Name: 在斑马鱼肿瘤异种移植物中宿主血管反应的Vivo成像和定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 了解利用转基因斑马鱼幼虫进行肿瘤异种移植物血管化的活体定量检测方法。该技术通过荧光标记实现血管成像，可准确量化肿瘤诱导的血管生成水平，为癌症研究提供可靠的体内模型。

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感谢Alhad Mahagaonkar先生对奥克兰大学斑马鱼设施的管理，以及奥克兰大学医学院生物医学影像研究单元在延时共聚焦显微镜技术方面的协助。本研究得到了新西兰卫生研究理事会项目资助（14/105）、新西兰皇家学会Marsden基金项目资助（UOA1602）和奥克兰医学研究基金会项目资助（1116012）的支持，以上资助均授予J.W.A.。

1. 显微注射针的制备
<ol>
	<li>打开微电极拉制仪，并设置以下参数（已针对材料表中所列的微电极拉制仪型号进行校准）：加热值 680；拉力 75；速度 40；时间 55；气压：530。</li>
	<li>将一根硼硅酸盐玻璃毛细管固定在微电极拉制仪上，拉制毛细管以制成两根针状电极。根据需要重复此步骤以制备更多电极。</li>
</ol>
2. 用于移植的细胞培养
注意：使用本实验方案时，可将任何哺乳动物癌细胞系植入斑马鱼胚胎中作为异种移植。然而，不同细胞系所诱导的血管生成反应存在较大差异5,11,12。已有研究表明，B16-F1 小鼠黑色素瘤细胞可在斑马鱼胚胎中诱导强烈的血管生成反应11，因此适用于本方案。
<ol>
	<li>在37 °C条件下，使用添加了胎牛血清（FBS）至终浓度10%（v/v）以及青霉素/链霉素（每种抗生素终浓度均为100 μg/mL）的MEM-α培养基，在75 cm2培养瓶中培养B16-F1细胞。</li>
	<li>从95–100%融合度的75 cm2培养瓶中吸除培养基，加入5 mL室温磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>吸除5 mL PBS，加入2 mL室温的0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），于37 °C孵育60秒。</li>
	<li>轻敲培养瓶侧面，观察细胞是否开始从瓶底脱离。</li>
	<li>加入8 mL含10% FBS的室温MEM-α培养基，用移液器反复吹打瓶内壁，使仍贴壁的细胞悬浮，并将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>将细胞悬液在800 ×g、4–8 °C条件下离心5分钟，吸除上清液，随后进行细胞染料标记。</li>
</ol>
3. 使用荧光染料标记 B16-F1 细胞
注意：为了区分植入的肿瘤细胞与胚胎中的其他细胞，必须在植入前用适当的荧光染料标记肿瘤细胞。如果细胞已表达荧光报告基因，则可省略此步骤。
<ol>
	<li>将2 mL无血清MEM-α培养基在37 °C下孵育。</li>
	<li>配制所选染料的储备液，并将其稀释于预孵育的2 mL无血清MEM-α培养基中，以获得适宜的工作浓度（适用于B16 F1细胞的染料及其浓度示例见材料表）。</li>
	<li>将1 mL染料溶液加入细胞沉淀（来自步骤2.6）中，通过移液充分混匀，然后加入剩余的1 mL染料溶液并再次混匀。</li>
	<li>将细胞与染料混合物在37 °C孵育40分钟，在20分钟时轻轻振荡混匀一次。</li>
	<li>在800 xg、4–8 °C条件下离心细胞悬液5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用5 mL PBS通过移液洗涤标记后的细胞。</li>
	<li>再次在800 xg、4–8 °C条件下离心细胞悬液5分钟，吸除上清液，将细胞置于冰上，直至准备移植。 
	注意：最终的肿瘤细胞沉淀体积应为20–40 μL。</li>
</ol>
4. 胚胎移植前的准备
注意：选择一种具有荧光标记血管的转基因斑马鱼品系（例如 kdrl:RFP, fli1a:EGFP 等）13,14。
<ol>
	<li>在移植前两天，按照先前所述方法繁殖斑马鱼并收集胚胎15。 
	注意：由于我们不在早期阶段注射这些鱼，因此无需像Rosen等人15所述那样在产卵后20分钟内收集，而可在交配数小时后收集。</li>
	<li>将胚胎以约100个/皿的密度置于100 mm培养皿中。</li>
	<li>向每皿中加入50 mL E316（添加5 μL 1% w/v的亚甲蓝水溶液储备液以防止污染），清除死亡胚胎或碎片，并将培养皿置于28 °C黑暗培养箱中，直至准备注射。</li>
	<li>受精后1天（dpf），向每皿中加入1-苯基-2-硫脲（PTU），使E3中PTU的终浓度为30 mg/L。PTU可抑制色素形成，避免干扰对肿瘤细胞和血管的观察。</li>
	<li>在2 dpf时，使用针头或镊子手动去除未孵化胚胎的卵膜。利用荧光显微镜挑选出异种移植所需数量的转基因胚胎（50–200个）。</li>
	<li>移植前，将选定的胚胎置于含300 μg/mL Tricaine的E3溶液中进行麻醉，以防止注射过程中胚胎移动。</li>
	<li>在35 mm培养皿中加入2%甲基纤维素的E3溶液，加至皿体积的四分之一。</li>
	<li>使用移液管将约50个胚胎（尽量减少同时转移的E3溶液体积）转移至甲基纤维素上。</li>
