Name: 使用生物素标签研究蛋白质-核酸相互作用的体外生化分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习使用生物素标记核酸进行蛋白质-核酸相互作用的体外生化分析方法。该方法无需特殊设备，一天内即可完成实验，且同批次标记核酸可长期保存使用，确保实验结果的可重复性。

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我们感谢宾夕法尼亚大学的 P. Jeremy Wang 提供的有益修改和讨论。同时感谢 Sigrid Eckardt 进行语言编辑。K. Z. 获得中国国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2016YFA0500902，2018YFC1003500）和国家自然科学基金（31771653）。L. Y. 受国家自然科学基金（81471502，31871503）和江苏省创新创业计划资助。&#160;J. N. 得到浙江省医药卫生科技计划项目（2019KY499）的支持。&#160;M. L. 得到国家自然科学基金（31771588）和千人计划青年项目资助。

1. 蛋白质制备
<ol>
	<li>MEIOB 和 MOV10 表达载体
	<ol>
		<li>构建编码小鼠 MEIOB-A、C 和 E 的 cDNA 表达载体图1A）和 MOV10。
		<ol>
			<li>为每个片段设置聚合酶链式反应（PCR）反应。将1 μL小鼠cDNA（来自C57BL/6小鼠睾丸）、1 μL dNTP、2 μL 10 μM正向引物、2 μL 10 μM反向引物、1 μL DNA聚合酶、25 μL 2x PCR缓冲液和18 μL双蒸水混合。2O (ddH₂O)2在最终体积为 50 μL 的溶液中。 
			注意：用于扩增的引物 中型生物 和 Mov10 基因片段列于 表1.</li>
			<li>使用以下程序进行PCR反应：95 °C 预变性5 min，35个循环（95 °C 变性15 s，64 °C 退火15 s，72 °C 延伸20 s（扩增全长MOV10时延伸时间为2 min）），最后在68 °C 延伸7 min。 
			注意：使用引物对 MEIOB-E (F1) 和 MEIOB-E-mut (R1)，以及 MEIOB-E-mut (F2) 和 MEIOB-E (R2)，分别扩增包含突变序列的两个片段，这两个片段在 3' 和 5' 端具有重叠序列，以生成突变的 PCR 模板。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过凝胶电泳分析扩增的PCR DNA，在紫外灯下迅速切下凝胶中所需大小的条带，并放入离心管中。 
		注意：在琼脂糖凝胶上可见的预期产物大小分别为：MEIOB-A 为 536 bp，MEIOB-C 为 296 bp，MEIOB-E 为 312 bp 和 229 bp，MOV10 为 3015 bp。</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒，按照生产商说明书纯化PCR产物DNA。
		<ol>
			<li>向步骤1.1.2中的离心管中加入等体积的溶解缓冲液，在50–55 °C水浴中融化凝胶5–10分钟，确保凝胶完全溶解。短暂离心以收集管壁上的液滴。 
			注意：凝胶和溶解缓冲液的质量/体积浓度为 1 mg/μL。</li>
			<li>将吸附柱放入收集管中，将含有溶解凝胶片段的溶液转移至吸附柱中，于12,000 ×g离心 x g 2 分钟。</li>
			<li>弃去收集管底部的滤液。向柱中加入 600 μL 洗涤缓冲液，于 12,000 转/分钟离心 x g 1 分钟，弃去滤液。</li>
			<li>重复步骤 1.1.3.3 一次。</li>
			<li>将柱子放回收集管中，于12,000 × g离心 x g 孵育2分钟，以彻底去除残留的洗涤缓冲液。</li>
			<li>将吸附柱置于一个1.5 mL无菌离心管中，加入50 μL ddH₂O2O至吸附柱中心，于12,000离心 x g 孵育1分钟。使用分光光度计测定洗脱液的DNA浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>质粒的限制性酶切消化
		<ol>
			<li>用BamHI和NotI酶切pGEX-4T-1载体。具体操作如下：将4 μg pGEX-4T-1载体、5 μL 10x消化缓冲液、1 μL BamHI和1 μL NotI混合，并用ddH₂O补足至总体积50 μL。2加水至终体积为50 μL。37 °C孵育2小时。</li>
			<li>用BamHI和XhoI酶切pRK5载体：将4 μg pRK5载体、5 μL 10x消化缓冲液、1 μL BamHI和1 μL XhoI混合，并用ddH₂O补足至总体积50 μL。2加水至终体积为50 μL。37 °C孵育2小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过凝胶电泳分析载体DNA，在紫外灯下用手术刀迅速从凝胶中切下所需大小的条带，并将其放入离心管中。</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒按照制造商说明书纯化载体DNA，步骤见1.1.3。 
