Name: 从单体和体内使用的Α-syr核 in 预成型纤维的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 了解α-突触核蛋白预成型纤维的生成与验证方法，包括单体准备、7天振荡孵育、超声处理及质量控制步骤。该标准化方案适用于帕金森病突触核蛋白病动物模型的建立与研究。

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本研究获得了迈克尔·J·福克斯基金会、国家神经疾病与卒中研究所（NS099416）以及韦斯顿脑研究所的资助。

所有涉及动物的实验方法均已获得密歇根州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 由单体形成α-突触核蛋白预成纤维（图1）
<ol>
	<li>将α-突触核蛋白单体在冰上解冻，轻轻弹击离心管使其重悬，然后在4 °C下以15,000 × g 离心10分钟。 
	注：α-突触核蛋白单体必须专为纤维化设计。重组单体可从商业来源购买，或通过现场实验方案制备4,9,14,15。若从商业来源购买，产品说明必须明确指出该α-突触核蛋白单体专用于纤维生成。无论单体是购买还是现场制备，每一批次均应执行下述质量控制步骤，以确保纤维已形成，并可在实验使用前有效作为种子。</li>
	<li>将上清液转移至洁净的1.5 mL微量离心管中，并记录转移的体积。 
	注：操作时需小心避免接触沉淀，若存在沉淀，其体积通常很小。</li>
	<li>通过标准的双辛可宁酸法（BCA）测定转移上清液的蛋白浓度，或使用微量分光光度计测定280 nm处的吸光度。 
	注：BCA法对α-突触核蛋白的特异性测定不够准确，可能导致蛋白浓度被高估。因此，推荐使用280 nm吸光度法测定蛋白浓度。
	<ol>
		<li>若使用BCA法测定，请遵循标准BCA操作流程，并对α-突触核蛋白单体进行三种不同稀释度的测定。建议稀释度为1:25、1:50和1:100。</li>
		<li>若使用A280法测定，使用不含钙和镁的无菌1×杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（dPBS），其盐浓度约为100 mM NaCl，pH范围为7.0–7.3，对仪器进行调零（材料表）。</li>
		<li>向仪器中加入2 µL样品，读取280 nm处的吸光度。</li>
		<li>使用比尔-朗伯定律计算单体的浓度。 
		<img alt="浓度计算公式；280 nm处吸光度；光谱分析；生物化学计算" src="/files/ftp_upload/59758/59758eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式1"> 
		注：人源α-突触核蛋白的消光系数ε为5,960 M-1cm-1，小鼠源为7,450 M-1cm-1。光程以cm为单位。α-突触核蛋白的分子量（14 kDa）按1 Da = 1 g/mol估算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1× dPBS将单体稀释至终浓度为5 mg/mL。使用下式计算所需添加的1× dPBS体积。 
	<img alt="聚合实验中单体制备的体积计算公式；公式显示比例关系" src="/files/ftp_upload/59758/59758eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式2"> 
	注：所有浓度单位为mg/mL，体积单位为µL。单体稀释应使用1× dPBS。用于生成纤维的总体积应在100–500 µL之间，以获得可重复的纤维化结果。</li>
	<li>短暂涡旋混匀，然后离心使液体全部聚集于管底。按步骤1.8.1–1.8.4所示，分装单体用于后续与纤维的质量对照比较。</li>
	<li>使用管盖锁或蜡膜/塑料封口膜（材料表）将微量离心管管盖密封固定。</li>
	<li>将离心管放入带盖的轨道式恒温混匀仪中，在37 °C下以1,000 RPM振荡7天（材料表）。 
	注：7天结束后，管内内容物应呈现浑浊状态。恒温混匀仪必须加盖，以防止管盖上形成冷凝水。</li>
	<li>轻轻弹击离心管以重悬α-突触核蛋白纤维。按步骤1.8.1–1.8.4所示，分装纤维用于以下质量控制步骤。 
	注：用于质量控制的纤维可在室温下保存过夜。
	<ol>
		<li>分装6 µL用于沉降实验。</li>
		<li>分装5 µL用于硫磺素T结合实验。</li>
		<li>分装2 µL用于透射电子显微镜观察纤维形态。</li>
		<li>至少分装10 µL用于内毒素检测。 
		注：内毒素检测使用商用的鲎试剂（LAL），按照制造商说明书操作（材料表）。纤维的内毒素水平应≤0.5内毒素单位/mL。若未达标，可使用内毒素去除试剂盒进行处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将剩余纤维分装并储存。如需长期保存（12–18个月），应迅速在干冰上冷冻，并于-80 °C保存。 
	注：分装量取决于后续应用需求。体内实验通常比体外实验需要更高浓度和更多量的纤维，因此应据此规划分装体积。纤维应存放于冰箱后部，以避免因反复冻融造成损伤。本方案可在此处暂停。</li>
</ol>
2. 沉降实验
<ol>
	<li>在干净的微量离心管中，将 6 µL PFF 加入 54 µL dPBS 中，使纤维稀释至 1:10，用移液器吹打混匀。
	<ol>
		<li>在另一管中，加入 6 µL 单体至 54 µL dPBS 中，作为额外对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下以 10,000 × g 离心样品 30 分钟，将上清转移至新的干净微量离心管中。</li>
	<li>向剩余沉淀中加入 60 µL dPBS，涡旋振荡以重悬沉淀。</li>
	<li>向每管中加入 30 µL 3× 上样缓冲液（140 µL 50% 甘油/0.1% 溴酚蓝，40 µL 10% SDS，以及 20 µL β-巯基乙醇），涡旋混匀。</li>
	<li>在 100 °C 孵育样品 10 分钟，随后置于冰上冷却 5 分钟。</li>
	<li>采用标准的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法按分子量分离蛋白质。使用包含 14 kDa（预期为单体 α-syn 的条带大小）在内的蛋白分子量标记。</li>
