Name: 通过乙基甲烷硫素突变在小谷物作物中靶向诱导局部病变(TILLING)种群的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 了解利用乙基甲烷磺酸盐诱变技术在小谷物作物中建立高突变频率TILLING群体的方法。该方案适用于任何基因型，可通过Cel-1检测实现功能基因组学研究和新基因发现。

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本研究由美国农业部国家食品与农业研究所Hatch项目（项目号1016879）以及马里兰农业实验站通过MAES资助项目（项目号2956952）提供支持。

1. 有效诱变剂量曲线的制备
<ol>
	<li>将100粒目标基因型的种子分别放入六个250 mL的玻璃锥形瓶中（每瓶100粒），每瓶加入50 mL蒸馏水。在室温（RT）下以100 rpm振荡8小时，使种子充分吸胀。</li>
	<li>在通风橱中，分别将0.167、0.249、0.331、0.415和0.498 mL的甲基磺酸乙酯（EMS）溶于蒸馏水中，配制50 mL的0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%（w/v）EMS溶液。 
	注：EMS在室温下为液体，密度为1.206 g/mL。 
	注意：操作EMS时需佩戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
	<li>倒去五个锥形瓶中的水，向每个含有已吸胀种子的锥形瓶中分别加入50 mL EMS溶液，共设置六个不同处理组：0.0%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2% EMS溶液。将锥形瓶在室温下以75 rpm振荡16小时。</li>
	<li>倒去EMS溶液，用纱布分别收集各处理组的种子。通过加入等体积的EMS失活液（0.1 M NaOH，20% w/v Na2S2O3）处理废液24小时以使其失活。同样，被污染的锥形瓶和移液器吸头也需用EMS失活液处理24小时。</li>
	<li>将经EMS处理的种子在流动的自来水下冲洗2小时。将每粒种子单独移栽至装有育苗土的育苗盘中。</li>
	<li>在20–25 °C、16小时光照周期条件下培养植株。</li>
	<li>在移栽后15天记录植株存活数据。使用以下公式计算各处理组的存活率： 
	<img alt="EMS处理种子的存活率计算公式；用于计算发芽成功率百分比的方法。" src="/files/ftp_upload/59743/59743eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
	注：若对照组的发芽率低于100%，则所有处理组的准确存活率应在扣除对照组未发芽种子数后进行计算。理想的诱变效果对应的存活率为40%–60%。可根据处理种子的存活情况，调整浓度进行第二轮剂量优化，直至达到理想的致死率范围（40%–60%）。</li>
</ol>
2. 诱变及突变群体的保种
<ol>
	<li>将至少3,000粒种子均分为五份（每份600粒），分别浸泡于五个含有300 mL蒸馏水的1,000 mL锥形瓶中。于室温下以100 rpm振荡8 h，以促进吸胀。 
	注意：目标群体的最终规模取决于基因型的突变频率和倍性水平，但建议六倍体至少使用 3,000 粒种子，四倍体使用 4,000 粒种子，二倍体使用超过 7,000 粒种子。</li>
	<li>在通风橱中，用蒸馏水配制 1,500 mL 优化浓度的 EMS 溶液。</li>
	<li>将烧瓶中的水倒出，向每个含有600粒吸胀种子的烧瓶中加入300 ml最适浓度的EMS溶液。在室温下以75 rpm振荡16小时。</li>
	<li>将EMS倒出，用纱布收集经处理的种子。使用EMS失活溶液对EMS溶液及处理容器进行失活，操作同步骤1.4。</li>
	<li>用流动的自来水冲洗经EMS处理的种子2小时。将每粒经EMS处理的M1 将种子单独播种到育苗盆中。</li>
	<li>培养 M1 植物（源自 M）0 种子）在 20–25 °C 在16小时光照周期下。 
	注意：可能需要在两叶期对幼苗进行6周的春化处理 4 °C，如果目标基因型具有冬季型生长习性。</li>
	<li>让 M1 植物自花授粉，并收获M2 每株可育 M 分别收获种子1 植物 
	注意：为避免可能的异花授粉，用套袋覆盖 M 的穗1 开花前用授粉袋套住植株。</li>
	<li>种植一株 M2 每株M的种子1 植物以避免基因冗余。</li>
	<li>从M中采集组织2 在96孔架式微量离心管（每管1.1 mL）中取两叶期植株的叶片组织，每株采集约80 mm的叶片组织，并在组织取样记录表中登记各样本的编号。</li>
	<li>使用冷冻干燥机对叶片组织进行冻干，并于 -80 °C.</li>
	<li>维持 M2 20–的植物25 °C 在16小时光照周期下。</li>
	<li>记录 M 突变体表型的数据2 定期观察植株。预期的表型包括白化、黄绿叶、草状芽、花斑、部分可育、不育等。</li>
	<li>让 M2 植株自交并使其成熟。分别收获并保存M3代种子2 植物（图1). 
	注意：M代种子用于反向遗传学研究中表型的验证，因此应仔细编目，并在阴凉干燥条件下保存。或者，若需在田间扩增种子，可为每株M代植株设置单行种植，分别收获并单独保存每行的M代种子，作为TILLING群体资源。</li>
</ol>
3. 用于突变体遗传学表征的 Cel-1 检测
<ol>
