由单体生成α-突触核蛋白预制纤维及其在体内的应用

全球各地的实验室正在使用α-突触核蛋白预制纤维模型来研究突触核蛋白病。尽管许多实验室已成功应用该模型，但部分研究团队在制备纤维以及诱导稳定的α-突触核蛋白病理方面遇到了不一致的问题。我们希望本实验方案——详细描述了从α-突触核蛋白单体生成纤维的过程，以及在体内的预制纤维使用方法——能够解答研究人员在使用该模型时所遇到的疑问。

α-突触核蛋白预形成纤维模型可重现帕金森病的关键特征，例如α-突触核蛋白病理改变和神经退行性变。已有研究表明，该模型可在某些动物模型中引发轻度运动功能障碍。含有磷酸化α-突触核蛋白的包涵体形成以及神经退行性变的长期发展过程，为研究人员提供了突触核蛋白病进展过程中的不同阶段，可用于研究并作为潜在治疗干预的靶点。

正在演示定制玻璃针制备过程的是我们的实验室技术员 Christopher Kemp。开始此操作时，将α-突触核蛋白单体置于冰上解冻。通过轻轻弹击离心管，重新悬浮解冻后的单体。

在15,000 g、4°C条件下离心10分钟。然后将上清液转移至洁净的1.5 mL微量离心管中，并记录转移的体积。用1×dPBS将单体稀释至终浓度为每毫升5 mg。

短暂涡旋混匀，短暂离心以将管底所有液体收集至管底。随后使用封口膜密封微量离心管管盖。将管子放入带盖的轨道式恒温混匀仪中，在37°C、1,000 rpm的振荡条件下孵育七天。

七天结束时，试管内的内容物应呈现浑浊状态。首先，穿戴好所有必要的个人防护装备，包括手套、实验服和面罩。然后在细胞培养超净台中，将直径为3.2 mm的探头连接至转换器。

将超声破碎仪的振幅设置为30%，脉冲设置为开启1秒、关闭1秒，时间设置为1分钟。在室温下解冻纤维，解冻后仍在生物安全柜内操作，用无菌dPBS稀释纤维。接着，用70%乙醇浸湿实验室纸巾，并用其擦拭超声破碎仪的探头以进行清洁。

将探针尖端浸入双蒸水中，脉冲10次以进一步清洁探针。随后用实验用纸巾将探针擦干。将清洁后的探针尖端放入含有稀释纤维的离心管中，并将尖端置于管底。

使用先前设定的参数对稀释后的纤维进行超声处理，在每次脉冲过程中上下移动探头，以确保液体中的所有纤维均被超声处理。超声处理后，在2,000 g条件下短暂离心1秒，使管壁上的液体全部收集至管底。将探头尖端浸入1% SDS溶液中，脉冲10次以清洗探头。

然后，将探头从SDS中取出，浸入双蒸水中，脉冲处理10次。用70%乙醇润湿的实验室纸巾擦拭探头，并用干燥的实验室纸巾擦干。将探头从转换器上拆下并妥善保存。

此后，先用 1% SDS 擦拭生物安全柜内的所有表面，再用 70% 乙醇擦拭。开始操作时，将硅化玻璃毛细管插入玻璃微电极拉制仪中。打开加热元件，使连接的重物拉伸被加热的玻璃毛细管。

接下来，使用剪刀在拉制好的玻璃毛细管中间最细处剪断，并将玻璃针从玻璃针拉制仪上取下。然后，用剪刀截取一段长约40 mm的热缩管。将热缩管套在10微升斜面注射器的金属针头上。

使用明火加热并使热缩管紧贴针头，同时确保旋转针头以均匀受热。小心地将拉制的玻璃针较粗的一端套入注射器的金属针上。然后，截取一段长约 40 mm 的热缩管，小心地套在玻璃针上，使其覆盖玻璃针的基部与注射器金属针的重叠区域。

使用明火加热热缩管，以将玻璃针固定在金属针上。为进一步固定针头并防止潜在泄漏，另剪一段长约40 mm的热缩管，小心地将其套过玻璃针，使其覆盖玻璃针底部与注射器金属针的连接处。使用明火加热热缩管，使玻璃针与金属针牢固连接。

然后，使用剪刀修剪玻璃针，使针尖长度约为 8 mm。测试针头时，用蒸馏水填充一支带有 26 号针头的 1 mL 注射器。从定制的玻璃针注射器中取出金属推杆，将装有水的注射器的针头插入定制注射器的底部。

检查玻璃针与金属针接口处是否有泄漏，并确认水流稳定。然后，用蒸馏水充满一个微量离心管。使用定制的玻璃针头注射器吸取蒸馏水。

检查针头，确认液体已吸入注射器内且无气泡。若存在气泡，或水未被吸入针头，可修剪针头以缓解压力。此后，将带有连接玻璃针头的注射器小心存放于注射器盒中，待手术时取出使用。

通过透射电子显微镜观察可确认存在长纤维状结构。相比之下，α-突触核蛋白单体几乎不可见，且无明确形态。随后使用硫黄素T检测法进一步验证纤维的类淀粉样特征。

一项代表性检测结果显示，与小鼠PFFs相比，dPBS和小鼠单体产生的相对荧光单位信号较低。人源α-突触核蛋白单体产生的信号与小鼠单体相似。而人源PFFs产生的信号同样高于单体。

为了评估可沉淀纤维的存在，需进行沉降实验。在小鼠和人源PFF样本中，沉淀部分的蛋白含量应高于上清部分。相比之下，小鼠和人源单体中的大部分蛋白存在于上清中，而沉淀中含量极少。

小鼠和人源PFF均经过超声处理，以获得适合诱导α-突触核蛋白包涵体形成的适当长度的PFF。对约500根纤维的全面检测显示，小鼠纤维的平均长度约为44纳米，其中86.6%的PFF长度在60纳米或以下。

然而，人源PFFs的平均长度约为55.9纳米，其中69.6%的PFFs长度在60纳米或以下。通过免疫组织化学方法确认PFF在体内的功效。在黑质中形成的包涵体与路易小体具有相似的特性，即含有磷酸化的α-突触核蛋白，包含淀粉样结构，可被硫黄素S染色，并且对蛋白酶K消化具有抗性。

超声处理可能使操作者暴露于气溶胶化的预形成纤维。因此，应穿戴适当的防护装备，并在通风橱内进行超声处理，以尽量降低暴露风险。