Name: 哺乳动物细胞中基于CRISPR的聚集基因屏幕 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 了解基于CRISPR-Cas9的哺乳动物细胞全基因组聚集基因筛选方法，利用单导向RNA文库进行高通量基因功能研究。该方案涵盖文库制备、慢病毒包装、细胞转导及测序数据分析等关键步骤，助力功能基因组学研究。

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本工作由加拿大基因组计划、安大略研究基金以及加拿大卫生研究院（MOP-142375，PJT-148802）资助。

<ol><li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li>
<li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+CRISPR%2FCas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li>
<li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li>
<li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+execution%2C+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR%2FCas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knock-out+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li>
<li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li>
<li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STBL2%3A+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li>
<li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAGEL%3A+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).</li>
<li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.1101/232736">https://doi.org/10.1101/232736</a> (2017).</li>
<li>Pedregosa, F. V., G,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scikit-learn%3A+Machine+Learning+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li>
<li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213(2011).</li>
<li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Am+I+ready+for+CRISPR%3F+A+user%27s+guide+to+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li>
<li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR%2FCas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR%2FCas9+knock-out+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554(2014).</li>
<li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li>
<li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li>
<li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators%3A+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

由于CRISPR技术使用简便且具有高度可塑性，已被广泛采用作为精确基因组编辑的首选工具。混合CRISPR筛选提供了一种在单次实验中研究数千种遗传扰动的方法。在混合筛选中，sgRNA文库作为分子条形码，因为每条序列都是唯一的，并可映射至其靶向基因。通过从细胞群体中提取基因组DNA，可通过高通量测序定量sgRNA的丰度，从而确定引起特定表型的基因。采用大规模并行测序方法对样本中的sgRNA进行定量，这意味着多个独立的细胞群体可合并至同一条测序通道中，以降低测序成本。
在开展大规模筛选项目之前，拥有一个经过充分表征且技术上优化的模型至关重要。在选择用于筛选的细胞系时，遗传背景、生长速率和转导效率是需要考虑的重要因素。例如，细胞的生长速率和编辑效率将决定该模型的可扩展性及技术适用性。为了充分覆盖大规模的sgRNA文库，需要数千万个细胞，因此对于倍增时间较长或增殖能力较差的细胞系（例如原代细胞），细胞数量可能成为限制筛选可行性的因素。应根据细胞的生长速率，相应地选择适合筛选的细胞培养条件，如细胞接种密度和培养板规格。建议在实际操作和技术上可行的前提下，使用最大规格的培养容器进行细胞培养。</...

CRISPR-Cas 是成簇规律间隔短回文重复序列及其相关核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated nuclease）的缩写，由一种单一的核酸酶蛋白（例如 Cas9）与合成的向导 RNA（sgRNA）组成复合物。该核糖核蛋白复合物可将 Cas9 酶靶向至基因组特定位点，诱导产生双链 DNA 断裂1。双链断裂可通过同源定向修复（HDR）途径修复，但更常见的是通过易错的非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复，后者常导致插入和/或缺失（INDELS），从而频繁破坏基因功能1。CRISPR 技术具有高效性和简便性，实现了前所未有的基因组靶向精度，远超以往的基因组编辑技术（如锌指核酸酶（ZNF）或转录激活因子样效应物核酸酶（TALENS）），后两者均存在设计复杂度高、转染效率低以及多重基因编辑能力受限等问题2。
基于CRISPR单导向RNA的基因组编辑技术在基础研究中的应用，使科学家能够高效且低成本地探究单个基因的功能以及遗传相互作用网络的拓扑结构。相较于早期的遗传扰动技术，如RNA干扰（RNAi）和基因捕获诱变，CRISPR-Cas系统在实现全基因组范围的功能筛选方面具有显著优势。特别是，RNAi技术存在较高的脱靶效应和基因敲低不完全的问题，导致其敏感性和特异性低于CRISPR3,4,5；而基因捕获方法仅适用于单倍体细胞进行功能缺失筛选，限制了可研究的细胞模型范围6。CRISPR能够实现完全的基因敲除，从而提供一个生物学上更为稳健的系统，用于研究突变表型，具有背景噪声低、脱靶效应最小化以及不同试剂间活性一致等优点5。目前，靶向全人类基因组的CRISPR-Cas9 sgRNA文库已广泛可得，可在单次实验中同时实现数千个基因的敲除3,7,8,9。
我们开发了一套独特的全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA慢病毒文库，称为多伦多敲除文库（Toronto Knock-out，TKO文库）（可通过Addgene获取），该文库结构紧凑且序列经过优化，有助于实现高分辨率的功能基因组筛选。最新的TKOv3文库利用实证数据对71,090条sgRNA进行编辑效率优化，靶向约18,000个人类蛋白编码基因10。此外，TKOv3还提供单组分文库形式（LCV2::TKOv3，Addgene编号#90294），可在同一载体上共表达Cas9和sgRNA，从而无需构建稳定表达Cas9的细胞系，使得在多种哺乳动物细胞类型中均可开展全基因组水平的基因敲除研究。TKOv3 также提供不含Cas9的载体版本（pLCKO2::TKOv3，Addgene编号#125517），可用于已表达Cas9的细胞中11。
通过将全基因组范围的CRISPR-Cas9编辑细胞群体暴露于不同的生长条件下，并利用高通量测序对随时间变化的sgRNA丰度进行定量，可检测携带可追踪遗传扰动的细胞的丢失或富集情况。CRISPR基因敲除文库可用于鉴定在受到扰动后导致细胞适应性缺陷、调节药物敏感性（例如敏感或耐药基因）、调控蛋白质表达（例如报告基因）或维持特定信号通路功能及细胞状态所必需的基因12,13,14。例如，在癌细胞系中进行差异适应性筛选，可同时识别出癌基因的耗竭或减少以及抑癌基因的富集或增加3,14,15。类似地，使用中等剂量的治疗性药物可揭示与药物耐药性和增敏相关的基因16,17。
本文提供了一种详细的基因组规模CRISPR-Cas9功能缺失筛选方案，涵盖从文库构建、筛选操作到数据分析的全过程，适用于在哺乳动物细胞中使用多伦多基因敲除文库（TKOv1或v3）进行筛选。尽管本方案已针对多伦多基因敲除文库的筛选进行了优化，但其同样可适用于所有CRISPR sgRNA混合文库，并具备可扩展性。

