通过甲基磺酸乙酯诱变法创制小粒谷类作物基因组定点诱导局部突变（TILLING）群体

本方案详细介绍了通过EMS诱变在小粒谷类作物中建立高突变频率的高效TILLING群体的方法。TILLING群体可用于小粒谷类作物的功能基因组学研究，以及正向遗传学中的基因发现。采用本技术构建的TILLING群体具有较高的突变频率，且该方案可应用于任何基因型。

基于Cel-1检测法的突变检测可使用常规实验室设备进行。其中最重要的步骤是确定最佳的EMS浓度。因此，应针对特定群体建立相应的EMS剂量曲线。

首先，将基因型感兴趣的种子各100粒分别放入六个250毫升的玻璃锥形瓶中，每瓶加入50毫升蒸馏水进行浸泡。在室温下以100 RPM的转速振荡8小时，使种子充分吸胀。随后，在通风橱中，通过将EMS液体与蒸馏水混合，配制五种不同浓度的EMS溶液，每种50毫升。

吸胀后，将五个烧瓶中的水倒出。在盛有吸胀种子的五个烧瓶中各加入50毫升EMS溶液。于75 RPM、室温条件下振荡16小时。

现在，将EMS溶液倾倒至一个空的废液瓶中，并将处理过的种子倒入铺在另一个空废液瓶上的纱布中，每种处理需分别收集。可使用额外的水辅助转移种子。同时，向受污染的烧瓶壁喷洒数毫升EMS失活溶液。

将使用过的移液器吸头浸入溶液中24小时。加入一倍体积的EMS失活溶液处理24小时，以使使用过的EMS溶液失活。用扎线将经EMS处理的种子固定在纱布内，在流动的自来水下冲洗两小时。

清洗后，将每粒种子单独移栽至含有育苗土的育苗钵中。在20至25摄氏度条件下培养，光照周期为16小时。移栽15天后，检查植株并统计未萌发的种子数量。

记录植物存活数据。若存活率不在40%至60%之间，则调整浓度后进行第二轮剂量优化，直至达到40%至60%的预期致死率。诱变实验结束后，从M2代植株上采集叶片组织，放入96孔组织收集板中。所采集的M2代植株由自交的M1代植株繁殖而来。

从每株M1植株中选取一株M2植株。使用植物DNA提取试剂盒配合DNA纯化系统，按照制造商的推荐方法提取DNA。随后，将2 µL DNA提取物加入含有16个孔的LV板中。

使用分光光度计在260和280纳米波长下定量DNA。用无核酸酶的水将DNA浓度稀释至每微升25纳克。将四个96孔板中每个孔的DNA按行和列的位置信息保持不变，分别合并至一个汇集板中，制备总体积为200微升的四份DNA混合样本池。

接下来，根据文章所述，通过向每个试管中加入PCR缓冲液、特异性引物（正向和反向引物）以及DNA聚合酶，制备用于基因特异性引物的PCR预混液。将预混液分装至96孔PCR板的各孔中。然后，加入混合的DNA模板。

将PCR管放入热循环仪中，使用降落式程序在热循环仪上运行PCR反应。为了在错配的DNA之间形成异源双链，将PCR产物在热循环仪中用不同的程序进行孵育。然后，向每个含有异源双链的PCR产物中加入2.5微升自制的Cel-1核酸内切酶。

在 45 摄氏度下孵育 45 分钟。随后，通过加入 2.5 µL pH 8 的 0.5 M EDTA 终止 Cel-1 反应。将每份经 Cel-1 处理的产物 30.5 µL 与 5 µL 染料混合后，上样至 3% 琼脂糖凝胶，于 100 伏电压下电泳运行两个半小时。

为了分离突变体池，可通过进行两轮PCR反应来确定突变体的纯合性或杂合性，即对单个M2代DNA样本进行检测：第一轮反应包含2.5 µL M2 DNA和2.5 µL野生型DNA，第二轮反应仅包含5 µL M2 DNA。本方案展示了利用EMS对小粒谷类作物进行诱变以及突变体的鉴定方法。剂量曲线显示了三种不同小麦物种达到理想50%存活率时所需的最优EMS剂量。

在M2群体中观察到易于识别的表型，证实了诱变在小粒谷物群体中的有效性。以下是M2代TILLING群体中四种突变表型的实例：大麦M2群体中的白化突变体、大麦M2群体中的缺绿突变体、拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops tauschii）M2群体中具有粉红色斑驳的花斑突变体，以及一粒小麦（Triticum monococcum）M2群体中的少分蘖突变体。利用Cel-1酶在琼脂糖凝胶平台上进行突变体鉴定，结果显示在12个突变体池中，通过特异性切割条带识别出一个潜在的突变池。

通过解卷积突变体池可确定突变的杂合性，并有助于将突变追踪至单个样品。A4池含有杂合突变，表现为Box 4和Box 4野生型DNA样品中均出现切割条带。H5池含有纯合突变，因为仅在Box 5 H5野生型DNA样品中出现特有的切割条带。

最重要的步骤是确定EMS的最佳浓度，以达到40%至60%的致死率。一旦建立了具有高突变频率的TILLING群体，该群体即可用于任何目标基因的功能鉴定。此外，该群体还可作为作物改良中有用遗传变异的来源。

TILLING 技术已广泛应用于模式植物和作物植物的功能基因组学研究。所获得的突变类型包括错义突变、基因敲除、沉默突变，甚至剪接错误的形式。EMS 是一种诱变剂。

因此，操作 EMS 时应使用适当的个人防护装备。对剩余溶液和使用过的移液器吸头进行去污染处理。