	<li>使用植物DNA提取试剂盒（配备DNA纯化系统，参见材料表），按照制造商推荐的方法从M2代叶片组织中提取DNA。</li>
	<li>使用分光光度计对DNA进行定量，并用无核酸酶水将DNA浓度标准化至25 ng/µL，置于96孔板中。 
	注意：必须通过凝胶电泳检测DNA质量，因为低质量DNA（弥散状DNA）可能导致混合样本中出现假阴性结果。</li>
	<li>通过将四个96孔板中的DNA合并至一个新板中，构建4倍DNA混合池，同时保持各样本的行列位置信息。从每个单独样本中取50 µL DNA加入混合池板中，使混合池板的每个孔中包含来自四个不同96孔板的共200 µL DNA。</li>
	<li>以混合池板-行-列格式记录混合DNA的身份信息（例如，Pool 1 A1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1）。</li>
	<li>利用Genome Specific Primers (GSP) 网页工具 &lt;https://probes.pw.usda.gov/GSP&gt;，采用多倍体物种的默认设置，为感兴趣基因设计基因组特异性引物[A1]；对于二倍体物种，使用Primer 3工具 &lt;http://primer3.ut.ee/&gt;，采用默认设置设计引物。如需覆盖目标基因的完整编码区，可设计多个引物。 
	注意：可使用IWGSC最新基因组组装数据，结合URGI BLAST工具 &lt;https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST&gt; 获取小麦中目标基因的序列。最佳扩增片段长度范围为800–1,500 bp。表1列出了在六倍体小麦中针对waxy基因设计引物的示例。</li>
	<li>对混合DNA样本使用基因特异性引物进行PCR扩增，步骤如下：
	<ol>
		<li>加入5 µL PCR缓冲液、各2 µL的4 µM正向和反向引物、0.1 µL DNA聚合酶（参见材料表）、5 µL混合DNA模板，再用无核酸酶水补足至总体积25 µL。</li>
		<li>在PCR仪上采用降落PCR程序进行扩增：95 °C预变性1 min；进行7个循环，每循环为95 °C变性1 min，退火温度从67 °C逐步降至60 °C（每循环降低1 °C）、延伸1 min，72 °C延伸2 min；随后进行30个循环，每循环为95 °C 1 min、60 °C 1 min、72 °C 2 min；最后在72 °C延伸7 min。 
		注意：上述PCR程序适用于大多数采用Primer 3默认参数设计的引物对小麦DNA模板的扩增。若出现非特异性扩增，应在进入下一步前优化并提高PCR条件的严谨性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在PCR仪中孵育PCR产物以形成错配DNA的异源双链，程序如下：95 °C 2 min；进行5个循环，每循环为95 °C 1 s，然后从95 °C降至85 °C（每循环降低2 °C）、保持1 min；再进行60个循环，从85 °C逐步降至25 °C（每循环降低1 °C）。</li>
	<li>向已形成异源双链的PCR产物中加入2.5 µL自制的Cel-1核酸内切酶，在45 °C孵育45 min。加入2.5 µL 0.5 M EDTA（pH 8.0）以终止Cel-1酶切反应。 
	注意：Cel-1核酸内切酶可通过Till等19描述的方法从新鲜芹菜茎中提取。测试Cel-1核酸内切酶的活性及其最适用量至关重要，可使用已知突变体或市售突变检测试剂盒进行验证。</li>
	<li>将经Cel-1处理的产物在3.0%琼脂糖凝胶中以100 V电泳2.5小时。含有除全长未切割条带外、额外出现较小且独特切割条带的加样孔，即含有突变DNA样本。</li>
	<li>解码突变混合池。
	<ol>
		<li>对在步骤3.9中鉴定出的突变混合池所包含的各个M2代DNA样本，重复执行步骤3.6、3.7、3.8和3.9。</li>
		<li>为确定突变体的杂合性，对单个M2代DNA样本进行两组PCR反应（如步骤3.6所述）：第一组反应包含2.5 µL M2代DNA和2.5 µL野生型DNA，第二组反应仅包含5 µL M2代DNA。若突变为杂合状态，则两组反应中均会出现额外的切割条带；若为纯合突变，则仅在第一组反应中出现额外切割条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确定突变的性质，使用Sanger测序平台对已确认的突变体PCR产物进行测序，并遵循制造商的操作说明。</li>
</ol>
4. 突变频率的计算
注意：TILLING 群体的突变频率是指该群体个体基因组中发生一次突变的平均物理距离。例如，TILLING 群体中 1/35 kb 的突变频率意味着该群体中单个个体的基因组每 35 kb 就含有一个突变。
<ol>
	<li>为确定TILLING群体的突变频率，需计算被筛查的碱基总数。</li>
	<li>为计算被筛查的碱基总数，将PCR产物长度乘以被筛查的个体总数。</li>
	<li>用被筛查的碱基总数除以观察到的独有突变数量，使用以下公式计算，结果表示该TILLING群体中每多少个碱基区域含有1个突变： 
	<img alt="突变频率公式；图示遗传突变分析的计算方法。" src="/files/ftp_upload/59743/59743eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> 
	注意：由于基于琼脂糖凝胶平台在两端各存在约50 bp的分辨率限制，计算时应在产物长度中减去100 bp。</li>
</ol>