		注意：线性化质粒的长度：pGEX-4T-1为4.4 kb；pRK5为4.7 kb。</li>
		<li>设置标准的重组连接反应，将 0.03 pmol 线性化载体、0.06 pmol cDNA 片段、2 μL 连接酶、4 μL 5x 连接酶缓冲液和 ddH₂O 混合2在10 μL的终反应体积中。 
		注意：将 MEIOB-A、C 和 E 克隆至 pGEX-4T-1 载体中，将 MOV10 克隆至 pRK5 载体中。</li>
		<li>在37 °C下孵育混合物30分钟，然后立即在冰上冷却5分钟。将MEIOB重组质粒转化至BL21细菌中，将MOV10重组质粒转化至DH5α细菌中。 
		注意：所有重组质粒均需通过Sanger测序验证。</li>
		<li>将含有经验证重组质粒的细菌培养物与等体积的50%甘油混合制备甘油菌种，并于-80 °C保存。 
		注意：每次后续实验均需从甘油菌种中划线接种细菌至新鲜琼脂平板，并按步骤1.2所述方法挑取单菌落进行扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从细菌中提取 MEIOB 蛋白
	<ol>
		<li>挑取经测序验证的、转染空载或重组pGEX-4T-1质粒的各BL21菌株单菌落，分别接种于3 mL含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C、220 rpm振荡培养过夜。</li>
		<li>从3 mL过夜培养物（步骤1.2.1）接种至含100 µg/mL氨苄青霉素的300 mL LB培养基中。在37 °C下振荡培养2 h，直至OD600 达到 0.5-1.0。</li>
		<li>通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.2 mM诱导蛋白表达。将培养物在180 rpm振荡条件下于18 °C继续培养3小时。</li>
		<li>将细菌培养物在 3,500 转离心 x g 4 °C 下 20 分钟</li>
		<li>将沉淀重悬于20 mL预冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）中。将菌液悬浮液置于冰上进行超声处理，共25个循环，每个循环为10秒短时脉冲（输出功率20%），每次脉冲后在冰上静置2-3秒。</li>
		<li>将裂解液在12,000 × g条件下离心 x g 4 °C 下离心 15 分钟。将全部上清液转移至新离心管中。</li>
		<li>预洗珠子。
		<ol>
			<li>加入300 μL谷胱甘肽-Sepharose珠至新的15&#160;mL 离心管中，用 10 mL 冰冷的 PBS 缓冲液洗涤磁珠。</li>
			<li>750离心 x g 4 °C下离心1分钟以沉淀磁珠，并弃去洗涤液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将裂解液加入洗涤后的珠子中，4 °C 孵育 2 小时。750 × g 离心 x g 4 °C下离心1分钟以沉淀磁珠。用10 mL预冷的PBS洗涤磁珠8次。</li>
		<li>用洗脱缓冲液（pH 8.0 的 50 mM Tris-HCl 中含 10 mM 谷胱甘肽）1 mL 洗脱珠子 6 次，每次洗脱前于 4 °C 孵育 10 分钟。&#160;在 750 × g、4 °C 条件下离心 1 分钟，使珠子沉淀。&#160;收集并合并这6个组分。</li>
		<li>将洗脱的蛋白质转移至离心过滤管中，于7,500 × g下离心浓缩 x g 以获得终体积为100–200 μL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从HEK293T细胞中提取的MOV10蛋白
	<ol>
		<li>在培养的HEK293T细胞中瞬时表达MOV10蛋白。
		<ol>
			<li>制备浓度为的 MOV10-pRK5 质粒 &#62;500 ng/μL</li>
			<li>在15 cm培养皿中接种HEK293T细胞。当细胞密度达到约70%–90%时，将细胞培养基更换为含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的新鲜杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
			<li>一次转染时，将60 μg MOV10-pRK5质粒DNA溶于3 mL低血清培养基中，然后加入120 μL转染增强试剂，充分混匀。</li>
			<li>在另一管中，将90 μL转染试剂加入3 mL低血清培养基（不含青霉素-链霉素）中，充分混匀。</li>
			<li>将稀释后的DNA加入每管稀释的转染试剂中，室温孵育15分钟。</li>