	<li>将凝胶转移至染色皿中，加入足量考马斯亮蓝染液（0.1% 考马斯亮蓝，20% 甲醇体积分数，10% 乙酸体积分数，溶于 ddH2O）覆盖凝胶，室温摇动染色 3 小时。</li>
	<li>倒去考马斯亮蓝染液，加入足量脱色液（50% 甲醇体积分数，10% 乙酸体积分数，溶于 ddH2O）覆盖凝胶，室温摇动脱色 30 分钟。</li>
	<li>倒去脱色液，并重复脱色步骤，直至背景清晰、条带可见。</li>
	<li>用 ddH2O 洗涤凝胶，每次 5 分钟，共洗 3 次，然后成像。</li>
</ol>
3. 用于纤维可视化观察的透射电子显微镜技术
<ol>
	<li>在微量离心管中称取 20 mg 醋酸铀酰，加入 1 mL ddH₂O2O 配制 2% 的水溶液。涡旋振荡直至乙酸铀酰完全溶解，并静置过夜。 
	注意：醋酸铀酰应在透射电子显微镜样品制备的前一天配制。光照或震荡可导致醋酸铀酰沉淀，因此，含有醋酸铀酰溶液的试管应包裹铝箔，置于暗处保存，且在醋酸铀酰溶解后不得摇动。</li>
	<li>添加 2 µL PFF的 98 µL 加入 dPBS 将纤维稀释至 1:50，然后用移液器混匀。</li>
	<li>准备一张干净的石蜡/塑料薄膜（材料清单）覆盖工作台面约50 mm × 50 mm的区域。将洁净的石蜡/塑料膜（材料清单），添加以下内容（图2).
	<ol>
		<li>加入 4 x 10 µL ddH₂O 滴液2O.</li>
		<li>加入 1 x 10 µL 稀释后的纤维或单体样品一滴</li>
		<li>加入 2 x 10 µL 2%醋酸铀酰溶液滴加</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用尖头镊子夹取一个经甲醛/碳膜包被的铜网透射电子显微镜载网（材料表). 
	注意：务必仅从边缘处夹取载网，避免接触中心的网格部分（图2A）。若镊子接触到网格，会使聚乙烯醇/碳涂层薄膜受损，导致该区域网格无法成像。</li>
	<li>将载网的方华膜/碳支持膜面（光面）朝下漂浮在第一滴去离子水上2O. 用镊子轻轻夹住载网并向下按压，确保整个包被表面与ddH₂O充分接触。2O. 让载网漂浮1分钟。</li>
	<li>用镊子夹起载网，不要触碰载网的网格部分，用滤纸从侧面吸去多余的ddH₂O2用滤纸吸干。</li>
	<li>像上述操作一样，将载网漂浮在第二滴ddH₂O上2O 孵育 1 分钟，吸去 ddH₂O2O.</li>
	<li>将载网在稀释后的纤维液滴上漂浮1分钟，然后如上所述用滤纸吸去多余液体。</li>
	<li>将载网在第一滴醋酸铀酰溶液上漂浮1分钟，然后用滤纸吸去多余液体。</li>
	<li>将载网在第二滴醋酸铀酰溶液上漂浮1分钟，用滤纸吸去多余液体。</li>
	<li>将载网如上所述漂浮于第三滴去离子水上2O 短暂孵育并吸除 ddH₂O2O.</li>
	<li>像上述操作一样，将载网漂浮于第四滴ddH₂O上2O 简短孵育并吸除 ddH₂O2O，务必尽可能移除全部 ddH₂O2尽可能快。</li>
	<li>转移至网格盒中保存，直至成像。 
	注意：载网在成像前应干燥至少5分钟。制备后的载网可在干燥环境中保存至少一年，并可用于成像。</li>
</ol>
4. 硫黄素T检测
<ol>
	<li>取一个洁净的微量离心管，加入 5 µL PFF 和 245 µL dPBS，将纤维稀释至 1:50，用移液器吹打混匀。</li>
	<li>另取一个微量离心管，加入 250 µL dPBS，作为阴性对照。</li>
	<li>向另一个微量离心管中加入 5 µL 单体和 245 µL dPBS，作为单体对照。</li>
	<li>向每个样品中加入 250 µL 刚果红染料 T 甘氨酸缓冲液（25 µM 刚果红染料 T，100 mM 甘氨酸，1% Triton X-100，pH 8.5），轻轻混匀。</li>
	<li>将每个样品取两份重复，每份 200 µL，加入黑色 96 孔板中。将板置于避光处，防止荧光漂白。</li>
	<li>在室温下孵育 1 小时，使用激发波长 450 nm、发射波长 510 nm 读取荧光值。 
	注意：刚果红染料 T 的读数会随时间波动。所有样品应在相同的孵育时间点进行检测。如需要，可在 1 小时孵育期间进行多次读数，并绘制随时间变化的荧光曲线。</li>
</ol>
5. α-突触核蛋白预制纤维的超声处理
注意：超声波破碎仪及所有超声步骤均须在生物安全柜中进行，以防止超声过程中可能产生的纤维气溶胶暴露。操作超声步骤的人员应穿戴个人防护装备，包括手套、实验服形式的衣物防护以及面部防护罩。使用杯式超声探头（cup horn sonicator）进行超声处理可降低纤维暴露风险，该方法可在超声过程中保持含有纤维的管子处于封闭状态。
注意：纤维的超声处理最佳参数取决于所使用的超声仪型号。因此，需要进行一些优化，以确保纤维达到合适的尺寸。所用超声仪见于材料表，此处列出的参数基于使用该型号超声仪获得的先前结果。以下参数适用于在200–400 µL溶液中含2–4 µg/µL的PFFs。在将PFFs用于实验之前，应先进行超声处理测试，并分析纤维，以确保达到预期效果。
<ol>
	<li>将直径为 3.2 mm 的探头（材料表）连接至转换器，并按照以下第 5.1.1 - 5.1.3 步中的说明设置超声破碎仪参数。
	<ol>
		<li>将振幅设为 30%。</li>
		<li>将脉冲模式设为 01 01（开启 1 秒；关闭 1 秒）。</li>
		<li>将时间设为 0:01:00。 
		注意：1 分钟的脉冲相当于 60 次脉冲，本型号超声破碎仪（材料表）将自动停止。对于其他型号的超声破碎仪，需手动计数脉冲次数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下解冻原纤维，并在生物安全柜中用无菌 dPBS 稀释。 
	注意：用于超声处理的最佳容器为透明的 0.6 mL 微离心管，最终原纤维浓度取决于具体用途。图示代表性结果来自终浓度为 4 µg/µL 的原纤维溶液。</li>
	<li>用蘸有 70% 乙醇的实验室纸巾擦拭超声破碎仪探头以清洁探头。将探头尖端浸入 ddH2O 中，脉冲 10 次以进一步清洗，然后用干燥的实验室纸巾擦干。</li>
	<li>将探头尖端插入稀释后的原纤维管中，并将尖端置于管底。</li>