<table><tbody><tr><td>0.22 微米滤膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30&amp;deg;C 培养皿培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C 摇床培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C、5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE 缓冲液</td><td>BioShop</td><td>TAE222.4</td><td></td></tr><tr><td>6 N 盐酸溶液</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠（Alamar blue）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>蓝光透射仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，热激分离，第五组分，纯度 ≥98%，生物技术级</td><td>Bioshop</td><td>ALB001.250</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modification of Eagles Medium）</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>BTX</td><td>45-0134</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>BTX</td><td>45-0651</td><td></td></tr><tr><td>Endura 电转化感受态细胞</td><td>Lucigen</td><td>90293</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 包装细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>建议传代数 &amp;lt;15</td></tr><tr><td>六亚甲基溴化铵（Polybrene）</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>增强转导效率的阳离子聚合物</td></tr><tr><td>六亚甲基溴化铵（Polybrene）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含羧苄青霉素的 LB 琼脂平板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含羧苄青霉素的 LB 培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低分子量 DNA Marker</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233S</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 分光光度计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0544L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>质粒大提纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G（包膜质粒）</td><td>Addgene</td><td>质粒 #12259</td><td>慢病毒系统</td></tr><tr><td>psPAX2（包装质粒）</td><td>Addgene</td><td>质粒 #12260</td><td>慢病毒系统</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Wisent</td><td>400-160-UG</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 定量试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>RNA酶A（RNAse A）</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. 复苏培养基</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>SYRB Safe DNA 凝胶染料</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>多伦多基因敲除CRISPR文库（TKOv3）- 含Cas9</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #90203</td><td>全基因组CRISPR文库，包含Cas9，共71,090条sgRNA</td></tr><tr><td>多伦多基因敲除CRISPR文库（TKOv3）- 不含Cas9</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #125517</td><td>全基因组CRISPR文库，不含Cas9，共71,090条sgRNA</td></tr><tr><td>Tris-EDTA（TE）溶液，pH 8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Wizard 基因组DNA纯化试剂盒</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂</td><td>Roche</td><td>06 365 809 001</td><td>脂质类转染试剂</td></tr></tbody></table>