			<li>将转染混合物加入细胞培养物中，培养细胞约36–48小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>36–48 小时后，从每块培养板中收集细胞至 50 mL 离心管中。在 500 × g 条件下离心 x g 4 °C下离心5分钟。用10 mL预冷的PBS洗涤每份沉淀，然后在500 × g下离心收集细胞 x g 4 °C 下离心 5 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于 3 mL 含有完全无乙二胺四乙酸（EDTA-free）蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液中，冰上孵育 30 分钟。将裂解液在 20,000 ×g 离心 x g 4 °C 下 20 分钟</li>
		<li>每皿细胞加入100 μL抗FLAG磁珠至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>用K150缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，150 mM KoAc，1 mM DTT，0.1% NP-40）将磁珠洗涤2次。
		<ol>
			<li>将磁珠重悬于1 mL预冷的K150缓冲液中。</li>
			<li>将磁珠在 4 °C 下轻轻旋转孵育 2 分钟，并使用磁铁收集磁珠。移除并弃去上清液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将磁珠加入步骤1.3.3的细胞裂解液上清中，4 °C孵育2 h。</li>
		<li>用K150缓冲液洗涤蛋白结合的磁珠3次，然后用含250 mM NaCl的K150缓冲液洗涤2次，再用K150缓冲液洗涤3次，步骤同1.3.5。</li>
		<li>将珠子重悬于 300 μL FLAG 洗脱缓冲液（100 mM NaCl，20 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mM MgCl₂，10% 甘油，1% Triton X-100，0.5 mM DTT，150 μg/mL 3×FLAG 肽）中。2，10% 甘油），加入 FLAG 肽至终浓度为 0.5 μg/μL，在 4 °C 下于旋转仪中与磁珠孵育 1 小时，然后借助磁铁收集磁珠。</li>
		<li>收集含有洗脱MOV10蛋白的上清液，测定浓度后于-80 °C保存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 核酸制备
<ol>
	<li>从合适的供应商处购买带或不带生物素标记的DNA和RNA寡核苷酸（oligos）。用无RNase的ddH2O将每种寡核苷酸稀释至20 μM，并于-80 °C保存以备后续使用。 
	注意：本研究中使用的DNA/RNA底物的寡核苷酸序列列于表2中。</li>
	<li>为MOV10解旋酶活性测定中的双链RNA（dsRNA）退火反应配制如下混合液：在终体积为20 μL的反应体系中，加入pH 7.5的60 mM N-2-羟乙基哌嗪-N-乙烷磺酸（HEPES）、6 mM KCl、0.2 mM MgCl2以及无RNase的ddH2O。</li>
	<li>通过将生物素标记的上链（终浓度2 μM）与其1.5倍量的未标记互补下链在退火缓冲液（步骤2.2）中混合，于95 °C加热5分钟，然后缓慢冷却至室温（RT），使RNA寡核苷酸退火形成RNA双链结构。</li>
</ol>
3. 体外生化实验
<ol>
	<li>EMSA 与酶促反应
	<ol>
		<li>进行 MEIOB EMSA 实验时，在最终反应体积为 20 μL 的体系中混合以下组分：pH 7.5 的 50 mM Tris HCl、2 mM MgCl2、50 mM NaCl、10 mM EDTA、2 mM 二硫苏糖醇（DTT）、0.01% NP-40、0.8 mM（或如图 2和图 3所示的其他相关浓度）MEIOB 蛋白、10 nM 生物素标记的寡核苷酸以及 ddH2O。室温孵育 30 分钟后，加入 5×终止缓冲液（125 mM EDTA，50% 甘油）以终止反应。&#160;</li>
		<li>设置 MEIOB 核酸酶活性反应，步骤同 3.1.1，但不添加 10 mM EDTA。</li>
		<li>进行 MOV10 解旋酶活性检测时，在最终反应体积为 20 μL 的体系中混合以下组分：pH 7.5 的 50 mM Tris-HCl、20 mM KoAc、2 mM MgCl2、0.01% NP-40、1 mM DTT、2 U/μL RNase 抑制剂、10 nM 生物素标记的 RNA 底物、2 mM 三磷酸腺苷（ATP）、100 nM RNA 捕获探针（RNA trap）和 20 ng MOV10 蛋白以及 ddH2O。将反应混合物分别在 37 °C 下孵育 10 分钟、30 分钟和 60 分钟，随后加入 5×终止缓冲液以终止反应。 
		注：RNA 捕获探针是一种未标记生物素的寡核苷酸，其序列与标记探针互补，可防止解链后的双链 RNA 再次退火。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚丙烯酰胺凝胶
	<ol>
		<li>清洗玻璃板（16 cm × 16 cm）和 1.5 mm 的梳子，并组装电泳装置。</li>
		<li>配制 10% 天然聚丙烯酰胺凝胶：混合 14 mL ddH2O、1.25 mL 10×Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液、8.3 mL 30% 丙烯酰胺溶液、1.25 mL 50% 甘油、187.5 μL 新鲜配制的 10% 过硫酸铵（APS）以及 12.5 μL 四甲基乙二胺（TEMED）。</li>