	<li>进行 60 次脉冲（开启 1 秒；关闭 1 秒）的超声处理。在每次脉冲过程中上下移动探头，以确保液体中的所有原纤维均被充分处理，并保持清洁。</li>
	<li>完成 60 次脉冲后，将探头从 PFFs 中取出，在洁净的微离心管中加入 2 µL PFF 和 98 µL dPBS，将原纤维稀释至 1:50，用于透射电镜检测超声处理后的原纤维形态。 
	注意：理想情况下，应在体内注射前测量少量原纤维样本；若时间允许，应进行更全面的原纤维尺寸分析。</li>
	<li>超声处理后，将 PFFs 在 2,000 xg 条件下短暂离心 1 秒，使管壁上的液体全部收集至管底。 
	警告：若管壁明显发热，应在 30 次脉冲后暂停超声，等待 1 分钟后再完成剩余 30 次脉冲。 
	注意：超声过程中，每次脉冲开始时应将探头尖端保持在液面底部附近，若过于接近液面顶部可能导致样品损失。</li>
	<li>将探头尖端浸入 1% SDS 溶液中，脉冲 10 次以清洗探头。将探头从 SDS 中取出后，浸入 ddH2O 中再脉冲 10 次。</li>
	<li>用蘸有 70% 乙醇的实验室纸巾擦拭探头，再用干燥的实验室纸巾擦干。将探头从转换器上拆下并妥善存放。</li>
	<li>用 1% SDS 溶液擦拭生物安全柜内所有表面，随后再用 70% 乙醇擦拭。 
	注意：1% SDS 溶液用于解离原纤维并清洁表面及设备16。</li>
</ol>
6. 用于测量超声处理后纤维的透射电子显微镜技术
注意：如果无法进行电子显微镜检测，可使用硫黄素T动力学分析和动态光散射作为种子效率和纤维尺寸的间接测量方法4,14。
<ol>
	<li>使用上述“原纤维可视化电子显微镜”部分的方案制备样品。</li>
	<li>使用透射电子显微镜对6至10个不同网格孔区的原纤维进行成像。 
	注意：图像的放大倍数应足够高以测量原纤维，但又需足够低以便同时观察多个原纤维。最终放大倍数约为75,000倍时通常已足够。</li>
	<li>在将原纤维用于实验之前，测量至少25根原纤维的小样本长度。 
	注意：这些测量通常可使用显微镜配套的成像软件完成。在快速验证过程中，测量人员应选择具有代表性的原纤维并计算其平均尺寸。原纤维长度平均应约为50 nm或更短，后续可进行更精确的测量。</li>
	<li>为获得更全面的结果，测量500根以上的原纤维长度。 
	注意：可使用显微镜配套的成像软件进行原纤维长度测量。或者，也可使用图像处理软件打开图像并测量原纤维长度，利用每幅图像附带的比例尺作为尺寸参考，与原纤维长度进行比较。</li>
</ol>
7. 立体定位注射用定制玻璃针头注射器的制备（图3）
<ol>
	<li>向一个洁净的 50 mL 烧杯中加入约 10 mL 的硅化试剂（材料表）。</li>
	<li>将玻璃毛细管（长度 54 mm；外径：0.86 mm；内径：0.59 mm）垂直放入盛有硅化试剂的烧杯中，使毛细作用通过浸没在硅化试剂中的毛细管下端开口将试剂吸入管内。</li>
	<li>用移液器将额外的硅化试剂加入未浸没在硅化试剂中的毛细管上端开口，以完全充满玻璃毛细管。</li>
	<li>将毛细管从硅化试剂中取出，并用纸巾轻压管口两端以吸除管内残留的硅化试剂。让毛细管干燥至少 8 小时。</li>
	<li>将一根已硅化的玻璃毛细管放入玻璃微电极拉制仪中（材料表）。</li>
	<li>打开加热元件，使连接的重物拉伸受热的玻璃毛细管。</li>
	<li>用剪刀在中间最细处剪断被拉长的玻璃毛细管，并从玻璃微电极拉制仪中取出玻璃微针。 
	注：拉制后的微针内径和外径应分别约为 80 和 100 µm。可一次性制备多个玻璃微针，并在使用前储存，待其连接至带有金属针头的玻璃注射器（材料表）时再使用。</li>
	<li>用剪刀将热缩管（平均内径 0.021"，平均壁厚 0.001"）剪成约 40 mm 长的一段。将其滑套至 10 µL 斜面注射器的金属针头上（材料表）。</li>
	<li>使用明火加热并粘合热缩管，同时旋转针头以均匀受热。</li>
	<li>小心地将拉制玻璃微针的较粗一端套入注射器的金属针头上。</li>
	<li>用剪刀将另一段热缩管（平均内径 0.036"，平均壁厚 0.005"）剪成约 40 mm 长，小心地滑套至玻璃微针上，使其覆盖玻璃微针基部与注射器金属针头的连接处（材料表）。使用明火加热热缩管，以固定玻璃微针与金属针头的连接。</li>
	<li>再加一层热缩管以进一步加固玻璃微针。用剪刀将一段热缩管（平均内径 0.044"，平均壁厚 0.005"）剪成约 40 mm 长，小心地滑套至玻璃微针上，使其覆盖玻璃微针基部与注射器金属针头的连接处（材料表）。使用明火加热热缩管，以确保玻璃微针牢固连接于金属针头。</li>
	<li>用剪刀修剪玻璃微针，使其尖端长度约为 8 mm。 
	注：微针需足够长以靶向目标脑区（具体长度取决于背侧/腹侧坐标）。</li>
	<li>使用步骤 7.14.1–7.14.3 检测微针，确保无泄漏，并在从玻璃微针吸液和排液时均有足够的液体流动。
	<ol>
		<li>用 1 mL 注射器连接 26 号针头，并吸入 dH2O。</li>
		<li>从定制的玻璃微针注射器中取出金属推杆，将装有 dH2O 的注射器针头插入注射器基部。施加压力，从玻璃微针中排出 dH2O。检查玻璃微针与金属针头连接处是否有泄漏，并确认 dH2O 流动稳定。 
		注：如有需要，可修剪玻璃微针以改善流动，并增加热缩管层数以封堵玻璃微针基部的泄漏。</li>
		<li>在微量离心管中加入 dH2O。使用定制的玻璃微针注射器吸取 dH2O。观察微针，确认液体被吸入注射器内且无气泡产生。 
		注：若存在气泡或 dH2O 无法被吸入微针，可尝试修剪微针以缓解压力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将连接有玻璃微针的注射器小心存放于注射器盒中，待手术时使用。</li>
	<li>采用标准立体定位手术方法，在优化坐标下将 PFFs 注入小鼠（单一位点：前囟后 +0.2 mm，内侧 +2.0 mm，硬膜下 -2.6 mm）或大鼠（两个位点：前囟后 +1.6 mm，内侧 +2.0 mm，硬膜下 -4.0 mm；前囟后 +0.1 mm，内侧 +4.2 mm，硬膜下 -5.0 mm）的纹状体1,14,17。 
	注：上述坐标适用于 C57BL6/C3H 小鼠和 Fischer 344 大鼠。使用其他品系时，应优化坐标。</li>
</ol>

