NLM-3895-25</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;]-2&amp;rsquo;-脱氧鸟苷</td><td>剑桥同位素实验室</td><td>NLM-3899-CA-10</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Carlo Erba 试剂</td><td>412413000</td><td></td></tr><tr><td>牛肠黏膜碱性磷酸酶</td><td>Sigma</td><td>P5521</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>默克</td><td>101116</td><td></td></tr><tr><td>小牛胸腺DNA</td><td>Sigma</td><td>D1501</td><td></td></tr><tr><td>细胞裂解液</td><td>QIAGEN</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Carlo Erba 试剂</td><td>412653</td><td></td></tr><tr><td>去铁胺</td><td>Sigma</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)</td><td>Bio Basic Inc</td><td>DD0649</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Carlo Erba 试剂</td><td>414542</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-ESI-MS/MS 系统</td><td>高效液相色谱：Agilent 1200 系列&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; ESI-MS/MS：Applied Biosystems/MDS Sciex 仪器</td><td>高效液相色谱仪：双元泵（G1312B）、等度泵（G1310A）、带柱切换阀的柱温箱（G1316B）、二极管阵列检测器（G1315C）、自动进样器（G1367C）。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; ESI-MS/MS：线性四极杆离子阱质谱仪，型号 4000 QTRAP。</td><td></td></tr><tr><td>HPLC/DAD 系统</td><td>岛津</td><td>两台泵（LC-20AT）、光电二极管阵列检测器（DAD-20AV）、自动进样器（Proeminence SIL-20AC）、柱温箱（CTO-10AS/VP）</td><td></td></tr><tr><td>HPLC色谱柱（50 × 2.0 mm 内径，2.5 &amp;micro;m，C18</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4446-B0</td><td></td></tr><tr><td>HPLC色谱柱（150 × 2.0 mm 内径，3.0 &amp;micro;m，C18</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4251-B0</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱柱（250 × 4.6 mm 内径，5.0 &amp;micro;m，C18</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4252-E0</td><td></td></tr><tr><td>HPLC C18 保护柱（4.0 × 3.0 mm 内径）</td><td>Phenomenex</td><td>AJO-4287</td><td></td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32658</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（异丙醇）</td><td>Carlo Erba 试剂</td><td>A412790010</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Ceva</td><td>商品名：Dopalen</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Carlo Erba 试剂</td><td>349377</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Carlo Erba 试剂</td><td>L022909K7</td><td></td></tr><tr><td>来自磷酸二酯酶 I &lt;em&gt;Crotalus atrox&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td></td></tr><tr><td>蛋白沉淀溶液</td><td>QIAGEN</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶A</td><td>Sigma</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>SPE-C18（Strata-X）</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S100-TAK</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>Carlo Erba 试剂</td><td>489983</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Syntec 巴西</td><td>商品名：Xilazin</td><td></td></tr></tbody></table>

通过质谱法定量三种dna损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA加合物和氧化DNA碱基是DNA损伤的典型例子，可作为评估亲电性物质、经生物转化后产生活性亲电物的物质或诱导氧化应激的物质毒性的有用生物标志物。在氧化的核碱基中，研究最为广泛的是8-氧-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxoGua）或8-氧-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo），其为DNA中氧化性碱基损伤的生物标志物。脂质过氧化过程中产生的醛类和环氧醛类属于亲电性分子，能够形成致突变性的外环DNA加合物，例如乙烯加合物1,N2-乙烯-2'-脱氧鸟苷（1,N2-εdGuo）和1,N6-乙烯-2'-脱氧腺苷（1,N6-εdAdo），这些已被建议作为炎症病理生理过程中的潜在生物标志物。为了制定预防策略以减缓细胞突变率和慢性疾病（如癌症、神经退行性疾病）的发展，有必要建立针对这些物质在DNA中定量的选择性和高灵敏度方法。在可用于检测这些物质的高灵敏度方法中（如高效液相色谱联用电化学或串联质谱检测器、彗星试验、免疫分析法、32P-后标记法），基于高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）的方法具有最高的选择性。在分析复杂生物样品时，选择性是一项关键优势，HPLC-ESI-MS/MS已发展成为在DNA、尿液、血浆和唾液等生物基质中定量修饰核苷的金标准。使用同位素标记的内标可校正DNA水解及分析物富集过程中分子的损失，并校正不同样品间分析物离子化效率的差异，同时在存在多个色谱峰时有助于准确识别目标色谱峰。
本文介绍了经过验证的高灵敏度、准确且精密的高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）方法，已成功用于定量分析A/J小鼠肺、肝和肾DNA中的8-oxodGuo、1,N6-dAdo和1,N2-dGuo，以评估环境PM2.5暴露的影响。