<ol><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+screening+for+induced+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li>
<li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li>
<li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations%3A+TILLING+by+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li>
<li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+%28Hordeum+vulgare+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li>
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<li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205(2012).</li>
<li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILL-D%3A+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li>
<li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li>
<li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li>
<li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li>
<li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li>
<li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li>
<li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115(2009).</li>
<li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li>
<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li>
<li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268(2017).</li>
<li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Genome%22%5BJournal%5D)">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li>
<li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li>
<li>Wu, J. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li>
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<li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li>
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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

TILLING 是一种极具价值的反向遗传学工具，可用于基因功能验证，尤其适用于转基因方法存在严重瓶颈的小粒谷物11。构建具有高突变频率的诱变群体是开展功能基因组学研究的关键步骤之一。建立高效 TILLING 群体最重要的步骤是确定 EMS 的最佳浓度。在小麦和大麦中，M1 代植株 40%–60% 的存活率已被证明是评估 EMS 诱变效果的良好指标4,6,18。存活植株可提供足够的突变频率，有助于发现任何目标基因中的突变。在水稻中，除 M1 代植株的存活率外，M1 植株的育性是另一个决定因素，且据报道在不同基因型间存在差异20。
由于多倍性，六倍体普通小麦和四倍体硬粒小麦在大多数基因上每个基因组都具有同源等位基因，从而能够补偿因突变导致的重...