		<li>配制 20% 天然聚丙烯酰胺凝胶：混合 5.5 mL ddH2O、1.25 mL 10×TBE 缓冲液、1.25 mL 50% 甘油、16.7 mL 30% 丙烯酰胺溶液、187.5 μL 10% APS 以及 12.5 μL TEMED。</li>
		<li>立即倒入玻璃板中，插入梳子，室温聚合约 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶电泳
	<ol>
		<li>取出梳子，向电泳槽中加入电泳运行缓冲液（0.5×TBE）。</li>
		<li>用 0.5×TBE 缓冲液冲洗样品孔，然后在冰浴中以 100 V 预电泳 30 分钟，之后更换为新鲜的 0.5×TBE 缓冲液。</li>
		<li>每孔上样 20–25 μL 样品。</li>
		<li>EMSA 实验使用 10% 天然丙烯酰胺凝胶，酶促反应使用 20% 天然丙烯酰胺凝胶。在冰浴中以 100 V 进行电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部四分之一处。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拆卸玻璃板，修剪凝胶以去除加样孔和未使用的泳道，将凝胶置于 0.5×TBE 缓冲液中。</li>
	<li>将滤纸和尼龙膜裁剪至与凝胶相同尺寸，并预先用去离子水润湿干净的滤纸和尼龙膜。</li>
	<li>组装转膜夹心结构。
	<ol>
		<li>将预湿的尼龙膜放置在预湿的滤纸上。</li>
		<li>将凝胶置于膜上。</li>
		<li>在凝胶上方覆盖另一层预湿的滤纸。</li>
		<li>用洁净的移液管从中心向边缘滚动，以去除所有气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在半干式电转装置中以 90 mA 电流将样品从凝胶转移至膜上，持续 20 分钟。</li>
	<li>停止转膜，将膜放在新的滤纸上干燥 1 分钟。</li>
	<li>使用配备 254 nm 紫外灯的紫外交联仪（自动交联模式）以 120 mJ/cm2 照射 45–60 秒进行交联固定，随后在室温下空气中干燥 30 分钟。</li>
	<li>化学发光检测
	<ol>
		<li>方案 1：使用标准体积的商业化化学发光核酸检测试剂盒。
		<ol>
			<li>向膜中加入 20 mL 封闭缓冲液，在 20–25 rpm 的摇床上轻柔振荡孵育 15–30 分钟。</li>
			<li>在 20 mL 封闭缓冲液中加入 66.7 μL 稳定化的链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，配制成偶联物/封闭缓冲液工作液。</li>
			<li>轻轻移除封闭缓冲液，替换为偶联物/封闭缓冲液，于 20–25 rpm 摇床上孵育 15 分钟。</li>
			<li>以 40–45 rpm 振荡洗涤膜 4 次，每次 5 分钟。</li>
			<li>向膜中加入 30 mL 底物平衡缓冲液，在 20–25 rpm 摇床上振荡孵育 5 分钟。</li>
			<li>将 6 mL 发光增强液加入 6&#160;mL 稳定过氧化物溶液中，配制成底物工作液。避光操作。&#160;</li>
			<li>用底物工作液完全覆盖膜表面，孵育 5 分钟。</li>
			<li>在化学发光成像系统中扫描膜 1–3 秒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>方案 2：使用稀释 2 倍的商业化化学发光核酸检测试剂盒，并按照步骤 3.10.1.1–3.10.1.8 操作。</li>
		<li>方案 3：使用自制试剂6。
		<ol>
			<li>配制封闭缓冲液：混合 pH 7.5 的 0.1 M Tris-HCl、0.1 M NaCl、2 mM MgCl2 和 3% 牛血清白蛋白 V 级。AP 7.5 缓冲液：混合 pH 7.5 的 0.1 M Tris-HCl、0.1 M NaCl 和 2 mM MgCl2。AP 9.5 缓冲液：混合 pH 9.5 的 0.1 M Tris-HCl、0.1 M NaCl 和 50 mM MgCl2。TE 缓冲液：混合 pH 8.0 的 10 mM Tris-HCl 和 pH 8.0 的 1 mM EDTA。</li>
			<li>将膜在封闭缓冲液中 30 °C 浸泡 1 小时。</li>
			<li>在 10 mL AP 7.5 缓冲液中加入 8.5 μL 链霉亲和素-碱性磷酸酶，将膜在该溶液中室温轻柔振荡孵育 10 分钟，随后用 15 mL AP 7.5 缓冲液洗涤 2 次，每次 10 分钟。</li>
			<li>再用 20 mL AP 9.5 缓冲液洗涤膜一次，每次 10 分钟。加入 20 mL TE 缓冲液以终止反应。</li>
			<li>向膜上加入 7.5 mL 显色液，在化学发光成像系统中扫描 1–3 秒。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