	<li>使用Microloader移液器吸头调整胚胎位置，使其全部垂直排列，头部朝上，左侧朝上。 
	注意：步骤4.7–4.9也可通过将胚胎排列在琼脂糖块上完成，如先前所述17，但根据我们的经验，使用甲基纤维素排列胚胎更为简便。</li>
</ol>
5. 将哺乳动物癌细胞注射至2 dpf胚胎的卵周腔
注意： 为确保细胞在移植时聚集成移植物，必须将细胞与细胞外基质混合物（ECM）混合。我们已描述了使用文献中提及的ECM混合物制备此类细胞/ECM混合物的步骤。 材料表若使用其他基质，应相应调整步骤。
<ol>
	<li>将ECM原液分装至500 μL离心管中，每管100 μL，于-20 °C保存备用。</li>
	<li>取出一份ECM分装样品，加入100 μL PBS稀释至50%（v/v）。 
	注意：稀释后的50% ECM可在4 °C保存最多1个月。</li>
	<li>用移液器吹打并搅拌，将50% ECM与B16-F1细胞沉淀（来自步骤3.7）充分混匀，制备成细胞/ECM体积比为2:1的混合物，并将混合物置于冰上保存。</li>
	<li>使用微毛细移液管吸取3–10 μL细胞混合物。</li>
	<li>小心将移液管尖端插入针头中，并将B16-F1/基质混合物推出至针头末端。</li>
	<li>将针头插入针头架中，并将其倾斜至与培养皿呈45°角。</li>
	<li>使用镊子折断针头尖端，形成一个足够大的孔，使细胞能够顺利从针头中推出而不会受到挤压。</li>
	<li>打开连接至注射装置的加压空气气缸，短暂将注射器切换至“连续”模式，以推动细胞至针头尖端。</li>
	<li>将针头从培养皿中取出，并更换为血细胞计数板。</li>
	<li>在血细胞计数板上滴加一滴油，将针头在此油滴上注射一次。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数单次脉冲所排出的细胞数量，并通过调节脉冲持续时间，校准针头使其每次脉冲排出约150个细胞。 
	注意：每次脉冲排出的细胞数量需进行多次脉冲才能成功移植异种移植物。通过适度调整脉冲次数和位置，研究人员可更精确地控制最终肿瘤异种移植物的大小。</li>
	<li>将针头对准胚胎的卵黄囊，沿腹侧方向穿刺进入卵黄囊，直至针头尖端穿出卵黄囊，并顶起胚胎腹侧心脏后方的表皮组织。 
	注意：应使针头进入卵黄囊的位置位于细胞最终排出位置的前方，以确保细胞排出方向远离心脏，降低将细胞注入总主静脉的风险。</li>
	<li>小心将针头尖端向前推进少许，使其在表皮与卵黄囊膜之间形成一个空间（卵黄周腔），然后触发脉冲，将部分细胞混合物注入卵黄周腔。</li>
	<li>重复脉冲操作，直至向卵黄周腔内注入500–800个细胞，形成一个可见的隆起，其范围至少延伸至卵黄囊底部的一半长度，随后将针头从胚胎中撤出。 
	注意：若细胞堵塞针头或在注射过程中受损，可短暂切换至“连续”模式再返回“脉冲”模式，以清除堵塞，使细胞能够自由且无损地排出。</li>
	<li>对培养皿中的所有胚胎重复上述操作，必要时更换装载肿瘤细胞的新针头。</li>
	<li>完成所有胚胎注射后，移除针头，并使用微毛细移液管尖端将所有胚胎聚集在一起，以便用尽可能少的甲基纤维素将其移出。</li>
	<li>将胚胎转移至含有E3培养液（含PTU和亚甲蓝）的恢复皿中，通过轻柔吹打E3培养液对胚胎进行清洗。 
	注意：此时可通过将胚胎分至不同培养皿中，向其中一皿加入药物溶液，另一皿加入对照溶液（如药物溶剂），对异种移植胚胎进行药物处理。</li>
	<li>将胚胎在34 °C条件下孵育，并每日两次检查，及时移除死亡或水肿的胚胎。 
	注意：34 °C被证实是异种移植物血管化的最佳温度，其他采用斑马鱼胚胎异种移植血管生成模型的研究也使用该温度18。异种移植物可在移植后48 hpi（小时）内任意时间点进行成像观察。</li>
</ol>
6. 活细胞成像
<ol>
	<li>在48 hpi时，挑选3-5个无水肿的健康胚胎。用150 μg/mL Tricaine麻醉胚胎，并按照先前所述方法将其侧向固定于1%低熔点（LMP）琼脂糖中19。 
	注意：在琼脂糖凝固过程中，使用微毛细移液管尖端保持胚胎处于侧向位置。</li>
	<li>打开共聚焦显微镜、显微镜控制器、激光器以及用于控制显微镜的计算机软件。</li>
	<li>将培养皿置于共聚焦显微镜上。使用20倍放大倍率的水浸物镜，通过明场成像将异种移植瘤置于视野中央。</li>
	<li>选择适合检测用于标记肿瘤细胞的染料以及用于标记斑马鱼血管的荧光染料的激发激光器。</li>
	<li>调节每个激光通道的增益，使其能够同时检测到肿瘤细胞和血管。 
	注意：一旦确定共聚焦显微镜的设置参数，应确保整个实验过程中保持不变，以便对不同异种移植瘤之间进行比较。</li>
	<li>使用适用于肿瘤细胞的激光通道，确定一个成像体积，该体积需包含整个异种移植瘤的体积，并在移植物两侧至少保留一到两个光学切片。采用约5 μm的切片间隔，生成z轴堆叠图像。 
	注意：z轴堆叠图像必须包含异种移植瘤的全部体积。</li>
	<li>使用双通道成像，同时对肿瘤异种移植瘤和血管进行成像。对每只待成像的幼鱼重复执行步骤6.6–6.7。</li>
</ol>
7. 时间序列成像
注意： 由于该模型具有透明性，并且存在可荧光标记不同类型细胞的转基因斑马鱼品系，因此非常适用于成像动态的细胞过程。这使得延时成像成为该模型的一项关键应用。
<ol>