哺乳动物细胞中基于crispr的 pooled 遗传筛选

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

利用CRISPR-Cas系统进行基因组编辑极大地提升了精确编辑多种生物基因组的能力。在哺乳动物细胞中，该技术为功能基因组学研究提供了开展全基因组遗传筛选的新手段。针对所有开放阅读框的向导RNA（sgRNA）文库，使得在单一细胞池中可简便地产生数千种遗传扰动，并可通过筛选特定表型，以无偏倚且系统化的方式揭示基因功能及细胞过程。CRISPR-Cas筛选为研究人员提供了一种简单、高效且低成本的方法，用于解析细胞表型的遗传基础。此外，对不同细胞系或不同类型癌症中开展的筛选进行差异分析，可鉴定在肿瘤细胞中具有情境依赖性必需性的基因，从而揭示特异性抗癌治疗的潜在靶点。在人类细胞中开展全基因组筛选可能具有挑战性，因其涉及数千万细胞的操作以及大规模数据的分析。这些筛选的诸多细节，例如细胞系的特征鉴定、CRISPR文库的选择，以及在分析过程中对CRISPR技术局限性与能力的理解，常常被忽视。本文提供了一套详细的实验方案，用于成功实施基于混合型全基因组CRISPR-Cas9筛选。

基因组规模CRISPR筛选工作流程概述
图1展示了混合CRISPR筛选的工作流程概览：首先以较低的感染复数（MOI）将靶细胞与CRISPR文库慢病毒进行感染，以确保单次整合事件及文库的充分代表性（通常为200至1000倍覆盖）。感染后，使用抗生素嘌呤霉素处理细胞，以筛选出成功转导的细胞。筛选完成后，收集基础时间点（T0）的细胞沉淀，用于评估筛选起始时文库的分布情况。剩余细胞包含遗传扰动的异质性群体，每3至4天传代一次，并始终保持所需的文库代表性，共进行15至20次细胞倍增，以使基因编辑及其效应得以显现。对于药物处理的筛选实验，通常在细胞从病毒感染和嘌呤霉素筛选中恢复后的T3或T6时间点加入药物。每次传代时，在保持所需文库代表性的条件下收获细胞，提取基因组DNA，并在预定的时间点通过高通量测序检测向导RNA的丰度。
<p class="jove_cont...