基因组中的点突变可为研究人员提供多种有用的功能。根据其性质和位置，这些突变可用于赋予基因功能，甚至确定目标蛋白的不同结构域的功能。另一方面，作为新型遗传变异的来源，可通过表型筛选选择具有理想性状的有益突变，并进一步用于作物改良。TILLING 是一种强大的反向遗传学工具，包括化学诱变以及对目标基因中序列变异的检测。该技术最初在Arabidopsis1和Drosophilia melanogaster2中建立，随后已在多种小粒谷类作物中构建并应用了 TILLING 群体，例如六倍体面包小麦（Triticum aestivum）3、大麦（Hordeum vulgare）4、四倍体硬粒小麦（T. dicoccoides durum）5、二倍体小麦（T. monococcum）6以及小麦的&#34;D&#34;基因组供体Aegilops tauschii7。 这些资源已被用于验证基因在调控非生物和生物胁迫耐受性8、调控开花时间9以及培育营养品质更优作物品种5中的作用。
TILLING 技术结合使用烷化诱变剂（如甲基磺酸乙酯（EMS）、叠氮化钠、N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）和甲基磺酸甲酯（MMS）），相较于其他反向遗传学工具具有多项优势。首先，诱变几乎可在任何物种或植物品种中进行10，且不受转化效率瓶颈的限制，这一点对于小粒谷物尤为重要，因其转化尤为困难11。其次，除可产生其他基因验证方法也能获得的基因敲除突变外，TILLING 还可诱导产生一系列错义突变和剪接位点突变，有助于解析目标蛋白各个结构域的功能12。此外，TILLING 能在整个基因组范围内产生永久性的突变资源库，因此单个突变群体可用于多个基因的功能验证。相比之下，其他反向遗传学工具所产生的资源仅针对所研究的特定基因13。通过 TILLING 鉴定出的有益突变可用于育种，且不受监管限制，而基因编辑技术是否属于非转基因范畴在许多国家仍不明确。这一点对于国际贸易的小粒谷物尤为关键14。
TILLING 是一种简单且高效的基因验证策略，需要构建诱变群体以研究目标基因。构建一个高效的诱变群体是决定基于 TILLING 的基因验证研究效率的关键。若 TILLING 群体的整体突变频率过低，则需要筛选极大规模的群体才能获得目标突变，这在实际操作中难以实现；而若诱变剂浓度过高，则会导致群体死亡率升高，获得的诱变个体数量不足。一旦构建出优良的群体，即可采用多种方法检测目标基因中的突变，具体平台的选择取决于实验规模和资源可及性。全基因组测序和外显子组测序已被用于表征小基因组植物 TILLING 群体中的全部突变15,16。两种小麦（普通小麦和硬粒小麦）的 TILLING 群体已开展外显子组测序，相关数据已公开，可供研究人员识别理想突变并申请获取感兴趣的突变品系17。这为获取理想突变提供了重要的公共资源；然而，在基因验证研究中，野生型亲本必须含有目标候选基因。遗憾的是，针对另一遗传背景下的少数候选基因进行基于反向遗传学的验证时，对整个 TILLING 群体进行外显子组测序仍因成本过高而难以普及。扩增子测序和基于 Cel-1 的检测方法已被用于小麦靶向群体中的突变检测，其中 Cel-1 检测操作更简便，无需计算分析知识，特别适用于仅具备基础实验设备条件下对少量基因进行验证6,18。
本文介绍了一种优良TILLING群体的构建方法，包括剂量曲线的制备、诱变处理与突变群体的保种、以及利用基于PCR的Cel-1酶切法对突变群体进行筛选。该方案已成功应用于突变群体的构建与利用 Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, 大麦， 粗山羊草7以及若干其他方法。文中包含了这些方法的具体细节，以及有助于研究人员利用EMS作为诱变剂，在任何选定的小粒谷类植物中构建TILLING群体的实用技巧。

<table><tbody><tr><td>96 孔 1.1 ml 微管（置于微管架中）</td><td>National Scientific</td><td>TN0946-08R</td><td>用于采集叶片组织</td></tr><tr><td>琼脂糖 I（生物技术级）</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>Biosprint 96 植物 DNA 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>941558</td><td>DNA 提取试剂盒</td></tr><tr><td>Cel-1 核酸内切酶</td><td>按 Till 等人 2006 年所述方法提取</td><td></td><td>单链特异性核酸内切酶</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲基磺酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-0880-25G</td><td>EMS，化学诱变剂</td></tr><tr><td>冷冻干燥/壳式冷冻系统</td><td>Labconco</td><td></td><td>用于叶片组织的冻干处理</td></tr><tr><td>Kingfisher Flex 核酸纯化系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5400610</td><td>高通量 DNA 提取机器人系统</td></tr><tr><td>My Taq DNA 聚合酶</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>NuGenius 凝胶成像系统</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbit Environ-shaker 摇床</td><td>Lab-line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPECTROstar Nano 全波长微体积分光光度计</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td>用于 DNA 定量的 NanoDrop 类型仪器</td></tr><tr><td>T100 热循环仪</td><td>BIO-RAD</td><td>1861096</td><td></td></tr></tbody></table>