	<li>在成像前至少2小时打开环境培养箱，并将温度设置为34 °C。如果培养箱不具备加湿功能，需放置盛水的培养皿以增加湿度。</li>
	<li>使用120 μg/mL Tricaine对3-5个胚胎进行麻醉（2 dpf时）或使用100 μg/mL Tricaine（3 dpf时），然后按照先前描述的方案19将胚胎侧向固定于0.8% LMP琼脂糖中，用于延时成像。 
	注意：在琼脂糖凝固过程中，使用微毛细移液管尖端保持胚胎处于侧向位置。</li>
	<li>按照步骤6.2–6.7所述设置设备并对异种移植区域进行成像，每10分钟采集一次异种移植区域的z轴层扫图像。 
	注意：成像过程中必须维持胚胎处于34 °C，且需定期检查并补充覆盖在琼脂中幼鱼上方的E3培养基，以防止其干燥。</li>
</ol>
8. 斑马鱼异种移植模型中血管生成反应的定量分析
注意：以下步骤使用三维图像分析软件。具体操作步骤将根据所使用的软件而有所不同。
<ol>
	<li>将肿瘤异种移植的z轴堆叠共聚焦图像文件转移至3D图像分析软件中的一个新文件夹。 
	注意：为了定量分析肿瘤血管化水平，必须创建测量方案，并校准其设置，以便可用于测量所有异种移植瘤的肿瘤体积或血管体积。</li>
	<li>要创建用于测量肿瘤异种移植体积的“肿瘤体积”方案，请转到顶部菜单中的“测量”选项卡，然后从窗口左侧显示的方案列表中，将名为“查找对象”的方案拖动到标题为“将任务拖至此处以进行测量”的区域中。</li>
	<li>确保该方案设置为在肿瘤通道中测量对象，然后从方案列表中将名为“裁剪至感兴趣区域（ROI）”和“从群体生成ROI”的方案拖动到“将任务拖至此处以进行测量”区域。确保这两个命令应用于“查找对象”所识别的对象。</li>
	<li>在校准该方案设置之前，请转到窗口左上角“模式”标签上方的下拉菜单，并选择“扩展聚焦”视图。&#160;</li>
	<li>通过点击最右侧窗格中每个通道标题下方的黑色圆圈，取消选中非肿瘤通道，仅保留肿瘤通道可见。使用窗口顶部的“手绘”工具，在整个肿瘤体积周围绘制一个“感兴趣区域”（ROI）。 
	注意：请确保ROI包含全部肿瘤区域，避免遗漏。这将为校准设置时执行方案提供一个操作区域。</li>
	<li>在图像下方的面板中选择“摘要”标签，并将“显示”选项设置为显示“群体2”。在校准过程中，点击“查找对象”任务中的星号，打开设置窗口。使用“强度”调整“阈值”，确定“下限”阈值，直到仅选中肿瘤细胞而背景荧光未被选中。&#160; 
	注意：这一点至关重要，以确保仅检测所选ROI内（如步骤8.5中绘制）肿瘤细胞的荧光信号，而不测量任何背景荧光。</li>
	<li>设定“最小对象尺寸”，以确保仅完整细胞被测量，而非较小的细胞碎片（例如，将“最小对象尺寸”设置为100 μm3）。通过点击顶部菜单中的“测量”选项卡并点击“保存方案”，将此方案保存为“肿瘤体积”，并在测量所有异种移植瘤时使用相同的设置。</li>
	<li>要测量异种移植相关血管的体积，需创建一个新的方案。转到顶部菜单，点击“测量”选项卡，然后点击“清除方案”。将“查找对象”和“裁剪至ROI”任务拖入标题为“将任务拖至此处以进行测量”的区域中，用于此新方案。&#160;</li>
	<li>确保第一个命令设置为在血管通道中测量对象，且后续命令应用于第一个命令所识别的对象。然后在最右侧窗格中取消选中非血管通道，仅保留血管可见。</li>
	<li>以与“肿瘤体积”方案类似的方式确定“血管体积”的设置，并将此方案保存为“血管体积”（参见8.6–8.7）。</li>
	<li>清除当前方案，并围绕异种移植瘤绘制一个ROI，注意不要包含任何非肿瘤来源的自发荧光。通过点击“测量”选项卡，选择“恢复方案”命令并选择“肿瘤体积”方案，测量该ROI内肿瘤通道中所有对象的总体积。</li>
	<li>利用“肿瘤体积”方案生成的新ROI，通过点击“测量”选项卡，选择“恢复方案”命令并选择“血管体积”方案，使用“血管体积”方案测量该ROI内血管通道中所有对象的总体积。</li>
	<li>将血管体积除以肿瘤体积，再将结果乘以100，得到移植物血管化百分比。</li>
	<li>对所有其他异种移植瘤重复步骤8.11至8.13。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该实验方案的第一步关键操作是肿瘤细胞的移植。必须将细胞注射到一个合适的位置，以确保异种移植瘤能够在胚胎中成功植入，同时避免引起胚胎水肿。若注射位置过于靠前，细胞可能移向心脏，阻塞血流并导致水肿；而注射位置过于靠后，则会导致异种移植瘤植入不良。为避免前部注射，建议将注射针从前向后穿过卵黄囊，使针尖在注射时朝向远离心脏的方向。为避免后部注射，应将细胞注入卵黄囊圆形区域前半部分的适当位置。此外，细胞必须注射在卵黄囊腹侧而非侧方，因为侧方位置较难观察和后续成像。当研究人员对该操作较为熟练后，每天可完成约200至300枚胚胎的异种移植。由于样品安装和成像耗时较长，血管生成反应的成像过程所需时间更多；使用标准激光扫描共聚焦显微镜，大约需要一小时才能完成15至20个异种移植样本的成像。
第二个关键步骤是使用3D图像分析软件测量移植物的血管化。需要通过肿瘤体积进行定量，因为通过显微注射难以获得大小一致的异种移植瘤。必须仔细校准软件协议的设置，并在所有实验中保持一致使用，以获得准确且无偏倚的定量结果。设定荧光强度的最低阈值（针对肿瘤体积和肿瘤血管体积）是该步骤的重要组成部分，因为它使方案能够正确区分...