从小鼠肝脏（约 1 g 组织）、肺脏（约 0.2 g 组织）和肾脏（约 0.4 g 组织）中提取的 DNA 平均浓度（± 标准差）分别为 5,068 ± 2,615、4,369 ± 1,021 和 3,223 ± 723 µg/mL，最终体积为 200 µL。通过高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）分析纯化后的 DNA 所得的代表性色谱图见图 3。色谱图中显示出四种 2'-脱氧核苷，且未检测到在相应 2'-脱氧核苷之前洗脱的 RNA 核糖核苷，表明所提取 DNA 纯度较高。
用于8-oxodGuo定量分析的HPLC-ESI-MS/MS代表性色谱图, 1,N6-εdAdo 和 1,N2小鼠组织DNA样本中的-εdGuo如图所示 图4至图6. 采用紫外检测获得的色谱图 <...

本文描述了对DNA中的损伤产物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo）、1,N6-乙烷-2'-脱氧腺苷（1,N6-dAdo）和1,N2-乙烷-2'-脱氧鸟苷（1,N2-dGuo）进行高灵敏度和准确测定的方法。这些方法已应用于评估暴露于细颗粒物（PM2.5）的A/J小鼠组织（肺、肝和肾）中的损伤效应。

通过质谱法定量三种DNA损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估

DNA加合物和氧化的DNA碱基是DNA损伤的示例，可作为评估物质毒性的有用生物标志物，这些物质……

本文所述方法可用于定量由氧化应激诱导的DNA损伤，有助于深入理解可能作为疾病预防和治疗靶点的病理生理机制。其主要优势在于选择性和灵敏度。在处理复杂的生物样本时，选择性尤为重要。高效液相色谱串联质谱法已成为生物基质中此类定量分析的金标准。氧化应激是多种病理生理过程中的常见现象。已在患有炎症性疾病的患者组织或尿液中检测到乙烯基加合物水平升高。DNA损伤还可提供有关污染物暴露所引发的内源性事件的信息。例如，如果DNA损伤增加，则表明暴露水平可能已达到提高癌症发生风险的程度。这些损伤可在任何细胞系统的DNA中进行定量，也可在尿液、血浆、唾液或培养基中定量，但需对样本制备方法进行相应调整。首先，将培养皿置于冰上作为基底，用解剖刀切割组织。将每份一克的组织称重后放入50毫升带盖离心管中，立即使用。剩余组织置于干冰上，随后于负80摄氏度保存。向每个试管中加入 10 毫升含有 0.5 毫摩尔去铁胺的商用细胞裂解液，并置于冰上保存。将组织匀浆器调至低速，约 60 至 90 转/分钟。在冰上匀浆组织数分钟，直至溶液中无组织碎片。然后，向每个匀浆样品中加入 150 µL 蛋白酶 K 溶液。将试管颠倒混匀，并在室温下静置过夜。次日早晨，加入 40 µL 核糖核酸酶 A 溶液，颠倒混匀后，于室温下继续孵育两小时。加入5毫升商用蛋白质沉淀液，剧烈涡旋振荡，然后在4°C、2,000 × g条件下离心10分钟。将上清液转移至含有10毫升预冷异丙醇的50毫升带盖试管中。轻轻倒置试管数次，直至观察到DNA沉淀。使用末端封闭的巴斯德移液管收集沉淀的DNA。将收集的DNA转移至含有4毫升10毫摩尔Tris缓冲液和1毫摩尔去铁胺（pH为7）的离心管中以溶解DNA。待DNA完全溶解后，向每根离心管中加入4毫升含4%异戊醇的氯仿溶液。将离心管颠倒10次以混匀，于4°C、2,000 × g条件下离心10分钟，然后将上清转移至新管中。用氯仿溶液重复洗涤上清相2次。随后，加入8 mL无水乙醇和0.4 mL 5 mol/L氯化钠溶液，以沉淀DNA。再次收集沉淀的DNA，并将其转移至3 mL 70%乙醇中。用70%乙醇再洗涤一次。小心弃去乙醇溶液，将含有沉淀DNA的离心管倒置于吸水纸上，以去除多余的液体。按照手稿要求，使用1, N6-乙醇脱氧腺苷的15N5同位素标准品和1, N2-乙醇脱氧鸟苷的15N5同位素标准品制备DNA水解样品后，将每个样品的10微升转移至试管中，用于通过HPLC-UV定量正常脱氧核苷。将剩余体积进行固相萃取。