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
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Joseph Patterson、Kelvin Luk 和 Caryl Sortwell 目前与迈克尔·J·福克斯基金会存在合同安排，负责对 Proteos, Inc. 生成的 α-突触核蛋白材料进行质量控制。共同作者 Nicole Polinski 是迈克尔·J·福克斯基金会的雇员，该基金会已委托 Proteos, Inc. 生产 α-突触核蛋白单体。共同作者 Megan Duffy、Laura Volpicelli-Daley 和 Nicholas Kanaan 无任何利益冲突需要披露。

生成能够引发神经元病变并导致类似路易小体包涵体的α-突触核蛋白PFFs（α-syn PFFs）的过程依赖于多个因素和步骤。其中一个关键因素是，用于生成纤维的单体必须经过专门配制以促进纤维化4,9,14,15。如果单体未针对纤维化进行优化配制，则可能无法形成纤维，或形成的纤维无法诱导α-突触核蛋白病理改变。同样，单体所处的缓冲液也会影响纤维化的效率。因此，为获得最佳结果，盐浓度应约为100 mM NaCl，pH值应控制在7.0至7.3之间。一个可能引入变异性的初始步骤是蛋白质初始含量的测定方法，其中在A280处进行测量可能提供更准确的结果，因此是首选方法。蛋白质浓度的偏差不仅会降低纤维化过程的效率，还会影响实验中所用PFF浓度的准确性。这两者均可能导致种子效应效率下降以及不同实验批次间的差异。
初始质量控制步骤将确认PFFs的关键特征，具体包括：具有纤维状构象（透射电子显微镜检测）、含有淀粉样结构（硫黄素T检测）以及可被沉淀（沉降检测）。需要注意的是，硫黄素T检测结果会随时间波动，不能直接反映样品中淀粉样结构的含量；因此，硫黄素T检测仅应作为判断样品中是否存在淀粉样结构的指示性方法。硫黄素T通常用于体外实验，例如上述用于证明纤维含有淀粉样结构的检测。相比之下，硫黄素S则常用于组织中淀粉样结构的检测，如图7所示。关于沉降检测，其结果仅表明PFFs主要存在于可沉淀组分中。由于样品在变性条件下电泳，凝胶上仅出现一条约14 kDa的显著条带，该大小对应于α-突触核蛋白单体。这与使用天然或非变性凝胶时预期出现的多个高分子量条带不同。最后，即使成功通过上述所有初始质量控制步骤，也不能保证PFFs具备诱导α-突触核蛋白包涵体形成的活性。因此，在将PFFs用于大规模实验之前，应通过细胞培养实验或少量手术注射动物实验来验证其有效性。
超声处理是该过程中的关键步骤，其参数会因所使用的超声仪型号不同而有所差异。必须设定并验证超声参数，以证明已产生较短的PFF片段。纤维的长度会影响接种效率，较短的纤维具有更高的接种效率。尽管较短的纤维接种效率更高，但这种效应会达到平台期，最佳PFF长度约为50 nm4,18。还需注意避免对样品过度超声以及使PFF暴露于过多热量中，因为这可能会降低接种效率。这些经超声处理的PFF在用于大规模实验之前，应先在小规模细胞培养或体内实验中测试其有效性。由于不同批次的超声处理可能引入变异性，实验分组应据此合理设计。
在体内递送PFFs时，注射位点的位置以及所用PFFs的总量可能会影响形成包涵体的神经元数量以及神经退行性变的程度7,14。本方案中提供的坐标可作为起始参考，但应在实验室内部进行验证，以确保在大规模实验应用前，目标脑区能够出现α-突触核蛋白病理改变。如有需要，可预先使用示踪染料或荧光微珠来验证特定脑区的靶向准确性，再进行PFFs注射。不同研究团队在体内使用的PFFs剂量有所不同，大多数团队在单个或分为两个注射位点的条件下，总用量介于5至20 µg之间1,2,3,4,5,6,7,14。由于注射位点的数量、位置以及注射PFFs的剂量均可能影响突触核蛋白病的实验结果和疾病进展，因此在利用该模型测试潜在干预措施或研究其时间动态特征之前，应先对所采用参数的下游效应进行充分表征。
在选择用于测试治疗手段或研究疾病进展的模型时，应根据所要回答的科学问题来选择最合适的模型。并非所有模型都具备帕金森病（PD）的某些疾病特征，或提供测试潜在干预措施所需的时间框架。PFF模型可重现PD的关键特征，例如α-突触核蛋白（α-syn）病理改变和神经退行性变，并可导致轻度运动功能障碍。该模型具有可预测且持续时间较长的病程，其中包涵体的形成早于神经退行性变数月发生。这使得研究人员能够观察并利用突触核蛋白病在长期进展过程中的不同阶段。总体而言，该模型目前及未来的应用有望在疾病进展研究和新型疗法开发中发挥重要作用。