血管生成是癌症的经典特征之一，也是抗癌治疗的靶点1,2。为了研究这一过程，已通过将哺乳动物肿瘤细胞植入小鼠等动物体内建立了癌症异种移植模型3。此外，还开发了斑马鱼异种移植模型，该模型将肿瘤细胞植入受精后2天（dpi）的斑马鱼体内，可导致斑马鱼血管迅速向异种移植物内生长4。
本方案描述了一种体内斑马鱼胚胎肿瘤异种移植模型，可对整个异种移植区域的血管生成反应进行精确定量。该方法使研究者能够在体内检测肿瘤血管生成反应背后的分子机制。斑马鱼的遗传可操作性使得宿主对血管生成的贡献可以被探究，而选择不同的肿瘤细胞系则可同时研究肿瘤自身对血管生成的作用5,6,7。此外，由于斑马鱼幼体对小分子具有通透性，因此可使用特定信号通路抑制剂，或通过药物文库筛选，以鉴定新型的肿瘤血管生成抑制剂8,9,10,11。
与其它哺乳动物异种移植模型相比，斑马鱼胚胎异种移植模型具有独特的优点。斑马鱼异种移植成本更低、操作更简便，可同时检测大量个体，且活细胞成像技术能够对细胞行为进行详细观察4。与其他体内模型需要数周时间才能观察到显著的血管生长不同，斑马鱼异种移植中的血管生成可在移植后24小时内即被观察到3,4。然而，胚胎斑马鱼缺乏适应性免疫系统，尽管这一特性有利于异种移植物的存活，但也意味着无法研究适应性免疫反应及其在肿瘤血管生成中的作用。此外，缺乏肿瘤间质细胞、无法进行原位移植，以及斑马鱼与哺乳动物细胞在培养温度上的差异，是该方法潜在的局限性。尽管如此，该模型适用于活体成像，并能精确量化血管生成反应，因此在研究调控肿瘤血管生成的细胞过程方面具有独特的优势。