研究蛋白质与核酸的相互作用对于理解多种生物过程背后的分子机制至关重要。例如，MEIOB 是一种睾丸特异性蛋白，在哺乳动物的减数分裂和生育力中发挥关键作用25,26,27MEIOB 含有一个可结合单链 DNA 的 OB 结构域，并表现出 3' 到 5' 外切核酸酶活性26，这与其在减数分裂重组过程中的生理相关性直接相关。另一个例子是MOV10，它是一种具有广泛功能的RNA解旋酶，可能与RNA二级结构结合16因此，MOV10 具有广泛的 RNA 结合特性以及 5' 至 3' 方向的 RNA 双链解旋活性16. 报道上述蛋白质生化活性的研究依赖于使用 32使用P同位素标记核酸用于体外检测。在本研究中，我们建立了一系列生物素标记的 体外 MEIOB 和 MOV10 功能的实验。这...

蛋白质与核酸的相互作用参与了许多重要的细胞过程，例如DNA修复、复制、转录、RNA加工以及翻译。在染色质中，蛋白质与特定DNA序列的相互作用对于在转录水平上严格调控基因表达至关重要1。大量编码和非编码RNA的精确转录后调控需要蛋白质与RNA之间广泛而复杂的相互作用2。这些基因表达调控机制的层次构成了由多个动态分子间事件级联组成的网络，这些事件由转录/表观遗传因子或RNA结合蛋白与其核酸靶标之间的相互作用，以及蛋白质-蛋白质相互作用共同协调完成。为了阐明体内蛋白质是否直接或间接地与核酸相关联，以及这些关联如何发生并最终实现功能，通常通过体外生化实验来检测目标蛋白质在设计好的DNA和/或RNA底物上的结合亲和力或酶活性。
已开发出多种技术用于检测和表征核酸-蛋白质复合物，包括电泳迁移率偏移实验（EMSA），也称为凝胶阻滞实验或条带迁移实验3,4,5EMSA 是一种多功能且灵敏的生化方法，广泛用于研究蛋白质与核酸之间的直接结合。EMSA 依赖于电泳迁移率的变化，通常通过化学发光法检测生物素标记，以常规观察条带的迁移情况。6,7荧光染料标记的荧光信号8,9，或通过放射性自显影技术检测放射性 32P 标签10,11生化研究的其他目的还包括鉴定和表征蛋白质在核酸加工过程中的活性，例如 &#160;基于核酸酶的反应评估核酸底物的切割产物12,13,14 以及DNA/RNA结构解旋实验以评估解旋酶活性15,16,17.
在这些酶活性测定中，由于灵敏度高，通常使用放射性同位素标记或荧光染料标记的核酸作为底物。分析涉及32P标记示踪剂的酶促反应的放射自显影结果已被证明具有高灵敏度和良好的可重复性18。然而，目前全球越来越多的实验室因放射性物质潜在暴露带来的健康风险而限制甚至禁止使用放射性同位素。除生物安全方面的顾虑外，其他缺点还包括操作放射性物质所需的专用设备、必须取得放射性许可证、32P的半衰期较短（约14天），以及探针因辐射分解而逐渐降低质量。因此，已发展出多种非同位素替代方法（例如，用荧光染料标记探针可通过荧光成像进行检测）19。然而，使用荧光标记探针时需要配备高分辨率成像系统。生物素是一种常用的标记物，可高效结合蛋白质和核酸等生物大分子。生物素-链霉亲和素系统作用高效，可在不增加非特异性背景信号的前提下提高检测灵敏度20,21。除凝胶迁移实验（EMSA）外，生物素还广泛应用于蛋白质纯化、RNA下拉实验等多种实验技术中22,23,24。
本方案成功地将生物素标记的核酸用作体外生化实验的底物，包括凝胶迁移实验（EMSA），以及此前较少使用生物素标记的酶促反应。构建了MEIOB的OB结构域，并表达了两种突变体（截短突变和点突变）作为GST融合蛋白25,26,27，同时表达了小鼠MOV10重组FLAG融合蛋白16。本报告强调了该联合方案在蛋白质纯化及生物素标记检测方面，适用于多种实验目的的有效性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>化学发光成像系统</td><td>Tanon, China</td><td>5200</td><td></td></tr><tr><td>数字式超声破碎仪</td><td>Branson, USA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 瓦特；50/60 赫兹</td></tr><tr><td>半干式电泳转膜仪</td><td>Hoefer, USA</td><td>TE77XP</td><td></td></tr><tr><td>管式旋转混合器&amp;nbsp;</td><td>Crystal, USA</td><td>3406051</td><td></td></tr><tr><td>紫外光交联仪</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 离心过滤器&amp;nbsp;</td><td>Milipore, USA</td><td>UFC801096</td><td>4 毫升/10 千道尔顿</td></tr><tr><td>尼龙膜</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>TG263940A</td><td></td></tr><tr><td>TC处理培养皿</td><td>Corning, USA</td><td>430167</td><td>100 毫米&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TC处理培养皿</td><td>Corning, USA</td><td>430597</td><td>150 毫米&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>AXYGEN, USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 毫升&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Corning, USA</td><td>430791</td><td>15 毫升</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>SunShine Bio, China</td><td>8h288h28</td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG M2磁珠</td><td>Sigma, USA</td><td>M8823</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>591136</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒</td><td>Beyotime, China</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>CelLytic&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; M 细胞裂解试剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma, USA</td><td>107M4071V</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II 一步法克隆试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Vazyme, China</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>化学发光核酸检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>T1269950</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, USA</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS缓冲液</td><td>Gibco, USA</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9260G</td><td>0.5 M</td></tr><tr><td>无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche, USA</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi 质粒提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Vazyme, China</td><td>&amp;nbsp;&lt;br/&gt; DC202</td><td></td></tr><tr><td>FastPure 凝胶DNA小量提取试剂盒</td><td>Vazyme, China</td><td>DC301-01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco, USA</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FLAG多肽</td><td>Sigma, USA</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma, USA</td><td>SHBK3676</td><td></td></tr><tr><td>GST大量纯化试剂盒</td><td>GE Healthcare, USA</td><td>27-4570-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Sigma, USA</td><td>SLBZ2837</td><td>1 M&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钾</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>127-08-02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 转染试剂</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9530G</td><td>1 M</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9759&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>5 M&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, USA</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM培养基</td><td>Gibco, USA</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10010023</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>RNase抑制剂</td><td>Promega, USA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-碱性磷酸酶</td><td>Promega, USA</td><td>V5591</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15567027</td><td>1 M, pH 7.4</td></tr><tr><td>Tris-HCl缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15568025</td><td>1 M, pH 8.0</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600560</td><td></td></tr></tbody></table>