进行HPLC时，首先用0.1%甲酸和甲醇的梯度对连接有C18 SecurityGuard保护柱的C18柱进行洗脱。设置梯度程序：0至25分钟，甲醇比例从0升至18%；25至27分钟，甲醇比例从18%降至0%；27至37分钟，保持0%甲醇，流速为1毫升/分钟，温度为30摄氏度。随后，对每份用于正常脱氧核苷定量的样品，进样体积为2至6微升。将DAD检测器设定在260纳米波长，用于脱氧鸟苷和脱氧腺苷峰的积分分析。为分析1,N6-乙醛基脱氧腺苷和1,N2-乙醛基脱氧鸟苷而进行固相萃取时，首先以每种1毫升的体积依次向萃取柱中加入一系列溶液：100%甲醇、去离子水、水解后的DNA样品、去离子水、10%甲醇、15%甲醇，最后用100%甲醇进行洗脱收集。随后，按照文稿中的步骤进行操作。在制备DNA水解样品及8-氧代-2'-脱氧鸟苷的15N5同位素标准品后，将每个样品中的80微升转移至小瓶中，用于HPLC-ESI-MS/MS系统的分析。剩余的20微升保留用于之前所述的HPLC-UV法测定脱氧鸟苷含量。在HPLC-ESI-MS/MS上分析8-氧代-2'-脱氧鸟苷时，使用溶剂A和溶剂B以150微升/分钟的流速、25摄氏度条件下进行梯度洗脱，色谱柱为C18柱A并连接C18 SecurityGuard保护柱。在前25分钟内，使用二元泵将溶剂B从0%线性梯度洗脱至15%；25至28分钟内，从15%升至80%；28至31分钟内，保持80%的溶剂B；31至33分钟内，从80%降至0%；33至46分钟内，保持0%的溶剂B。将色谱柱A洗脱液的前16分钟流分导入废液。使用等度泵以含有0.1%甲酸的15%甲醇水溶液，以150微升/分钟的流速对色谱柱B进行平衡。六分钟后，检查色谱图，确保8-氧代-脱氧鸟苷标准品从A柱洗脱。在16至32分钟期间，切换阀门至连接A柱与B柱的位置。在32分钟时关闭阀门，使8-氧代-脱氧鸟苷从第二根色谱柱中洗脱，从而获得尖锐的色谱峰。分析1,N6-乙醛基-脱氧腺苷和1,N2-乙醛基-脱氧鸟苷时，使用C18柱串联C18 SecurityGuard保护柱，在25 °C条件下以溶剂A和溶剂B进行梯度洗脱，流速为130 µL/min。二元泵程序设置如下：前10分钟为0%溶剂B；10至39分钟为0%至20%溶剂B；39至41分钟为20%至75%溶剂B；41至46分钟为75%溶剂B；46至47分钟为75%至0%溶剂B；47至60分钟为0%溶剂B。使用切换阀将前35分钟的洗脱液导入废液，将35至42分钟的组分导入ESI源。确保加合物标准品在设定的时间区间内从色谱柱中洗脱出来。从HPLC-ESI-MS/MS分析中积分8-氧代-2'-脱氧鸟苷、8-氧代-2'-脱氧鸟苷15N5同位素标准品、1,N6-乙烯基-2'-脱氧腺苷、1,N6-乙烯基-2'-脱氧腺苷15N5同位素标准品、1,N2-乙烯基-2'-脱氧鸟苷以及1,N2-乙烯基-2'-脱氧鸟苷15N5同位素标准品的峰。计算校准曲线和样品的峰面积比。建立校准曲线，并计算每个注射样品中损伤产物的含量。对HPLC-UV分析中脱氧鸟苷和脱氧腺苷的峰进行积分。利用这些区域建立标准曲线，并计算每个注射样品中动物体内脱氧鸟苷和脱氧腺苷的含量。计算8-氧代脱氧鸟苷相对于脱氧鸟苷、1,N6-乙烯脱氧腺苷相对于脱氧腺苷以及1,N2-乙烯脱氧鸟苷相对于脱氧鸟苷的摩尔分数，这些数值表示每一百万个正常脱氧鸟苷或脱氧腺苷中的损伤数量。通过HPLC-UV获得的纯化DNA的代表性色谱图显示了四种正常脱氧核苷的存在，且不含RNA核糖核苷，证明了DNA的纯度。展示了小鼠组织DNA样品中8-氧代脱氧鸟苷、1,N6-乙醇脱氧腺苷和1,N2-乙醇脱氧鸟苷的HPLC-ESI-MS/MS代表性色谱图。紫外检测获得的色谱图显示，四种正常的脱氧核苷在约10分钟内从第一根色谱柱中洗脱出来，与8-氧代脱氧鸟苷实现了良好的分离，从而消除了不必要的干扰。进行准确定量时需要牢记的重要一点是，在校准曲线和样品中，每次进样体积内的内标物含量必须始终保持一致。本文所述方法可适用于其他修饰脱氧核苷的定量分析。扩大对修饰脱氧核苷的研究范围有助于更深入理解潜在的病理生理机制。我们可探究氧化损伤在不同情况下的作用，例如暴露于外源性物质、糖尿病以及细胞恶性转化，从而推动预防和治疗策略的发展。