<table><tbody><tr><td>空气压缩缸</td><td>BOC</td><td>011G</td><td>异种移植</td></tr><tr><td>B16-F1 细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>BD Matrigel LDEV-无（细胞外基质混合物）</td><td>Corning</td><td>356235</td><td>异种移植</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Warner Instruments</td><td>G100T-4</td><td>外径 = 1.00 mm，内径 = 0.78 mm，长度 = 10 cm，用于细胞注射</td></tr><tr><td>细胞培养皿，直径 35 mm</td><td>Thermofisher NZ</td><td>NUN153066</td><td>鱼类饲养</td></tr><tr><td>细胞培养皿，直径 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167-500EA</td><td>鱼类饲养</td></tr><tr><td>细胞培养瓶，75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>In Vitro Technologies</td><td>COR430641</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>CellTracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td>细胞标记，储存浓度（10 mM 溶于 DMSO），工作浓度（0.2 &amp;mu;M 溶于无血清培养基）</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>药物处理，细胞标记</td></tr><tr><td>E3 培养基（60 倍浓缩液，溶于 2 L 水中） 34.8 g NaCl&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 1.6 g KCl&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 5.8 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H2O&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 9.78 g MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H2O，用 NaOH 调节 pH 至 7.2</td><td>实验室自制 [1]</td><td></td><td>鱼类饲养</td></tr><tr><td>乙基-3-氨基苯甲酸甲酯甲磺酸盐（Tricaine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>异种移植，成像</td></tr><tr><td>滤芯吸头，1,000 &amp;mu;L</td><td>VWR</td><td>732-1491</td><td>多个步骤中使用</td></tr><tr><td>滤芯吸头，200 &amp;mu;L</td><td>VWR</td><td>732-1489</td><td>多个步骤中使用</td></tr><tr><td>滤芯吸头，10 &amp;mu;L</td><td>VWR</td><td>732-1487</td><td>多个步骤中使用</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>胚胎制备</td></tr><tr><td>胎牛血清（新西兰来源）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10091148</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>手套</td><td>任意商业品牌</td><td></td><td>多个步骤中使用</td></tr><tr><td>血细胞计数板（改进型 Neubauer 计数室）</td><td>HawksleyVet</td><td>AC1000</td><td>异种移植</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R 离心机</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>75004500</td><td>细胞培养，细胞标记</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>62249</td><td>细胞标记，储存浓度（1 mg/ml 溶于 DMSO），工作浓度（6 &amp;mu;g/ml 溶于无血清培养基）</td></tr><tr><td>低熔点超纯琼脂糖</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>16520050</td><td>成像</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9004 67 5</td><td>异种移植</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>鱼类饲养</td></tr><tr><td>Microloader 0.5-20 &amp;mu;L 加样吸头（用于填充微毛细管）</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>异种移植</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>任意商业品牌</td><td></td><td>多个步骤中使用</td></tr><tr><td>微电极拉制仪 P-87</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>异种移植</td></tr><tr><td>显微镜培养箱</td><td>Okolab</td><td></td><td>延时成像</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>任意商业品牌</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3516</td><td>异种移植</td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）-α</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12561056</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>MPPI-2 压力注射仪</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td></td><td>异种移植</td></tr><tr><td>Narishige 显微操作器</td><td>Narishige Group</td><td></td><td>异种移植</td></tr><tr><td>Nikon D Eclipse C1 共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>N-苯基硫脲（PTU）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>鱼类饲养</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>S1 移液器辅助器</td><td>Thermoscientific</td><td>9501</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>血清移液管，10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>血清移液管，25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>血清移液管，5 mL</td><td>Corning</td><td>4485</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>血清移液管，2 mL</td><td>Corning</td><td>4486</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Terumo 针头，22 G</td><td>Amtech</td><td>SH 182</td><td>鱼类饲养</td></tr><tr><td>组织培养箱</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>HeraCell 150i</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Tivozanib (AV951)</td><td>AVEO Pharmaceuticals</td><td></td><td>药物处理</td></tr><tr><td>移液管，3 mL</td><td>Mediray</td><td>RL200C</td><td>鱼类饲养</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies</td><td>T4049</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>鱼类饲养</td></tr><tr><td>Volocity 软件 (v6.3)</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td></td><td>图像分析</td></tr></tbody></table>