利用生物素标记进行体外生化实验研究蛋白质-核酸相互作用

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

蛋白质与核酸的相互作用在转录、重组以及RNA代谢等生物学过程中发挥着重要作用。研究蛋白质-核酸相互作用的实验方法通常需要使用荧光标记、放射性同位素或其他标签来检测和分析特定的目标分子。生物素作为一种非放射性核酸标记物，常用于电泳迁移率变动分析（EMSA），但尚未被常规用于监测核酸过程中蛋白质的活性。本实验方案展示了在体外酶促反应中使用生物素标记的应用价值，并证明该标记适用于多种不同的生物化学分析方法。具体而言，与先前使用放射性同位素32P标记底物所得结果一致，通过生物素标记的EMSA证实：MEIOB（一种特异性参与减数分裂重组的蛋白质）是一种DNA结合蛋白，MOV10（一种RNA解旋酶）能够解析生物素标记的RNA双链结构，且MEIOB可切割生物素标记的单链DNA。本研究证明，生物素可在体外多种与核酸相关的生物化学分析中有效替代32P。&#160;

MEIOB 的蛋白质结构以及本研究中使用的表达载体如图1A所示。MEIOB 中的 OB 折叠为紧凑的桶状结构，能够识别并结合单链核酸。其中一个 OB 结构域（氨基酸136-307，载体A）可结合单链DNA（ssDNA），而截短蛋白（氨基酸136-178截短，载体C）以及点突变形式（R235A突变，载体E）的MEIOB则不具有DNA结合活性26。GST-MEIOB融合蛋白在BL21细菌中过表达，经过后续纯化步骤后，通过考马斯亮蓝染色和Western印迹分析获得了纯化的蛋白（图1B）。不同浓度的核酸底物显示了生物素信号的高度灵敏性，在1-3秒的较短曝光时间内即可检测到1 nM的寡核苷酸信号（图2A）。野生型MEIOB-A蛋白能够强烈结合36 nt生物素标记的ssDNA底物（长度和序列与先前研究中使用的相同<sup c...