帕金森病（PD）在死后主要表现为两大病理特征：广泛的进行性α-突触核蛋白（α-syn）病理改变，以及黑质纹状体变性。将α-突触核蛋白预制纤维（PFFs）注射到野生型小鼠或大鼠体内后，可诱导病理性α-syn的进行性积聚，导致数月内黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元的慢性变性，以及感觉运动功能障碍1,2,3,4,5,6。神经元可通过直接颅内注射或加入培养基的方式暴露于α-syn纤维。当PFFs被神经元摄取后，会通过模板机制“种子”内源性α-syn聚集，形成磷酸化包涵体1,7,8,9。这些包涵体具有类似于路易小体的特性：包含在丝氨酸129位点磷酸化的α-syn（pSyn）、泛素和p62；经硫黄素染色呈阳性，显示其具有淀粉样蛋白四级结构；并对蛋白酶K消化具有抗性1,3,5,7,8,9,10,11,12。PFF暴露可在原代神经元及部分永生化神经元培养模型中诱导α-syn包涵体形成，也可在小鼠、大鼠和非人灵长类动物的活体模型中实现1,2,3,4,5,6,7,8,9,13。需要注意的是，并非所有细胞培养模型都会因PFF暴露而形成α-syn包涵体，不同神经元培养体系的“种子”效率也存在差异。
另一个重要的特征是体内 &#945;-突触核蛋白PFF模型的显著特征是在数月内出现明确的阶段性病理变化。在啮齿类动物中，经纹状体内注射后， &#945;-syn 包涵体的形成通常在 1 至 2 个月内于黑质致密部及多个皮层区域达到高峰。此聚集高峰随后伴随出现黑质纹状体变性。 &#8776;2-4 个月后1,3,5。这些不同的病理阶段为研究人员提供了研究和开发策略的平台，以 1）减少 &#945;α-syn 聚集，2）清晰可见的已形成 &#945;-突触核蛋白包涵体，和/或 3）阻止后续的神经退行性变。与神经毒物、转基因及病毒载体介导的模型相比，PFF 模型具有独特的优缺点 &#945;α-syn 过表达模型，如先前综述所述6采用何种模型或方法应由研究者所提出的问题决定，选择最适合该科学问题的模型。
尽管许多实验室已成功应用PFF模型，但仍有一些研究团队在制备纤维及产生一致的α-突触核蛋白病理方面遇到了不一致的问题14。这些问题包括：某些PFF几乎不产生或完全不产生α-突触核蛋白病理、不同批次间种子效应效率的差异，甚至出现纤维无法形成的情况。因此，为了能够准确评估新型治疗干预措施的影响，对α-突触核蛋白预形成纤维（PFF）的制备及其在体应用进行标准化至关重要。以下方案详细说明了从α-突触核蛋白单体生成PFF的步骤、PFF形成后的体外质量控制、使用前对PFF进行超声处理和测量的方法，以及促进PFF在大鼠或小鼠体内成功注射的建议。

<table><tbody><tr><td>1x Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>抗α-突触核蛋白（丝氨酸129位磷酸化）抗体</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>抗α-突触核蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>双环己酮草酰二腙（BCA）</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>透明医用热缩管（内径 0.036&quot;）</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>透明医用热缩管（内径 0.044&quot;）</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoTop 加热盖</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/碳支持膜电子显微镜载网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管（外径 0.53 mm；内径 0.09 mm；长度 54 mm）</td><td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>玻璃微针拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>人源α-突触核蛋白单体（用于制备预形成纤维）</td><td>Proteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>鼠源α-突触核蛋白单体（用于制备预形成纤维）</td><td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>橙色医用热缩管（内径 0.021&quot;）</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica 3.2 mm 探头</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Q125 超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>硫黄素S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>硫黄素T</td><td>EMD Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToxinSensor 显色LAL内毒素检测试剂盒</td><td>Genscript</td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

由单体生成α-突触核蛋白预制纤维及其在体内的应用

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

体内α-突触核蛋白预形成纤维（α-syn PFF）突触核蛋白病模型正日益受到研究人员的青睐，用于模拟帕金森病的突触核蛋白病及黑质纹状体变性。为了确保α-突触核蛋白病理变化的一致性和可重复性，标准化α-syn PFF的制备及体内应用至关重要。本文提供了一项详细的实验方案，涵盖从单体α-syn蛋白生成纤维、纤维化后的质量控制步骤，以及将α-syn PFF成功注射至大鼠或小鼠脑内的建议参数。从单体α-syn蛋白开始，在最佳缓冲条件、蛋白浓度和温度下持续震荡孵育7天，即可完成纤维化过程。纤维化后的质量控制包括：通过沉降实验检测可沉淀纤维的存在，利用硫黄素T（thioflavin T）检测纤维是否形成淀粉样构象，以及通过电子显微镜观察纤维的形态。尽管上述检测的成功验证是必要前提，但仍不足以保证PFF能够在神经元中诱导α-syn包涵体的形成，因此每批PFF的促聚集活性应在细胞培养或预实验动物群体中进行测试。使用前，PFF必须在严格标准化的条件下进行超声处理，随后通过电子显微镜或动态光散射检测，确认纤维长度处于最佳尺寸范围，平均长度约为50 nm。处理后的PFF可直接加入细胞培养基中，或用于动物实验。在细胞培养和啮齿类动物模型中，分别于数天至数周后可通过免疫染色检测到磷酸化α-突触核蛋白（psyn；丝氨酸129位点）所显示的病理变化。&#160;