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免疫学与感染

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组织样本中γH2AX焦点的定量分析

肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离、培养这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾的实验方案，以研究细胞对这种环境毒素的分子响应。...

小鼠呼吸道上皮细胞的分离及在气液界面暴露于实验性香烟烟雾

本实验方案旨在提供一种自动化方法，用于量化慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型中的慢性肺部病理变化。该方案包括将小鼠暴露于香烟烟雾（CS）中、测定肺功能、灌注膨胀肺组织，以及采用形态计量学方法测量小鼠肺气肿和小气道重塑情况。...

香烟烟雾暴露小鼠肺气肿及小气道重塑的自动化测量

一种用于评估慢性因素可能诱导的DNA损伤水平及DNA修复能力变化的实验方案 体内 通过流式细胞术检测磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂的标志物），展示小鼠脾淋巴细胞中低剂量辐射的影响。...

测量慢性处理后小鼠脾细胞中的DNA损伤与修复 体内 暴露于极低剂量的β射线和γ射线

本方案描述了染色体畸变的定量与表征技术 体外 在经大气颗粒物处理后的 RAW264.7...

利用环境颗粒物诱导染色体畸变的分析方法 体外 系统

本研究描述了通过反复将小鼠暴露于高浓度臭氧中，成功建立一种新的慢性阻塞性肺疾病（COPD）动物模型的方法。...

通过反复臭氧暴露在小鼠中建立慢性阻塞性肺疾病模型

本文的目的是详细介绍通过双腔体积描记法评估清醒小鼠呼吸功能的推荐操作步骤。...

通过双腔体积描记法评估清醒小鼠的呼吸功能

我们介绍一种利用高效液相色谱-电化学检测器（HPLC-ECD）检测大气蛋白质中3-硝基酪氨酸化学修饰的方法，样品采用空气采样器预滤膜上切割的直径为6...

大气环境中3-硝基酪氨酸的检测 通过 高效液相色谱-电化学检测系统

本文介绍了一种用于测量气道巨噬细胞碳含量的详细实验方案，旨在评估个体暴露于颗粒物水平下的内部暴露剂量。...

测量暴露于含碳颗粒物的气道巨噬细胞中的碳含量

本研究介绍了一种结合微波辅助植物样品制备与负染色法用于透射电子显微镜检测的技术，可在约半天内实现对植物病毒病的快速、清晰诊断。...

微波辅助通过透射电子显微镜快速诊断植物病毒病

了解利用高效液相色谱串联质谱技术定量检测小鼠肺、肝、肾组织中氧化应激诱导的DNA损伤的方法。该技术具有高选择性和灵敏度，可用于评估环境细颗粒物PM2.5对DNA完整性的影响。

通过质谱法定量三种DNA损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估

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