斑马鱼肿瘤异种移植模型中宿主血管生成反应的活体成像与定量分析

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

肿瘤血管生成是抗癌治疗的关键靶点，本方法旨在提供一种新的体内研究该过程的模型。通过将哺乳动物肿瘤细胞植入受精后两天的斑马鱼胚胎的卵黄周隙，随后在移植后最多两天的实验终点观察并测量血管生成反应的程度，从而建立斑马鱼异种移植模型。该方法的主要优势在于能够精确量化斑马鱼宿主对移植物的血管生成反应，从而深入分析参与该反应的分子机制以及宿主与肿瘤各自所起的作用。移植后的胚胎可接受多种处理，例如与潜在的抗血管生成药物共孵育，以研究抑制肿瘤血管生成的策略。此外，还可对血管生成反应进行活体成像，以观察更为动态的细胞过程。由于实验技术相对简便、斑马鱼维护成本低廉且实验周期短，该模型在开发调控肿瘤血管生成策略方面具有重要应用价值。

通过在接种后6、24和48小时对单个异种移植瘤进行成像，可计算不同时相点的血管生成反应，如图1A-C所示。在接种后24至48小时观察到最强的血管生成反应，移植物血管化水平在接种后约2天达到峰值（图1A-C）。从接种后20.75小时至46小时，典型B16-F1异种移植瘤血管生成反应的时间推移视频见补充视频1。该视频通过对按照本方案接种至2天龄kdrl:EGFP胚胎中的异种移植瘤进行成像生成。穿过异种移植瘤生长的血管形成扭曲的网络结构，血管尺寸与形态不规则，这是哺乳动物肿瘤中异常血管网络的典型特征20。本模型中的血管生成反应源于共同主静脉向异种移植瘤出芽的血管，而此前研究报道的血管来源为肠下静脉4。血管来源的差异是由于我们将异种移植瘤植入卵黄周腔...

该方法旨在通过将哺乳动物肿瘤细胞异种移植到血管带有荧光标记的斑马鱼胚胎中，建立体内肿瘤血管生成模型。通过成像观察异种移植的肿瘤及其相关血管，可定量评估血管生成反应。