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9 筛选所需的各个步骤。

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

使用CRISPR-Cas系统进行基因组编辑极大地提升了精确编辑多种生物基因组的能力。在哺乳动物研究背景下……

CRISPR 筛选的剔除筛选为研究人员提供了一种简单、高效且经济的方法，用于在全基因组水平上探究基因功能。CRISPR 的优势在于其灵活性，只需改变向导序列即可编辑任意基因。CRISPR 向导文库使研究人员能够在一次实验中以无偏倚、系统化的方式探究任何生物的整个基因组。目前，CRISPR 筛选技术正被用于鉴定数百种人类癌症中的必需基因，并绘制遗传相互作用图谱。该技术还可全面分析药物，揭示药物的作用机制。本文所述的 CRISPR 文库靶向人类细胞。然而，已有针对其他物种（如小鼠）的向导RNA文库可供使用，并可采用类似方法进行筛选。在人类细胞中开展全基因组筛选在实际操作中可能具有挑战性，因为该过程涉及数千万个细胞的处理，并需要对大量数据进行分析。在启动筛选实验之前，应确保细胞系已得到充分表征。这包括了解细胞系的纯度、倍增时间、慢病毒转导效率以及对抗生素筛选试剂的敏感性。通过可视化演示，将展示在筛选过程中如何实际操作所需的数百万个细胞，并以系统化的方式跟踪数千个扰动。本实验操作将由我实验室的技术员 Andrea Habsid、Kamaldeep Aulakh 和 Ryan Climie 进行示范。首先将预制的CRISPR sgRNA质粒转化至电转感受态细胞中，并按照文稿说明进行培养。当准备收集菌落时，向每个培养皿中加入7毫升含羧苄青霉素的LB培养基，用涂布棒刮下菌落。使用10毫升移液管将刮下的菌液转移至一个无菌的1升锥形瓶中，并用5毫升含羧苄青霉素的LB培养基冲洗培养皿。再次将洗涤液转移至烧瓶中。根据手稿说明离心细胞，然后测定湿菌体沉淀的重量。使用大提或超大提质粒纯化试剂盒纯化质粒DNA。通过接种293 T细胞并过夜培养，为转染实验准备细胞。次日，为15厘米培养皿配制三种转染质粒混合物。计算单次转染所需的质粒用量，并为待转染的培养皿数量外加一个培养皿所需的质粒量配制混合液。接下来，为每次转染制备基于脂质的转染试剂，并将减血清培养基分装至若干个1.5毫升微量离心管中，管数与待转染的培养板数量相同。加入转染试剂，轻轻混匀，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，按转染试剂与DNA质量比3:1的比例，将DNA加入转染试剂中形成DNA复合物。轻轻混匀溶液，室温静置30分钟。将转染混合物加入包装细胞中，并根据文稿说明进行孵育。在病毒收获当天，观察细胞是否出现异常及融合形态，以判断病毒产生情况良好，并通过收集上清液转移至无菌离心管中来收获慢病毒。首先选择在整个筛选过程中要维持的CRISPR向导RNA文库覆盖度。根据文库覆盖度，确定每条向导RNA所需维持的细胞数量，以及在感染复数（MOI）为0.3时所需的感染细胞数量。接下来，确定进行感染所需的培养板数量，然后将细胞收集并接种至每一块培养板中。向所有培养板中加入六亚甲基溴化物，并向筛选板和对照二板中加入所需体积的病毒。对照一板中不加病毒，用培养基补足相应体积。通过倾斜充分混匀平板，并将平板放入培养箱中，确保其水平放置。根据手稿说明收获感染的细胞，并从混合细胞中收集三份细胞沉淀用于基因组DNA提取。以500 × g离心5分钟，用PBS洗涤细胞。标记试管，并将细胞沉淀在零下80摄氏度下进行冷冻干燥。将感染的细胞池分为三个重复组，确保每个重复组内保持文库覆盖度。以正常扩增细胞时常用的密度接种细胞。每个重复组使用相同数量的细胞，并确保各重复组之间细胞总数一致。持续传代细胞，并从每批汇集的感染细胞中收集三份细胞沉淀重复样本，传代至多15到20次细胞倍增。每次传代时，将每个重复组内所有培养板中的细胞合并收集。根据时间和重复编号标记每个沉淀物。按照文稿说明设置PCR1，每50微升反应体系中加入3.5微克基因组DNA，总共使用100微克基因组DNA，并建立相同的50微升反应体系以达到所需的测序深度。按照文稿说明设置一个PCR管反应。使用5 µL混合后的PCR1产物作为模板，并为每个个体样本使用独特的索引引物组合，以便对测序文库样本进行混合。PCR完成后，将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中以低电压电泳1至1.5小时。在蓝光透射仪上观察产物，并切下200 bp的条带。使用分光光度计和荧光计纯化DNA并测定其浓度和质量。理想的向导RNA文库应确保每种向导RNA的含量相近。可采用高通量测序来验证文库中向导RNA分布的均一性。精确率-召回率分析可用于评估筛选实验的性能。高性能的筛选实验应在基础因子大于六且错误发现率低于5%的情况下，回收大量必需基因。精确率-召回率曲线应具有明显的拐点，并以直线延伸至终点。贝叶斯因子表示基因敲除导致适合度缺陷的置信度量。高分值表示置信度增加，而低分值表明基因敲除提供了生长优势。可通过在过量药物存在的条件下培养全基因组敲除文库，以寻找抑制性耐药基因。为进行胸腺嘧啶阻断抑制因子的阳性筛选，将T0时刻所有向导RNA的标准化读数计数与经胸腺嘧啶处理样本的均一化平均读数计数进行对比作图。成功进行CRISPR筛选的一个关键细节是，从质粒转染到细胞转导的整个过程中，始终保持每种向导RNA的良好分布。这将最大限度地减少可能扭曲向导RNA代表性并导致假阳性或假阴性结果的随机效应。在完成筛选验证后，应进一步开展实验以确认筛选出的靶点，因为初筛仅能识别潜在的阳性靶点。根据筛选结果所涉及的生物学特性，可采用多种方法进行后续研究。CRISPR基因编辑技术与下一代测序相结合，已在多种人类模型系统中实现了全基因组规模的功能缺失筛选。由于CRISPR技术操作简便，此类筛选方法现已广泛适用于各类研究人员，使更多科研人员能够利用功能基因组学方法来研究生物学过程及疾病机制。

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遗传学

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关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

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利用全基因组规模的CRISPR/Cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体

关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

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利用慢病毒shRNA文库进行高通量RNA干扰（RNAi）筛选，可作为发现恶性肿瘤中具有治疗意义的合成致死靶点的工具。我们提供一种基于shRNA文库的筛选方法，用于研究急性髓系白血病（AML）中的表观遗传调控因子。...

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全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

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平行 体内 小鼠乳腺中基因敲除与激活的筛选

了解基于CRISPR-Cas9的哺乳动物细胞全基因组聚集基因筛选方法，利用单导向RNA文库进行高通量基因功能研究。该方案涵盖文库制备、慢病毒包装、细胞转导及测序数据分析等关键步骤，助力功能基因组学研究。

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