由α-突触核蛋白单体生成纤维的起始步骤是确定单体的浓度。可采用BCA法或在280 nm处测定吸光度（A280）来测量蛋白质含量；然而，BCA法测得的浓度高于A280法。来源于小鼠α-突触核蛋白单体的PFFs，其BCA值为14.05 ± 0.22，A280值为8.05 ± 0.03 µg/µL（图1）。同样，来源于人源α-突触核蛋白单体的PFFs浓度也较高，其BCA值为12.95 ± 0.38，A280值为7.83 ± 0.05 µg/µL（图1）。A280测定基于消光系数的纳入，特异性针对α-突触核蛋白，这些结果被用于在7天孵育前对单体进行稀释。
在孵育之前，含有α-syn单体的液体呈透明状，但在形成纤维后应变得浑浊。透射电子显微镜观察证实存在长纤维结构，宽度为10–20 nm（图4）。相比之下，α-syn单体几乎不可见，且无明显形态特征（图4）。在通过视觉确认纤维结构存在后，下一步应通过硫磺素T（thioflavin T）检测来验证PFFs的淀粉样蛋白构象。硫磺素T在结合淀粉样蛋白时荧光增强，因此样品中荧光信号的增加表明淀粉样蛋白的存在。例如，dPBS中的硫磺素T产生3,287 ± 580相对荧光单位（RFU）的信号，小鼠α-syn单体产生4,174 ± 158 RFU的信号，而小鼠PFFs则产生59,754 ± 6,224 RFU的信号（图5）。相比之下，人源α-syn单体产生的信号为4,158 ± 105 RFU，与小鼠单体相近；而人源PFFs产生的信号为1,235,967 ± 113,747 RFU，显著高于小鼠PFFs（图5）。为评估是否存在可沉淀的纤维，进行了沉降实验。纤维在离心过程中会形成沉淀。在小鼠和人源PFF样品中，沉淀部分的蛋白含量应高于上清液部分（图6）。相反，小鼠和人源单体的大部分蛋白存在于上清液中，沉淀中仅有少量蛋白（图6）。由于PFFs在电镜下可见、具有淀粉样结构且可被沉淀，因此已通过全部体外质量控制步骤。
小鼠和人源PFFs均经过超声处理，以获得适合诱导α-突触核蛋白（α-syn）包涵体形成的适当长度的PFFs4,18。将PFFs稀释至所需浓度（4 µg/µL）后进行超声处理。在手术前立即通过电子显微镜观察25根代表性纤维，并测量其尺寸以进行抽样检查。经超声处理的小鼠PFFs长度为48.8 ± 3.1 nm，人源PFFs长度为52.1 ± 4.4 nm；因此，两种物种的PFFs长度均处于可有效诱导种子活性的合适范围（50 nm或更短）。对约500根纤维的更全面分析揭示了超声处理后小鼠纤维的平均长度及长度分布情况，平均长度为44.4 ± 0.6 nm，其中86.6%的PFFs长度在60 nm或以下（图4）。相比之下，人源PFFs的平均长度为55.9 ± 1.1 nm，其中69.6%的PFFs长度在60 nm或以下（图4）。
按照先前所述方法3,5，将经超声处理的小鼠PFFs注射至大鼠纹状体内后，在术后2个月对一系列组织切片进行处理，此时已知黑质致密部（SNpc）中包含包涵体的神经元数量达到峰值，用于确认磷酸化α-突触核蛋白（α-syn）包涵体的存在5。在SNpc中可见携带包涵体的神经元（由材料表中所列pSyn抗体进行免疫组织化学染色标记）（图7），此外，在其他投射至纹状体的脑区也可见此类神经元，包括前嗅核、运动皮层、扣带皮层、梨状皮层、前边缘皮层、躯体感觉皮层、内嗅皮层和岛叶皮层、杏仁核及纹状体本身1,3,4,5,19。这些包涵体具有与路易小体相似的特性，例如可结合硫黄素S，以及总α-突触核蛋白对蛋白酶K具有抗性（图7），后者通过免疫组织化学染色（抗体及蛋白酶K见材料表）得以证实。脑内种子效应的确认表明体内质量控制已通过，因此可将同一批次中先前冻存保存的PFFs分装样品，在相同参数下进行超声处理，并验证片段长度后，用于更大规模的实验。
<img alt="通过离心、BCA 法、涡旋和孵育测定蛋白质浓度；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1。α-突触核蛋白纤维的制备方法。 从 α-突触核蛋白单体生成纤维所需步骤的示意图。单体在 4 °C 条件下以 15,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至洁净离心管中，并通过 280 nm 处的吸光度或 BCA 法测定蛋白质浓度。图中显示了人源和鼠源 α-突触核蛋白单体的浓度。柱状图表示组均值，误差线表示均值的标准误 ±1。测定蛋白质浓度后，将 α-突触核蛋白单体稀释，短暂涡旋混匀，并在 37 °C 下于设定为 1,000 RPM 的旋转摇床中震荡孵育 7 天。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="含醋酸铀和水步骤的网格转移示意图；显示无光泽面与光泽面的对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2．透射电子显微镜染色方法。 电子显微镜负染色法示意图。A) 电子显微镜样品载网图像。载网具有无光泽面（或亮面）和光泽面（或暗面）。光泽/暗面涂有火棉胶/碳支持膜。B) 染色步骤示意图。将载网光泽/暗面朝下漂浮于第一滴 ddH2O 上 1 分钟，然后用滤纸吸去多余液体。依次重复操作：第二滴 ddH2O、稀释的 PFFs 或单体、两滴醋酸铀、再加两滴 ddH2O。染色后的载网可存放于载网盒中，待后续成像使用。比例尺 = 3 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用热缩管密封玻璃毛细管的过程；带尺寸标注的分步示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3．定制玻璃针头注射器的组装。 组装带玻璃针头的注射器所需步骤的示意图。将硅化处理的玻璃毛细管拉制并从中间切断，以制成玻璃针头。使用热缩管预处理金属针头，并在将玻璃针头套入金属针头时形成内层密封。随后依次添加两层覆盖玻璃针头基部与金属针头的热缩管，并加热以固定玻璃针头并形成防水密封。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电子显微镜；单体、PFF、超声处理后的PFF；长度分布图；蛋白质纤维。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4．通过透射电子显微镜观察α-突触核蛋白单体和α-突触核蛋白纤维。 α-突触核蛋白单体和纤维的代表性显微图像。上图：小鼠和人源α-突触核蛋白单体。中图：全长的小鼠和人源α-突触核蛋白预成纤维（PFF）。下图：超声处理后的小鼠和人源α-突触核蛋白PFF。下方图表：超声处理后的小鼠和人源α-突触核蛋白PFF长度分布。比例尺 = 500 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="硫黄素T检测图：荧光信号（RFU）；小鼠、人源；PFF 与 dPBS、单体对照。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5．通过硫黄素T检测验证淀粉样结构。 对小鼠和人源α-突触核蛋白（α-syn）单体及PFF样品的荧光信号进行检测。左侧：小鼠α-syn单体与α-syn PFF的结果；右侧：人源α-syn单体与α-syn PFF的结果。每张图中均显示了dPBS阴性对照组。所有测量结果以相对荧光单位（RFU）表示。柱状图表示组均值，误差线代表均值的±1标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="沉降实验凝胶，小鼠和人类蛋白质；单体、PFF分析；蛋白质分离结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6．可沉淀 α-syn的沉降实验。 来自考马斯亮蓝染色凝胶的图像。根据蛋白质ladder，所示条带大小约为14 kDa。左侧：小鼠单体和PFFs；右侧：人单体和PFFs。所有单体和PFF样品均显示了重悬后的沉淀组分（P）和上清组分（S）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="α-synuclein 病理学确认、免疫染色、pSyn、硫黄素 S、蛋白质分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 7"> 
图 7。大鼠模型中包涵体的特征，证实 α-syn 病理改变。 注射后 2 个月黑质致密部的代表性显微图像。左图：含有 pSyn 并经焦油紫复染的神经元。中图：硫黄素 S 染色阳性的神经元。右图：含有 α-syn 且对蛋白酶 K 抵抗的包涵体。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文的目的是概述由单体α-突触核蛋白生成纤维、后续质量控制以及在体内使用预先形成的纤维的步骤。