本文介绍使用生物素标记的体外生化检测方法，该方法可广泛应用于&#160;适用于研究蛋白质-核酸相互作用。

蛋白质与核酸相互作用在转录、重组以及RNA代谢等生物过程中发挥着重要作用。实验……

本方案提供了一种生物素标记的平台，用于研究蛋白质与核酸的相互作用，具有稳健、可靠、高效且经济的特点。同一批生物素标记的核酸可在较长时间内重复使用，确保实验的可重复性。最后，此处所述的所有生物素标记实验均可在一天内完成，且无需特殊设备。本实验操作将由我实验室的研究生 Lina Yu 进行演示。准备 MEIOB 和 MOV10 载体，并将其转化至合适的细菌中。提取 MEIOB 时，通过离心收集细胞沉淀，并将其重悬于 20 毫升冰上预冷的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）缓冲液中。将细菌悬液在冰上进行超声处理。然后，在4 °C、12,000 × g 条件下离心裂解液15分钟，并将上清液转移至新的离心管中。预先洗涤谷胱甘肽-Sepharose凝胶珠，并将其与裂解液在4 °C下孵育2小时。将混合物在 750 × g 和 4 °C 条件下离心 1 分钟，使磁珠沉淀。用 10 毫升预冷的 PBS 洗涤磁珠 8 次。然后加入 1 毫升洗脱缓冲液，在 4 °C 下孵育磁珠 10 分钟，通过离心洗脱磁珠。重复洗脱六次，合并六次的洗脱组分。将洗脱的蛋白质转移至离心过滤管中，在7,500 × g离心浓缩至终体积为100至200微升。为提取MOV10，按照文稿说明在HEK293T细胞中表达该蛋白，并收集细胞沉淀。将沉淀重悬于3 mL细胞裂解缓冲液中，缓冲液中需含有完整的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物，冰上孵育30分钟。然后在4°C下离心裂解液。用K150缓冲液洗涤抗FLAG磁珠两次，以进行磁珠的预处理。洗涤后，将珠子重悬于1毫升预冷的K150缓冲液中，在4°C下轻轻旋转孵育2分钟。置于磁力架上收集珠子，并移除上清液。将珠子加入细胞裂解液中，在4°C下孵育2小时。根据文稿说明，用K150缓冲液洗涤磁珠，并将磁珠重悬于300微升FLAG洗脱缓冲液中。将磁珠置于磁力架上，收集含有MOV10蛋白的上清液，并测定蛋白浓度。通过将每种寡核苷酸稀释至20微摩尔，并根据文稿说明退火形成RNA双链，来制备RNA寡核苷酸。对于MEIOB电泳迁移率变动分析（EMSA），按照手稿中的说明混合试剂。加入水，使最终反应体积为20 µL。在室温下孵育反应体系30分钟，然后加入5×终止缓冲液。对于MOV10解旋酶活性检测，按照文稿中的说明混合试剂，并加入水使最终反应体积为20 µL。将反应体系在37°C下孵育10分钟、30分钟和60分钟，然后加入5×终止缓冲液以终止反应。随后，制备一块20%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将每个样品的20至25 µL上样至各加样孔中。将凝胶置于冰浴中，以100伏电压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部四分之一处。丙烯酰胺具有危害性和毒性，操作时务必使用适当的个人防护装备。拆卸凝胶板，修剪凝胶以去除加样孔和未使用的泳道。将凝胶置于0.5x TBE缓冲液中。将滤纸和尼龙膜裁剪至与凝胶相同大小，预先浸湿滤纸和膜，然后组装转膜叠层。将样品从凝胶转移至膜上，使用半干式电泳装置，以90毫安电流转移20分钟。随后，通过以120毫焦耳/平方厘米的强度照射膜45至60秒，对样品进行交联。进行化学发光检测时，首先向膜中加入20毫升封闭缓冲液，在轻轻摇动的条件下孵育15至30分钟。小心移除封闭缓冲液，并替换为偶联物/封闭缓冲液。再次将膜孵育15分钟。在摇床上每次5分钟，共洗涤4次。然后，向膜中加入 30 毫升底物平衡缓冲液，在 20 至 25 rpm 条件下振荡孵育 5 分钟。用底物工作液完全覆盖膜的表面，并孵育 5 分钟。孵育结束后，在化学发光成像系统中扫描膜 1 至 3 秒。可通过考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹分析验证MEIOB蛋白A、C和E的纯化结果。红色箭头指示纯化的MEIOB蛋白的位置。MEIOB与单链DNA的相互作用可通过凝胶迁移阻滞实验（EMSA）进行观察。可观察到浓度依赖性的结合与切割现象。与预期一致，仅野生型 MEIOB-A 能与 DNA 发生相互作用，而突变型 MEIOB-E 和 MEIOB-C 则不能。MEIOB 与单链 RNA 的相互作用也可被观察到。野生型MEIOB在单链RNA上表现出浓度依赖性的结合和外切核酸酶活性。然而，定量比较显示，MEIOB与DNA的结合效率高于RNA。MOV10的纯化通过考马斯亮蓝染色验证，并在具有5'突出端的RNA双链上检测其解旋酶活性。随着反应时间的延长，MOV10 逐步解旋双链 RNA。为降低检测成本，化学发光检测可采用检测试剂盒试剂两倍稀释的方案，或使用自制试剂完成。本方案成功地将生物素标记的核酸用作体外生化实验（如 EMSA）的底物，以及生物素此前并不常用的酶促反应中的底物。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用生物素标签研究蛋白质-核酸相互作用的体外生化分析