通过甲基磺酸乙酯诱变法创制小粒谷类作物基因组定点诱导局部突变（tilling）群体

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

靶向诱导基因组局部突变（TILLING）是一种强大的反向遗传学工具，包括化学诱变以及对目标基因序列变异的检测。TILLING 是一种极具价值的功能基因组学工具，特别适用于转化技术存在严重局限的小粒谷类作物中的基因功能验证。构建一个稳定的诱变群体是决定基于 TILLING 的基因验证研究效率的关键。若 TILLING 群体的整体突变频率过低，则需要筛选极大规模的群体才能获得目标突变；而若诱变剂浓度过高，则会导致群体死亡率过高，从而无法获得足够数量的诱变个体。在成功构建有效群体后，可通过多种方法检测目标基因的突变，平台的选择取决于实验规模和资源的可及性。利用 Cel-1 酶切分析结合琼脂糖凝胶电泳进行突变体鉴定的方法具有操作简便、可重复性强且资源需求较低的优点。该方法无需复杂的计算知识，尤其适用于在基础实验设备条件下对少量基因进行验证。本文详细描述了构建优质 TILLING 群体的方法，包括剂量曲线的制备、诱变处理与突变群体的保种，以及利用基于 PCR 的 Cel-1 酶切分析对突变群体进行筛选的技术流程。

图2展示了六倍体普通小麦品种Jagger、二倍体小麦Triticum monococcum6以及小麦基因组供体Aegilops tauschii7的剂量反应曲线。为达到理想的50%存活率，T. monococcum、Ae. tauschii和T. aestivum所需的EMS剂量分别为约0.25%、0.6%和0.7%。六倍体小麦较高的EMS耐受性归因于其基因组的缓冲能力。然而，尽管同为二倍体，T. monococcum对EMS的耐受性几乎仅为Ae. tauschii的一半。因此，这些结果强调了为特定基因型确定合适EMS剂量的重要性。
M中存在易于识别的表型2</su...

本文描述了一种利用甲基磺酸乙酯（EMS）作为诱变剂，在小粒谷类作物中建立基因组定点诱导局部突变（TILLING）群体的实验方案。同时提供了一种使用Cel-1酶切法进行突变检测的实验方法。

通过甲基磺酸乙酯诱变法创制小粒谷类作物基因组定点诱导局部突变（TILLING）群体

靶向诱导基因组局部突变（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING）是一种强大的反向遗传学工具，包括化学诱变及序列变异的检测……