使用体内α-突触核蛋白预制纤维（α-syn PFF）突触核蛋白病模型正在越来越多地被致力于模拟……的研究人员所采用

全球各地的实验室正在使用α-突触核蛋白预制纤维模型来研究突触核蛋白病。尽管许多实验室已成功应用该模型，但部分研究团队在制备纤维以及诱导稳定的α-突触核蛋白病理方面遇到了不一致的问题。我们希望本实验方案——详细描述了从α-突触核蛋白单体生成纤维的过程，以及在体内的预制纤维使用方法——能够解答研究人员在使用该模型时所遇到的疑问。α-突触核蛋白预形成纤维模型可重现帕金森病的关键特征，例如α-突触核蛋白病理改变和神经退行性变。已有研究表明，该模型可在某些动物模型中引发轻度运动功能障碍。含有磷酸化α-突触核蛋白的包涵体形成以及神经退行性变的长期发展过程，为研究人员提供了突触核蛋白病进展过程中的不同阶段，可用于研究并作为潜在治疗干预的靶点。正在演示定制玻璃针制备过程的是我们的实验室技术员 Christopher Kemp。开始此操作时，将α-突触核蛋白单体置于冰上解冻。通过轻轻弹击离心管，重新悬浮解冻后的单体。在15,000 g、4°C条件下离心10分钟。然后将上清液转移至洁净的1.5 mL微量离心管中，并记录转移的体积。用1×dPBS将单体稀释至终浓度为每毫升5 mg。短暂涡旋混匀，短暂离心以将管底所有液体收集至管底。随后使用封口膜密封微量离心管管盖。将管子放入带盖的轨道式恒温混匀仪中，在37°C、1,000 rpm的振荡条件下孵育七天。七天结束时，试管内的内容物应呈现浑浊状态。首先，穿戴好所有必要的个人防护装备，包括手套、实验服和面罩。然后在细胞培养超净台中，将直径为3.2 mm的探头连接至转换器。将超声破碎仪的振幅设置为30%，脉冲设置为开启1秒、关闭1秒，时间设置为1分钟。在室温下解冻纤维，解冻后仍在生物安全柜内操作，用无菌dPBS稀释纤维。接着，用70%乙醇浸湿实验室纸巾，并用其擦拭超声破碎仪的探头以进行清洁。将探针尖端浸入双蒸水中，脉冲10次以进一步清洁探针。随后用实验用纸巾将探针擦干。将清洁后的探针尖端放入含有稀释纤维的离心管中，并将尖端置于管底。使用先前设定的参数对稀释后的纤维进行超声处理，在每次脉冲过程中上下移动探头，以确保液体中的所有纤维均被超声处理。超声处理后，在2,000 g条件下短暂离心1秒，使管壁上的液体全部收集至管底。将探头尖端浸入1% SDS溶液中，脉冲10次以清洗探头。然后，将探头从SDS中取出，浸入双蒸水中，脉冲处理10次。用70%乙醇润湿的实验室纸巾擦拭探头，并用干燥的实验室纸巾擦干。将探头从转换器上拆下并妥善保存。此后，先用 1% SDS 擦拭生物安全柜内的所有表面，再用 70% 乙醇擦拭。开始操作时，将硅化玻璃毛细管插入玻璃微电极拉制仪中。打开加热元件，使连接的重物拉伸被加热的玻璃毛细管。接下来，使用剪刀在拉制好的玻璃毛细管中间最细处剪断，并将玻璃针从玻璃针拉制仪上取下。然后，用剪刀截取一段长约40 mm的热缩管。将热缩管套在10微升斜面注射器的金属针头上。使用明火加热并使热缩管紧贴针头，同时确保旋转针头以均匀受热。小心地将拉制的玻璃针较粗的一端套入注射器的金属针上。然后，截取一段长约 40 mm 的热缩管，小心地套在玻璃针上，使其覆盖玻璃针的基部与注射器金属针的重叠区域。使用明火加热热缩管，以将玻璃针固定在金属针上。为进一步固定针头并防止潜在泄漏，另剪一段长约40 mm的热缩管，小心地将其套过玻璃针，使其覆盖玻璃针底部与注射器金属针的连接处。使用明火加热热缩管，使玻璃针与金属针牢固连接。然后，使用剪刀修剪玻璃针，使针尖长度约为 8 mm。测试针头时，用蒸馏水填充一支带有 26 号针头的 1 mL 注射器。从定制的玻璃针注射器中取出金属推杆，将装有水的注射器的针头插入定制注射器的底部。检查玻璃针与金属针接口处是否有泄漏，并确认水流稳定。然后，用蒸馏水充满一个微量离心管。使用定制的玻璃针头注射器吸取蒸馏水。检查针头，确认液体已吸入注射器内且无气泡。若存在气泡，或水未被吸入针头，可修剪针头以缓解压力。此后，将带有连接玻璃针头的注射器小心存放于注射器盒中，待手术时取出使用。通过透射电子显微镜观察可确认存在长纤维状结构。相比之下，α-突触核蛋白单体几乎不可见，且无明确形态。随后使用硫黄素T检测法进一步验证纤维的类淀粉样特征。一项代表性检测结果显示，与小鼠PFFs相比，dPBS和小鼠单体产生的相对荧光单位信号较低。人源α-突触核蛋白单体产生的信号与小鼠单体相似。而人源PFFs产生的信号同样高于单体。为了评估可沉淀纤维的存在，需进行沉降实验。在小鼠和人源PFF样本中，沉淀部分的蛋白含量应高于上清部分。相比之下，小鼠和人源单体中的大部分蛋白存在于上清中，而沉淀中含量极少。小鼠和人源PFF均经过超声处理，以获得适合诱导α-突触核蛋白包涵体形成的适当长度的PFF。对约500根纤维的全面检测显示，小鼠纤维的平均长度约为44纳米，其中86.6%的PFF长度在60纳米或以下。然而，人源PFFs的平均长度约为55.9纳米，其中69.6%的PFFs长度在60纳米或以下。通过免疫组织化学方法确认PFF在体内的功效。在黑质中形成的包涵体与路易小体具有相似的特性，即含有磷酸化的α-突触核蛋白，包含淀粉样结构，可被硫黄素S染色，并且对蛋白酶K消化具有抗性。超声处理可能使操作者暴露于气溶胶化的预形成纤维。因此，应穿戴适当的防护装备，并在通风橱内进行超声处理，以尽量降低暴露风险。