测试蛋白质-蛋白质相互作用对于解析蛋白质功能至关重要。本文介绍了一种 体外...

蛋白质膜覆盖实验：检测可溶性与不溶性蛋白质相互作用的实验方案 体外

本视频展示了一种利用生物素标记的细胞穿透肽检测细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的技术。细胞穿透肽可促进其偶联的肽段进入细胞，并特异性结合与其相互作用的蛋白质。在与亲和素结合后，生物素能够从细胞裂解液中纯化出相互作用蛋白质的复合物。...

生物素标记的细胞穿透肽探针用于检测蛋白质-蛋白质相互作用

在本视频中，我们演示了检测目标蛋白解旋酶活性以解旋生物素标记的双链RNA底物的实验步骤。通过分析电泳迁移率变化，并结合使用化学发光酶偶联链霉亲和素进行化学发光检测，来鉴定该酶的活性。...

使用生物素标记的RNA双链体测定靶蛋白的解旋酶活性

我们开发了一种基于ELISA的定量DNA结合检测方法，用于测量转录因子与DNA的相互作用。通过使用共识DNA识别寡核苷酸和特异性单克隆抗体，实现了对RUNX2蛋白的高特异性检测。采用酶偶联抗体底物反应进行比色检测，并实时监测信号变化。...

一种用于研究蛋白质与DNA相互作用、发现基因表达转录调控因子及鉴定新型抗肿瘤药物的定量检测方法

本文所述方案介绍了利用生物膜干涉技术（Bio-layer...

生物层干涉技术用于测定蛋白质-蛋白质相互作用动力学及变构配体效应

本报告介绍了两种基于生物素标记的方法，用于测定在质膜上表达的蛋白质的细胞表面表达水平及其内吞速率。...

利用生物素标记法测定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达及内吞速率

本实验方案基于生物素-亲和素沉淀系统，并结合细胞穿透序列，用于研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用。其主要优势在于目标序列与活细胞共同孵育，而非细胞裂解物，因此相互作用可在细胞生理环境下发生。...

生物素标记的细胞穿透肽用于研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用

此处，我们介绍一种经过优化的 体外 利用人源细胞总蛋白提取物、包被生物素化RNA的链霉亲和素磁珠及质谱分析，鉴定、定量和验证特定RNA序列的蛋白互作分子的方法。...

一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

本文介绍了一种利用基于链霉亲和素的生物层干涉技术（BLI）系统研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。文中概述了使用基本或高级结合动力学方法测定相互作用的平衡结合亲和力（KD）所需的关键步骤和注意事项。...

利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用

本方案介绍了一种基于生物素连接酶与目标蛋白融合后，利用其邻近效应在活体（in...

体内邻近生物素化用于四膜虫（Paramecium tetraurelia）蛋白质相互作用研究

学习使用生物素标记核酸进行蛋白质-核酸相互作用的体外生化分析方法。该方法无需特殊设备，一天内即可完成实验，且同批次标记核酸可长期保存使用，确保实验结果的可重复性。

利用生物素标记进行体外生化实验研究蛋白质-核酸相互作用

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