肿瘤血管生成是抗癌治疗的关键靶点，本方法旨在提供一种新的体内模型以研究这一过程。

本方案描述了如何利用转基因斑马鱼幼鱼进行体内定量分析肿瘤异种移植的血管化。与以往技术相比，该技术的主要优势在于能够准确量化异种移植血管化水平的变化。关键步骤是确保将肿瘤细胞正确注射到斑马鱼幼鱼体内，以避免影响后续的成像和定量分析。用荧光染料标记B16-F1细胞并培养后，开始准备用于移植的胚胎。在35毫米培养皿中加入含2%甲基纤维素的E3溶液，加至培养皿体积的四分之一。使用移液管将约50个预先制备好的转基因胚胎转移至甲基纤维素中，同时尽量减少所带入的E3溶液体积。使用微毛细移液管尖端，将胚胎排列整齐，使其均呈垂直方向，头部朝上，尾部朝下，并使胚胎的左侧朝上。向预先制备的B16-F1细胞沉淀中加入50% ECM，制备成细胞与ECM比例为2:1的混合物。通过移液和搅拌充分混匀，并将混合物置于冰上保存。使用微量毛细移液管吸取 3 到 10 微升细胞。小心地将移液管尖端插入预先准备好的显微注射针中，然后将 B16-F1 基质混合物注入针尖末端。将针插入针头夹持器中，并将其倾斜至与培养皿成 45 度角。使用镊子折断针尖，形成一个足够大的孔，使细胞能够从针头中排出，而不会挤压细胞。打开连接到注射装置的加压空气气缸，然后将注射器短暂调至连续模式，持续不超过一秒，以将细胞推至针尖。将针头指向胚胎的卵黄囊，从腹侧方向穿刺进入卵黄囊，直至针尖穿出卵黄囊，并顶住胚胎腹侧、心脏后方的胚胎表皮。小心地将针尖略微向前推进，直至在表皮与卵黄囊膜之间形成一个小的空间。脉冲式注射，将部分细胞混合物注入该卵黄周隙中。在移植异种移植物时，仔细观察其大小、形状和位置，并相应调整脉冲次数和针头位置，以确保异种移植物正确植入。重复注射脉冲，直至向卵黄膜下腔注入500至800个细胞，形成明显的隆起，沿卵黄囊底部延伸至少一半距离。将针头从胚胎中取出。完成所有胚胎注射后，使用微毛细移液管尖端将所有胚胎推至一起，以便用尽可能少的甲基纤维素将它们移出。将胚胎转移至含有E3、PTU和亚甲蓝的复苏培养皿中。然后用移液器轻轻吹打E3溶液以洗涤胚胎，随后在34摄氏度条件下孵育。最后使用共聚焦显微镜对麻醉后的胚胎进行成像。使用适用于肿瘤细胞的激光通道确定成像体积，确保移植物两侧至少包含一个或两个光学切片。采用约五微米的切片间隔生成Z轴图像序列。使用双通道成像同时观察血管和肿瘤异种移植物。对一只幼鱼的肿瘤异种移植灶及血管进行成像，并对每只待成像的幼鱼重复上述步骤。为开始定量分析斑马鱼异种移植模型中的血管生成反应，将先前获得的肿瘤异种移植灶Z轴层扫共聚焦图像文件复制到3D图像分析软件中的新文件夹。为建立用于测量肿瘤异种移植体积的“肿瘤体积”分析方案，进入窗口顶部菜单中的“Measurement”（测量）选项卡，然后从显示的方案列表中，将名为“Find Objects”（识别对象）的方案拖动至标题为“Drag Tasks Here To Make Measurements”（将任务拖至此处以进行测量）的区域。在确保该方案设置为测量肿瘤通道中的对象后，将名为“Clip To ROIs”和“Make ROI From Population”的方案从方案列表中拖动到“在此处拖动任务以进行测量”区域，并确保这两个命令应用于“Find Objects”所识别的对象。在校准该方案的设置之前，前往窗口左上角“Mode”标签上方的下拉菜单，选择“Extended Focus”视图。通过点击最右侧窗格中每个通道标题下方的黑色圆圈，取消选中非肿瘤通道，仅保留肿瘤通道可见。然后使用窗口顶部的自由绘制工具，在整个肿瘤体积周围绘制一个感兴趣区域（ROI）。在图像下方的面板中，选择“摘要”标签，然后将显示选项设置为显示第二群组。进行校准时，在“查找对象”任务中，单击星号以打开设置窗口。通过调整强度来设置阈值，确定下限阈值，直到仅选中肿瘤细胞而排除背景荧光。通过将最小对象大小设为100立方微米，设定最小物体尺寸，以确保仅测量完整的细胞，而不包括较小的细胞碎片。点击顶部菜单中的“Measurements”选项卡，然后点击“Save Protocol”，将此方案保存为“Tumor Volume”。测量所有异种移植瘤时使用相同的设置。要测量与异种移植瘤相关的血管体积，请通过顶部菜单点击“测量”选项卡，然后点击“清除协议”，以创建新协议。将“查找对象”和“裁剪至感兴趣区域”任务拖动到标有“将任务拖至此处以进行此协议的测量”的区域中。确保第一个命令设置为测量血管通道中的对象，并且后续命令设置为应用于第一个命令所识别的对象。然后在最右侧窗格中取消选择非血管通道，仅保留可见的血管。以与之前所述的肿瘤体积方案类似的方式确定血管体积方案的设置，并将此方案保存为血管体积。清除当前方案，并在移植瘤周围绘制一个感兴趣区域（ROI），注意避免包含任何非肿瘤来源的自发荧光信号。为测量该 ROI 内肿瘤通道中所有对象的总体积，点击“测量”选项卡，选择“恢复方案”命令，选取“肿瘤体积”方案，然后点击“恢复”。利用“肿瘤体积”方案生成的新 ROI，再次点击“测量”选项卡并选择“恢复方案”命令，选择“血管体积”方案，然后点击“总和”行，以计算该 ROI 内血管通道中所有对象的总体积。将血管体积除以肿瘤体积，再将结果乘以 100，得到移植物血管化的百分比值。通过在移植后 6、24 和 48 小时对单个异种移植物进行成像，可计算不同时间点的血管生成反应，其中最大的血管生成反应出现在移植后 24 至 48 小时之间，移植物血管化的最高水平约在 48 小时达到。对植入受精后两天斑马鱼胚胎的 B16-F1 异种移植物进行共聚焦延时成像，显示 GFP 标记的血管穿过移植物生长，形成扭曲的网络结构，其血管大小和形态不规则，典型地反映了哺乳动物肿瘤中异常血管网络的特征。与在DMSO中孵育的对照异种移植瘤相比，在VEGFR抑制剂中孵育的异种移植瘤显示出显著的血管减少。在对照胚胎中，可见广泛的血管网络延伸至整个异种移植区域，这是植入B16-F1细胞后典型的血管生成反应。定量分析显示，与对照组相比，经VEGFR抑制剂处理的异种移植瘤其血管生成反应明显减弱。肿瘤通道显示在卵黄囊下方有一团经荧光标记的 B16-F1 细胞，而卵黄囊本身表现出自发荧光。因此，必须仔细围绕异种移植瘤绘制感兴趣区域（ROI），注意避免包含来自卵黄囊的任何自发荧光信号。肿瘤体积分析程序识别了 ROI 内所有的 B16-F1 细胞，测量其体积，并将 ROI 裁剪至这些细胞的体积范围。在此新的剪裁ROI中，肿瘤血管体积检测方案能够识别与B16-F1细胞团块相关的所有血管，并测量其体积。肿瘤体积和肿瘤血管体积检测方案所得数值可用于评估移植物血管化程度。斑马鱼具有良好的遗传可操作性和通透性，可用于研究肿瘤血管生成中的重要信号通路，也可作为筛选抗血管生成化合物的平台。