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从单体和体内使用的Α-syr核 in 预成型纤维的产生

本视频演示了将α-突触核蛋白纤维注射到小鼠体内以诱导神经炎症的过程。这些纤维被注射到表达突变型α-突触核蛋白的转基因小鼠腹腔内。当纤维到达中枢神经系统后，会进入神经元并诱导突变蛋白发生聚集。这些聚集物会扩散至邻近的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞。小胶质细胞识别这些聚集物后被激活，引发神经炎症，从而损伤神经元。...

通过注射α-突触核蛋白纤维在小鼠中诱导神经炎症

本视频展示了在经α-突触核蛋白预形成纤维预处理的胚胎小鼠多巴胺能神经元中，定量α-突触核蛋白聚集的过程。该方法详细说明了通过免疫荧光技术对含有α-突触核蛋白聚集体的多巴胺能神经元进行固定、染色和定量分析的步骤。...

研究α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠多巴胺能神经元中的聚集

蛋白质可折叠成天然结构，也可错误折叠形成不溶性淀粉样蛋白。有利于错误折叠途径的条件可导致不同类型的淀粉样纤维形成。本文所述方法可实现天然蛋白质向淀粉样蛋白的快速转化 体外.

天然蛋白质快速生成淀粉样蛋白 体外

本文描述了一种提供新型定量方法的ELISA。该方法利用针对Ser129磷酸化α-突触核蛋白（αS）形式或该蛋白C端区域的多种抗体，在突触核蛋白病的转基因小鼠模型（M83）中特异性检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αSD）。...

检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

本文介绍了一种从人死后脑组织中分离出溶解度逐渐降低/聚集态α-突触核蛋白（α-syn）的实验方案。通过使用去垢剂强度逐步增强的缓冲液，并结合高速超速离心技术，可检测病变与非病变组织中α-syn聚集特性的差异。...

从帕金森病患者脑组织中连续提取可溶性与不可溶性α-突触核蛋白

向表达人类α-突触核蛋白A53T家族性突变和萤火虫荧光素酶的Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠腹腔或舌部外周注射α-突触核蛋白纤维，可诱导其中枢神经系统产生神经病理学改变，包括神经炎症。...

转基因小鼠外周接种α-突触核蛋白纤维后神经炎症的生物发光成像

本实验方案的目的是提供一种基于细胞的系统，用以模拟α-突触核蛋白聚集体的形成...

外源性施加与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集体至原代神经元：一种高效的纤维形成细胞模型

本文介绍了一种用于研究原代小鼠多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集的详细实验方案。通过预先形成的α-突触核蛋白纤维诱导神经元内磷酸化α-突触核蛋白的聚集。对免疫荧光标记的细胞进行自动化成像并结合无偏倚的图像分析，使该方案成为适用于中高通量筛选抑制α-突触核蛋白聚集药物的可靠方法。...

研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。...

一种利用人源化酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

本方案描述了一种鼻内给予α-突触核蛋白聚集体的方法。该方法有助于研究帕金森病中α-突触核蛋白从嗅黏膜向嗅球的传播过程。...

α-突触核蛋白聚集体鼻内给药技术

了解α-突触核蛋白预成型纤维的生成与验证方法，包括单体准备、7天振荡孵育、超声处理及质量控制步骤。该标准化方案适用于帕金森病突触核蛋白病动物模型的建立与研究。

由单体生成α-突触核蛋白预制纤维及其在体内的应用

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