本方案详细介绍了通过EMS诱变在小粒谷类作物中建立高突变频率的高效TILLING群体的方法。TILLING群体可用于小粒谷类作物的功能基因组学研究，以及正向遗传学中的基因发现。采用本技术构建的TILLING群体具有较高的突变频率，且该方案可应用于任何基因型。基于Cel-1检测法的突变检测可使用常规实验室设备进行。其中最重要的步骤是确定最佳的EMS浓度。因此，应针对特定群体建立相应的EMS剂量曲线。首先，将基因型感兴趣的种子各100粒分别放入六个250毫升的玻璃锥形瓶中，每瓶加入50毫升蒸馏水进行浸泡。在室温下以100 RPM的转速振荡8小时，使种子充分吸胀。随后，在通风橱中，通过将EMS液体与蒸馏水混合，配制五种不同浓度的EMS溶液，每种50毫升。吸胀后，将五个烧瓶中的水倒出。在盛有吸胀种子的五个烧瓶中各加入50毫升EMS溶液。于75 RPM、室温条件下振荡16小时。现在，将EMS溶液倾倒至一个空的废液瓶中，并将处理过的种子倒入铺在另一个空废液瓶上的纱布中，每种处理需分别收集。可使用额外的水辅助转移种子。同时，向受污染的烧瓶壁喷洒数毫升EMS失活溶液。将使用过的移液器吸头浸入溶液中24小时。加入一倍体积的EMS失活溶液处理24小时，以使使用过的EMS溶液失活。用扎线将经EMS处理的种子固定在纱布内，在流动的自来水下冲洗两小时。清洗后，将每粒种子单独移栽至含有育苗土的育苗钵中。在20至25摄氏度条件下培养，光照周期为16小时。移栽15天后，检查植株并统计未萌发的种子数量。记录植物存活数据。若存活率不在40%至60%之间，则调整浓度后进行第二轮剂量优化，直至达到40%至60%的预期致死率。诱变实验结束后，从M2代植株上采集叶片组织，放入96孔组织收集板中。所采集的M2代植株由自交的M1代植株繁殖而来。从每株M1植株中选取一株M2植株。使用植物DNA提取试剂盒配合DNA纯化系统，按照制造商的推荐方法提取DNA。随后，将2 µL DNA提取物加入含有16个孔的LV板中。使用分光光度计在260和280纳米波长下定量DNA。用无核酸酶的水将DNA浓度稀释至每微升25纳克。将四个96孔板中每个孔的DNA按行和列的位置信息保持不变，分别合并至一个汇集板中，制备总体积为200微升的四份DNA混合样本池。接下来，根据文章所述，通过向每个试管中加入PCR缓冲液、特异性引物（正向和反向引物）以及DNA聚合酶，制备用于基因特异性引物的PCR预混液。将预混液分装至96孔PCR板的各孔中。然后，加入混合的DNA模板。将PCR管放入热循环仪中，使用降落式程序在热循环仪上运行PCR反应。为了在错配的DNA之间形成异源双链，将PCR产物在热循环仪中用不同的程序进行孵育。然后，向每个含有异源双链的PCR产物中加入2.5微升自制的Cel-1核酸内切酶。在 45 摄氏度下孵育 45 分钟。随后，通过加入 2.5 µL pH 8 的 0.5 M EDTA 终止 Cel-1 反应。将每份经 Cel-1 处理的产物 30.5 µL 与 5 µL 染料混合后，上样至 3% 琼脂糖凝胶，于 100 伏电压下电泳运行两个半小时。为了分离突变体池，可通过进行两轮PCR反应来确定突变体的纯合性或杂合性，即对单个M2代DNA样本进行检测：第一轮反应包含2.5 µL M2 DNA和2.5 µL野生型DNA，第二轮反应仅包含5 µL M2 DNA。本方案展示了利用EMS对小粒谷类作物进行诱变以及突变体的鉴定方法。剂量曲线显示了三种不同小麦物种达到理想50%存活率时所需的最优EMS剂量。在M2群体中观察到易于识别的表型，证实了诱变在小粒谷物群体中的有效性。以下是M2代TILLING群体中四种突变表型的实例：大麦M2群体中的白化突变体、大麦M2群体中的缺绿突变体、拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops tauschii）M2群体中具有粉红色斑驳的花斑突变体，以及一粒小麦（Triticum monococcum）M2群体中的少分蘖突变体。利用Cel-1酶在琼脂糖凝胶平台上进行突变体鉴定，结果显示在12个突变体池中，通过特异性切割条带识别出一个潜在的突变池。通过解卷积突变体池可确定突变的杂合性，并有助于将突变追踪至单个样品。A4池含有杂合突变，表现为Box 4和Box 4野生型DNA样品中均出现切割条带。H5池含有纯合突变，因为仅在Box 5 H5野生型DNA样品中出现特有的切割条带。最重要的步骤是确定EMS的最佳浓度，以达到40%至60%的致死率。一旦建立了具有高突变频率的TILLING群体，该群体即可用于任何目标基因的功能鉴定。此外，该群体还可作为作物改良中有用遗传变异的来源。TILLING 技术已广泛应用于模式植物和作物植物的功能基因组学研究。所获得的突变类型包括错义突变、基因敲除、沉默突变，甚至剪接错误的形式。EMS 是一种诱变剂。因此，操作 EMS 时应使用适当的个人防护装备。对剩余溶液和使用过的移液器吸头进行去污染处理。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

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