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Cancer Research

癌症研究

在斑马鱼肿瘤异种移植物中宿主血管反应的Vivo成像和定量

本视频介绍了一种将乳腺癌细胞显微注射到转基因斑马鱼胚胎卵周隙的方法。孵育后，我们在荧光显微镜下观察胚胎，以监测癌细胞的侵袭、播散和转移过程。...

zPDX-侵袭性分析：利用斑马鱼胚胎异种移植模型研究转移性癌细胞的侵袭行为

本视频介绍了利用斑马鱼异种移植模型评估体内肿瘤形成并研究治疗药物作用的方法。...

斑马鱼异种移植实验：一种评估治疗药物在斑马鱼体内对肿瘤发生抑制效果的方法

该方法利用斑马鱼胚胎高效检测癌细胞的血管侵袭能力。将荧光标记的癌细胞注射至发育中胚胎的心前窦或卵黄囊内，24至96小时后通过尾部区域的荧光显微镜观察，评估癌细胞的血管内侵及外渗情况。...

在斑马鱼（Danio Rerio）中检测癌细胞的血管侵袭能力

此处，我们描述了使用两种不同注射位点的异种移植斑马鱼模型， 即，...

胚胎斑马鱼中人乳腺癌细胞的侵袭行为

癌症细胞移植是研究癌症机制和治疗反应的重要工具。目前的技术依赖于免疫缺陷型动物。本文介绍一种将斑马鱼肿瘤细胞移植到免疫健全胚胎中的方法，用于长期分析肿瘤细胞行为 体内...

将斑马鱼儿童脑肿瘤移植到免疫健全宿主中以长期研究肿瘤细胞行为和药物反应

本方案描述了建立荷瘤小鼠模型，通过双荧光素酶成像实时监测肿瘤进展和血管生成的方法。...

双生物发光成像监测肿瘤进展与血管生成

斑马鱼异种移植模型可用于在体内微环境中对人源癌细胞进行高通量药物筛选和荧光成像。我们建立了一种工作流程，利用配备自动化荧光显微镜的成像系统，在斑马鱼中对患者来源的白血病样本进行大规模自动化药物筛选。...

斑马鱼中源自患者的原代肿瘤异种移植药物筛选

本文提供了一步一步的操作方案，并附有建立异种移植瘤的技巧，以及肿瘤行为分析、全组织免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导原则。...

斑马鱼幼鱼异种移植模型的建立及肿瘤行为分析

临床前模型旨在增进对癌症生物学的认识并预测治疗效果。本文描述了利用肿瘤组织碎片建立基于斑马鱼的患者来源异种移植模型（zPDXs）的方法。对zPDXs进行化疗处理，并通过检测移植组织中细胞的凋亡情况来评估其治疗效果。...

建立胰腺癌斑马鱼患者来源异种移植模型用于化疗敏感性测试

我们描述了一种将异种移植物移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的实验方案，该方案通过一种简单快速的分期方法进行了优化。注射后的分析包括检测异种移植细胞的存活情况以及通过流式细胞术评估疾病负荷。...

一种在透明斑马鱼胚胎中进行肿瘤异种移植分析的简单、快速且有效的方法

了解利用转基因斑马鱼幼虫进行肿瘤异种移植物血管化的活体定量检测方法。该技术通过荧光标记实现血管成像，可准确量化肿瘤诱导的血管生成水平，为癌症研究提供可靠的体内模型。

斑马鱼肿瘤异种移植模型中宿主血管生成反应的活体成像与定量分析

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